Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

L'objectif général de cette procédure est d'isoler l'ARN total de Pseudomonas aerogen récupéré à partir d'ECM murins. Cela est réalisé en récoltant d'abord les contenus luminaux séquels. Ensuite, l'ARN bactérien est isolé.

Ensuite, le traitement par D'S et la purification de l'ARN sont effectués. Enfin, l'ARN est quantifié et la pureté de l'isolat est vérifiée par analyseur bioanalytique et par analyse spectro-photométrique. En définitive, un ARN bactérien de qualité et de quantité suffisantes peut être obtenu pour une évaluation expérimentale ultérieure, telle que par QPCR, analyse, profilage de la transcription ou expériences de séquençage de l'ARN.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'extraction au triol, est qu'elle intègre plusieurs étapes de lyse dans des conditions d'extraction extrêmement rigoureuses utilisant de l'acide et du chloroforme, afin de garantir une ARN de haute qualité. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de lyse et d'extraction sont difficiles à maîtriser, les protocoles écrits omettant souvent de petits détails critiques pour la réussite. La procédure sera démontrée par Eduardo Lopez Medina, chercheur postdoctoral, et Megan Neubauer, gestionnaire du laboratoire, tous deux de mon laboratoire. Avant de commencer la récolte, IMSA nettoie un mortier en acier inoxydable dans un bain d'azote liquide.

Ensuite, après avoir euthanasié une souris C3 HHEN âgée de six à huit semaines et colonisée par Pseudomonas aerogen, placer l'animal en position dorsale sur une planche en polystyrène expansé et désinfecter l'abdomen avec de l'éthanol à 95 %. Ensuite, pratiquer une incision longitudinale médiane à travers la peau, du sternum au périnée. Puis écarter la peau et le péritoine afin d'exposer la cavité abdominale.

Prélève maintenant tout le cæcum à l’aide de pinces. Tiens le cæcum au-dessus du mortier en acier inoxydable, puis coupe les deux extrémités du cæcum avec des ciseaux de dissection. Remplis une pipette P1000 d’un millilitre de tampon Flush 8, puis insère la pointe dans l’extrémité proximale du cæcum.

Transférez le tampon flush huit et le contenu luminal de la sequel dans le mortier en acier inoxydable. Écrasez maintenant la sequel. Rincez le contenu huit avec un pilon stérile.

Ensuite, verser de l'éthanol dans un récipient contenant de la glace sèche et placer un tube conique en polypropylène de 50 millilitres dans le bain d'éthanol et de glace sèche. Transférer le contenu congelé broyé du séquelles luminal dans le tube conique et conserver le tube à moins 80 degrés Celsius. Cette série d'étapes constitue la partie la plus délicate de la procédure.

Étant donné la nature complexe des matériaux prélevés à partir du caecum MI, des extractions répétées au filoforme froid sont absolument nécessaires afin d'obtenir une séparation acceptable ; entre trois et cinq extractions peuvent être requises avant que l'interface étendue entre les phases aqueuse et organique ne soit éliminée. Transférez un volume de phénol acide chloroforme dans un tube à centrifuge Oak Ridge de 50 millilitres. Fermez hermétiquement le bouchon avec du parafilm, puis faites tiédir le tube dans un bain-marie à 65 degrés Celsius.

Placer un demi-volume de tampon de lyse dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres, puis faire bouillir le tampon pendant cinq minutes. Après avoir retiré le contenu luminal Sequel de la congélation à moins 80 degrés Celsius, réchauffer brièvement le tube en le frottant énergiquement entre les mains, puis ajouter le tampon de lyse bouillant au tube. Agiter le mélange pour homogénéiser la solution de contenu luminal SQL dans le tampon de lyse.

Faites bouillir le tampon de lyse et le contenu luminal de SQL pendant cinq minutes. Avec des vortexages périodiques, ouvrez le tube de centrifugeuse Oak Ridge contenant la solution de phénol-chloroforme et transférez l'échantillon de lyse de SQL dans le tube. Refermez ensuite le bouchon avec du perfil et replacez le tube dans le bain d'eau à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, en agitant le tube toutes les deux minutes.

Lavez l'échantillon à 2 500 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube à centrifuger Oak Ridge de 50 millilitres, en évitant toute trace de l'interface blanche. Ajoutez alors un volume équivalent de phénol acide chloroforme dans le nouveau tube.

Fermer le bouchon avec du ruban adhésif Parafilm et bien mélanger le contenu en vortexant le tube à grande vitesse. Continuer à centrifuger l'échantillon et transférer la phase aqueuse dans un tube de centrifugation. Si le volume de la phase aqueuse supérieure devient trop faible, il peut être transféré dans un tube de plus petit diamètre.

Poursuivez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’interface blanche visible entre les phases aqueuse et organique. Une fois l’interface blanche disparue, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un tube centrifuge neuf. Ajoutez ensuite un volume égal de chloroforme, d’alcool isoamylique dans le tube, fermez le bouchon et mélangez bien le contenu par vortexage.

Ensuite, après une nouvelle centrifugation de l'échantillon, transférez la phase aqueuse dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres et ajoutez un volume équivalent d'isopropanol. Incubez ensuite la solution à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures ou toute la nuit. Après l'incubation de l'échantillon, centrifugez le tube pendant 45 minutes.

Après avoir identifié le culot de consistance gélatineuse au fond du tube, retirez le surnageant. Lavez ensuite le culot avec un millilitre d'éthanol glacé à 70 % en vortexant le tube, puis centrifugez l'échantillon à 10 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, retirez le surnageant et retournez le tube pour laisser sécher le culot à l'air libre à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, resuspendre le culot d'ARN dans 200 microlitres d'eau exempte d'ARN. Tout d'abord, ajouter 20 microlitres de tampon 10 x turbo ADN et 2 microlitres de turbo ADNase dans le tube microfuge et mélanger délicatement la solution. Incuber ensuite le tube à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis ajouter 20 microlitres de réactif d'inactivation de l'ADN resuspendu dans le tube et bien mélanger.

Incubez maintenant le tube pendant cinq minutes supplémentaires à température ambiante avec des mélanges occasionnels. Ensuite, centrifugez le culot dans une microcentrifugeuse à 10 000 × g pendant 1,5 minute, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube microfuge. Ajoutez un volume de phénol acide chloroforme froid au culot, puis mélangez soigneusement la solution par vortexage pendant une minute.

Après centrifugation de la solution pendant deux minutes à 12 500 ×g, transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajoutez un volume de chloroforme alcool isoamylique. Mélangez ensuite la solution par vortex, puis centrifugez à nouveau la solution dans les mêmes conditions. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube microfuge.

Ensuite, ajouter un dixième de volume d'acétate de sodium à trois molaire et 2,5 volumes d'éthanol glacé à 100 %. Vortexer le tube pour homogénéiser. Incuber l'échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, après une centrifugation à 12 000 ×g pendant 30 minutes à 4 °C, retirez le surnageant. Finalement, lavez le culot avec un millilitre d'éthanol glacé à 70 %. Enlevez le surnageant et laissez sécher le culot à l'air pendant 10 minutes.

Ensuite, resuspendre le culot dans 100 microlitres d'eau exempte de RNAs. L'Agilent Bioanalyzer est une plateforme fondée sur la microfluidique permettant la détermination de la taille, la quantification et le contrôle de qualité de l'ADN, de l'ARN, des protéines et des cellules, et utilise une métrique d'intégrité de l'ARN appelée nombre d'intégrité de l'ARN ou RIN. L'extrait obtenu avec ce protocole présente deux rapports 28S/18S compris entre 1,7 et 2,0, et des valeurs de RIN supérieures ou égales à 7,0.

Un exemple d'électrophérogramme de l'ARN bactérien obtenu avec un bioanalyseur Agilent est montré ici à gauche, et une image de type gel de Pseudomonas arosa récupéré à partir du contenu intestinal de souris est montrée ici à droite. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la PCR quantitative ou le séquençage de l'ARN peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le profilage précis de l'expression génique.