Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

L’objectif global de cette procédure est d’isoler l’ARN total de Pseudomonas aerogen récupéré à partir d’ECM murins. Ceci est accompli en récoltant d’abord le contenu luminal de la suite. Ensuite, l’ARN bactérien est isolé.

Ensuite, le traitement D’S et le nettoyage de l’ARN sont effectués. Enfin, l’ARN est quantifié et la pureté de l’isolat est vérifiée par bioanalyseur et analyse spectrophotométrique. En fin de compte, il est possible d’obtenir de l’ARN bactérien de qualité et en quantité suffisantes pour une évaluation expérimentale ultérieure, par exemple par QPCR, analyse, profilage de transcription ou expériences de séquence d’ARN.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’extraction au triol est qu’elle intègre plusieurs étapes de lyse dans des étapes d’extraction au chloroforme acide femelle extrêmement rigoureuses pour garantir une RN de haute qualité. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de lyse et d’extraction sont difficiles à apprendre car les protocoles écrits émettent de petits détails qui sont essentiels au succès. Eduardo Lopez Medina, boursier postdoctoral, et Megan Neubauer, directrice du laboratoire, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Avant de commencer les vendanges, IMSA nettoie le mortier d’acier inoxydable dans un bain d’azote liquide.

Ensuite, après l’euthanasie d’une souris C3 HHEN de six à huit semaines colonisée par un pseudomonas aerogène, placez l’animal en position couchée sur une planche de polystyrène et arrosez l’abdomen avec de l’éthanol à 95 %. Ensuite, faites une incision longitudinale médiane à travers la peau du sternum au périnée. Ensuite, tirez la peau et le péritoine vers l’arrière et exposez la cavité abdominale.

Réséquez maintenant tout le caecum à l’aide d’une pince. Tenez le secum sur le mortier en acier inoxydable, puis coupez les deux extrémités du secum avec des ciseaux de dissection. Remplissez une pointe de pipette P 1000 avec un millilitre de tampon sequel flush eight, puis insérez la pointe dans l’extrémité proximale du caecum

Rincez le tampon de chasse d’eau huit et le contenu luminal de la suite dans le mortier en acier inoxydable. Maintenant, broyez la suite. Rincer huit contenus à l’aide d’un pilon stérile.

Versez ensuite de l’éthanol dans un récipient de glace carbonique et placez un tube conique en polypropylène de 50 millilitres dans le bain d’éthanol de glace carbonique. Transférez le contenu luminal de la suite congelé moulu dans le tube conique et stockez le tube à moins 80 degrés Celsius. Cette prochaine série d’étapes est la plus délicate de la procédure.

Étant donné la nature complexe des matériaux enregistrés à partir du caecum MI, les extractions répétées de filoforme à froid sont absolument nécessaires pour obtenir une inégalité et une intégrité acceptables entre trois et cinq extractions peuvent être nécessaires avant que la large interface entre les phases aquas et organique ne soit éliminée. Transférez un volume de phénol chloroforme acide dans un tube à centrifuger Oak Ridge de 50 millilitres. Fixez le capuchon avec du parfum, puis réchauffez le tube dans un bain-marie à 65 degrés Celsius.

Placez un demi-volume de tampon de lyse dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres, puis faites bouillir le tampon pendant cinq minutes. Après avoir retiré le contenu luminal de la suite du stockage à moins 80 degrés Celsius, réchauffez brièvement le tube avec un frottement vif à la main, puis ajoutez le tampon de lyse bouillante dans le tube. Agitez le mélange pour homogénéiser la solution de contenu luminal SQL du tampon de lyse.

Faites bouillir le tampon de lyse et le contenu luminal SQL pendant cinq minutes. Avec des vortex périodiques, descellez le tube de centrifugation d’Oak Ridge contenant la solution de phénol chloroforme et transférez l’échantillon de lyse du contenu SQL dans le tube. Ensuite, refermez le capuchon avec du perfil et remettez le tube dans le bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour envoyer un SMS au tube toutes les deux minutes.

Laver l’échantillon à 2 500 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un tube à centrifuger Oak Ridge frais de 50 millilitres, en évitant toute interface blanche. Ajoutez ensuite un volume égal de phénol chloroforme acide dans le nouveau tube.

Scellez le bouchon avec du perfil et mélangez bien le contenu en faisant tourbillonner le tube à grande vitesse. Continuez à centrifuger l’échantillon et à transférer la phase aqueuse dans le tube de centrifugation. Si le volume de la phase aqueuse supérieure devient trop petit, il peut être transféré dans un tube de plus petit diamètre.

Continuez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’interface blanche visible entre les phases aqueuse et organique. Lorsque l’interface blanche a disparu, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un tube à centrifuger frais. Ajoutez ensuite un volume égal de chloroforme, d’alcool isoamylique dans le tube, fermez le bouchon et mélangez bien le contenu par vortex.

Ensuite, après avoir centrifugé à nouveau l’échantillon, transférez la phase aqueuse dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres et ajoutez un volume égal d’isopropanol. Ensuite, incubez la solution à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures ou toute la nuit. Après avoir incubé l’échantillon, centrifugez le tube pendant 45 minutes.

Après avoir identifié la pastille semblable à un gel au fond du tube, retirez le surnageant. Lavez maintenant la pastille avec un millilitre de glace froide, à 70 % d’éthanol en faisant tourbillonner le tube, puis centrifugez l’échantillon à 10 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, retirez le surnageant et retournez le tube pour laisser sécher la pastille à l’air libre à température ambiante pendant 10 minutes.

Remettez ensuite en suspension la pastille d’ARN dans 200 microlitres d’eau libre d’ARN. Tout d’abord, ajoutez 20 microlitres de 10 x turbo, tampon d’ADN et deux microlitres d’ADN turbo dans le tube de micro-fuge et mélangez doucement la solution. Ensuite, incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis ajoutez 20 microlitres de réactif d’inactivation de l’ADN en suspension dans le tube et mélangez.

Maintenant, incubez le tube pendant cinq minutes de plus à température ambiante en mélangeant de temps en temps. Ensuite, faites tourner la pastille dans une micro-centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 1,5 minute, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-fuge. Ajoutez un volume de phénol chloroforme acide froid à la pastille, puis mélangez soigneusement la solution en tourbillonnant pendant une minute.

Après avoir centrifuge la solution pendant deux minutes à 12 500 fois G, transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajoutez un volume d’alcool isoamylique de forme chloroforme. Mélangez ensuite la solution par vortex après avoir centrifugé à nouveau la solution, dans les mêmes conditions. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube de micro-fuge.

Ajoutez ensuite 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires et 2,5 volumes de froid glacé, 100 % d’éthanol. Vortex le tube à mélanger. Incuber l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, après avoir centrifugé à 12 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant. Enfin, lavez le granulé avec un millilitre de glace froide, 70 % d’éthanol. Retirez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre pendant 10 minutes.

Remettez ensuite en suspension la pastille dans 100 microlitres d’eau exempte d’ARN. Le bioanalyseur Agilent est une plate-forme basée sur la microfluidique pour le dimensionnement, la quantification et le contrôle de la qualité des protéines et des cellules D-N-A-R-R-A et utilise une métrique d’intégrité de l’ARN connue sous le nom de numéro d’intégrité de l’ARN ou R-I-N-R-N-A. L’extraction avec ce protocole produit deux rapports de 60 à deux rapports de 80 allant de 1,7 à 2,0 et des valeurs RIN supérieures ou égales à 7,0.

Un exemple d’électrophérogramme de l’ARN bactérien est montré ici à gauche, et une image gélatineuse de Pseudomonas arosa récupérée à partir du contenu SQL murin est montrée ici à droite. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative ou le séquençage de l’ARN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le profilage affiné de l’expression génique