Visualisation de la fonction respiratoire mitochondriale utilisant Cytochrome C Oxydase / succinate déshydrogénase (COX / SDH) Double-histochimie étiquetage
23 novembre 2011
Le cytochrome c oxydase / sodium déshydrogénase (COX / SDH) double étiquetage méthode permet la visualisation directe de l'ADN mitochondrial des déficits enzymatiques respiratoires dans des coupes de tissus congelés frais. C'est une technique simple histochimiques et est utile dans les enquêtes sur les maladies mitochondriales, le vieillissement et les troubles liés au vieillissement.
L’objectif global de cette procédure est de permettre une visualisation directe des déficits en enzymes respiratoires mitochondriales dans des coupes de tissus fraîchement congelés. Ceci est accompli en collectant d’abord des coupes de cryostat dans l’organe d’intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer la chimie Cox Histo, qui est suivie de la chimie SDH Histo.
Enfin, les sections de tissu sont déshydratées, montées et le couvercle glissé. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l’ampleur du dysfonctionnement mitochondrial à travers la quantité de coloration bleue cellulaire. Hi.Today nous allons parler de la technique HISTOCHIMIQUE de double marquage Cox SCH.
Et bien que cette méthode puisse être appliquée pour étudier les maladies des mitochondries, elle peut également donner un aperçu du vieillissement et des troubles liés à l’âge. Après avoir retiré le cerveau d’un animal qui a été sacrifié conformément à un permis éthique, congelez-le rapidement sur de la glace sèche. Les tissus congelés peuvent être conservés à moins 80 degrés Celsius, enveloppés dans du papier d’aluminium jusqu’au moment de les sectionner.
Préparez le tissu pour la cryosection en plaçant le cerveau sur un mandrin de cryostat et en l’entourant d’un composé d’enrobage. Placez rapidement le mandrin dans le cryostat et collectez des sections de 14 microns à moins 21 degrés Celsius. Décongelez les sections sur les lames à l’aide d’un bloc chauffant, puis laissez les lames sécher à température ambiante pendant une heure.
Placez les lames dans une chambre de coloration des lames avec des bandes de papier humide. Étant donné que les temps de réaction sont importants dans ce test, il est recommandé de traiter un maximum de 10 lames par expérience sous un capot chimique. Préparez l’incubation, milieu contenant du dab et du cytochrome C dans du PBS et du vortex.
Ajouter rapidement deux microgrammes de CDE bovins au milieu et bien mélanger par vortex. Pour briser tous les grains de CDE encore en activité sous le capot, appliquez 150 à 200 microlitres de milieu d’incubation sur chaque lame à l’aide de la pointe de la pipette pour répartir uniformément sur toutes les sections. Incuber les lames pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.
Après 40 minutes, retirez le milieu d’incubation des lames. Lavez les lames quatre fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Après avoir lavé les lames, remettez-les dans la chambre de coloration des lames avec des bandes de papier humide travaillant sous un capot chimique.
Préparez la solution NBT dans le PBS en prenant soin de protéger le PMS du vortex léger, la solution applique rapidement 150 à 200 microlitres de la solution NBT sur chaque lame à l’aide de la pointe de la pipette pour répartir uniformément sur toutes les sections. Incuber les lames pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius après 40 minutes, retirer l’excès de solution des lames. Lavez les lames quatre fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois.
Déshydratez les lames pendant deux minutes chacune dans les concentrations séquentielles d’éthanol suivantes. 70 %70 %95 %95 % et 99,5 %Enfin, attendez 10 minutes par étape supplémentaire de 99,5 %. Placez les lames dans du xylène pendant 10 minutes, montez-les avec LAN et appliquez des lamelles.
Laissez les lames sécher pendant la nuit ou au moins une à deux heures dans un endroit ventilé ici. Sections de cerveau de type sauvage et vieillissement prématuré. MT. Les souris ayant des mutateurs d’ADN ont été marquées séquentiellement pour les activités COX et SDH.
L’activité normale de Cox, indiquée par la coloration brun foncé, est observée dans l’hippocampe des souris de type sauvage. Des déficiences en Cox indiquées par la coloration bleue ont été révélées dans l’hippocampe de souris mutatrices de l’ADN MT à 12 et 46 semaines. Il y a eu une nouvelle diminution de l’activité de Cox à l’âge de 46 semaines chez les souris mutatrices M-T-D-N-A, suggérant une exacerbation généralisée du dysfonctionnement de la chaîne respiratoire.
Des temps d’incubation inadéquats de 10 et 25 minutes ont permis de réduire le dépôt du produit de réaction de la noisette brune. Les temps d’incubation raccourcis ont permis la formation du produit final Foran bleu pendant l’incubation SDH, suggérant de manière trompeuse la présence de cellules présentant des déficiences en COX. Les lames pendant l’incubation de la COX ont également entraîné une formation et un dépôt inexacts du produit de réaction DAB.
Bien que les activités de Cox et de SDH puissent être marquées individuellement comme indiqué ici, le marquage séquentiel s’est avéré avantageux pour localiser les cellules présentant un dysfonctionnement mitochondrial. Un exemple de contrôle de spécificité pour les activités COX et SDH dans le cerveau d’une souris de type sauvage montre un marquage négatif. N’oubliez donc pas que travailler avec les produits chimiques dans le double étiquetage Cox SCH est le protocole chimique sont extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une tenue de laboratoire appropriée et d’un masque sous la cagoule chimique, ainsi que l’élimination du milieu d’incubation doivent être effectuées chaque fois que vous effectuez ce test.
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Aperçu
La méthode de double marquage cytochrome c oxydase/sodium déshydrogénase (COX/SDH) permet la visualisation des déficiences enzymatiques respiratoires mitochondriales dans des sections de tissus frais-congelés. Cette technique histochimique est particulièrement utile pour étudier les maladies mitochondriales et les troubles liés au vieillissement.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Recherche mitochondriale
Contexte
- Le dysfonctionnement mitochondrial est lié à diverses maladies.
- La compréhension des déficiences enzymatiques peut aider au diagnostic des troubles mitochondriaux.
- Les techniques histochimiques fournissent une visualisation directe de l'activité enzymatique.
- Les sections de tissus frais-congelés préservent l'architecture cellulaire.
Objectif de l'étude
- Visualiser les déficiences enzymatiques respiratoires mitochondriales.
- Investiguer le rôle du dysfonctionnement mitochondrial dans les maladies.
- Fournir une méthode simple pour les chercheurs.
Méthodes utilisées
- Collecte de sections cryostate à partir de l'organe d'intérêt.
- Réalisation de l'histochimie COX.
- Réalisation de l'histochimie SDH.
- Déshydratation, montage et recouvrement des sections de tissus.
Résultats principaux
- Les résultats indiquent le niveau de dysfonctionnement mitochondrial.
- La coloration bleue cellulaire est corrélée à l'activité enzymatique.
- La méthode permet une visualisation claire des déficiences enzymatiques.
- Les résultats peuvent contribuer à la compréhension du vieillissement et des troubles connexes.
Conclusions
- La méthode de double marquage COX/SDH est efficace pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial.
- Cette technique peut aider au diagnostic des maladies mitochondriales.
- Elle fournit des informations précieuses sur les changements mitochondriaux liés au vieillissement.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Mitochondrial respiratory function assessment is critical for target validation in neurodegenerative and age-related disease programs. The COX/SDH double-labeling histochemical method enables direct visualization of enzyme deficiencies, supporting mechanistic de-risking of mitochondrial targets. This approach provides predictive confidence in early discovery by linking mtDNA integrity to functional bioenergetics readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mtDNA-encoded COX activity to respiratory chain function.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct histochemical readout of enzyme activity in tissue sections.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue COX-deficient phenotypes in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline mitochondrial function.
- Operational Value: Delivers quantitative, spatially resolved enzyme activity data through DAB and NBT product localization.
- Platform Reuse: Enables scalable assessment of mitochondrial health across multiple organ systems using standardized histochemical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial dysfunction observed in aging and mtDNA mutator models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via consistent enzyme activity readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying respiratory chain dysfunction over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing functional mitochondrial readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing COX and SDH activity in defined brain regions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and dehydration steps ensuring reproducible staining.
- Analytics: Enables comparative condition analysis via quantitative blue and brown staining correlating with SDH and COX activity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent exacerbation of respiratory chain dysfunction in mutator mice.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable histochemical platform for mitochondrial assessment across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mitochondrial disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of enzyme activity visualization across sections.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in mitochondrial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on functional rescue of COX-deficient cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histochemistry and mitochondrial biology for accurate assay execution and interpretation.
- Depends on cryostat, incubation chambers, and chemical hoods for section preparation and reagent handling.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times, reagent concentrations, and washing protocols to avoid artifacts.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-neural tissues such as heart or liver.
- Includes practical limitations such as hazardous reagent handling (DAB, NBT, PMS) and the need for fresh-frozen tissue preservation.
