Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la capacité d'une molécule à induire la chimiotaxie et d'autres réponses migratoires chez des cellules de la crête neurale tronculaire explantées. Cette évaluation est réalisée en isolant d'abord les tubes neuraux au niveau du tronc, d'une longueur comprise approximativement entre huit et quinze somites, puis en cultivant chaque tube neural pendant la nuit sur des lamelles séparées recouvertes de fibronectine, afin de permettre l'émigration des cellules de la crête neurale. Ensuite, on sélectionne une culture optimale de cellules de la crête neurale.

Le tube neural est retiré de la culture et le lamelle contenant la culture est monté sur une chambre de Zigmund modifiée de manière à ce que le bord le plus droit de la culture soit parallèle au vecteur du gradient moléculaire à appliquer à travers la culture. La troisième étape consiste à générer un gradient moléculaire à travers la culture, puis à filmer la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long du bord droit précédemment sélectionné de la culture. L'étape finale consiste à suivre et analyser la migration des cellules de la crête neurale périphérique positionnées le long du bord sélectionné de la culture à l'aide du logiciel Image J.

En fin de compte, on peut déterminer si la molécule sélectionnée est capable de modifier la directionnalité cellulaire ou d'autres caractéristiques migratoires, telles que la vitesse, grâce à l'analyse des données de trajectoire cellulaire obtenues. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de chambre de Boyden, réside dans son très faible coût. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la migration de cellules déjà polarisées situées en périphérie de cultures primaires d'explant à l'aide d'une imagerie en time-lapse.

Après avoir incubé les œufs de poulet pendant 56 heures à 38 degrés Celsius, retirez les œufs de l’incubateur, vaporisez-les légèrement avec de l’éthanol à 70 %, puis laissez-les sécher pendant que les œufs s’assèchent. Remplissez une boîte de Petri en plastique stérile avec de la solution de Ringer pour poulet et stérilisez une plaque en verre par rayonnement UV. Remplissez une boîte de Petri en verre de cinq centimètres avec des affichages de dis.

À présent, cassez les œufs et videz-les dans le plateau en verre stérilisé par rayonnement UV. Extrayez chaque embryon de son vitellus en découpant d'abord autour des îlots sanguins de l'embryon à l'aide de ciseaux courbes. Puis, à l’aide de pinces non effilées, saisissez l’embryon par sa membrane extra-embryonnaire et déposez-le dans la boîte de Pétri préparée contenant du liquide de Ringer.

Ensuite, sélectionnez environ neuf embryons se situant entre les stades hamburger et Hamilton 15 à 17. À l’aide d’une aiguille au tungstène, sectionnez tous les tissus embryonnaires situés en avant du somite 10 et retirez tous les tissus embryonnaires cordaux à partir d’environ le cinquième somite le plus récemment formé. Puis, découpez les membranes extra-embryonnaires jusqu’à environ deux millimètres de l’embryon.

Placer les troncs embryonnaires isolés dans des bacs et les incuber pendant une heure et 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, pendant que les troncs embryonnaires sont en incubation. Préparer six lamelles pour la culture. Commencer par les rincer dans de l'éthanol à 70 % et les laisser sécher.

Ensuite, à l’aide d’un marqueur de laboratoire, dessinez un cercle au centre de chaque lamelette d’un diamètre d’environ un centimètre, afin d’identifier ultérieurement la couche de connexion fibrineuse sur la même face de chaque lamelette. Écrivez un mot ou un symbole asymétrique à l’extérieur du cercle tracé pour faciliter l’identification de la face supérieure et inférieure de la lamelette. Placez maintenant chaque lamelette dans une boîte stérile séparée de 40 par 10 millimètres, côté étiqueté vers le bas, et laissez la boîte ouverte sous une lampe UV germicide pendant 10 minutes.

Ensuite, appliquer 60 microlitres de fibronectine sur la surface non marquée du lamelle à l'intérieur du cercle d'un centimètre, en veillant à ce que toute la surface du cercle soit recouverte. Placer les boîtes dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la période d'incubation, aspirer soigneusement la fibronectine de chaque lamelle.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de milieu de culture sur la zone recouverte de FI nin. La lame, puis incubez de nouveau les lames jusqu'à ce que les tubes neuronaux aient été isolés. Pendant l'incubation des lames, remplissez une boîte de Pétri en verre de cinq centimètres avec du milieu L 15.

Transférez maintenant tous les troncs embryonnaires incubés dans la boîte de Pétri préparée. Utilisez des pinces fines ainsi qu'une lame et une aiguille pointues pour disséquer le tube neural en incisant soigneusement le long de la limite entre le tube neural et les somites à l’aide de l’aiguille. Retirez les lamelles de l’incubateur.

Sélectionnez six des tubes neuraux les plus longs et les plus droits, puis, à l’aide d’une micropipette dont la pointe a été préalablement chargée avec du milieu de culture, transférez un tube neural sur chacun de six lamelles. Veillez à ce que chaque tube neural se trouve bien dans la zone recouverte de fibronectine de sa lamelle respective à l’aide d’une micropipette, puis incubez toute la nuit à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, placez au moins deux millilitres de milieu de culture sans sérum dans un tube conique stérile de 15 millilitres.

Laisser le bouchon légèrement desserré pendant l'incubation du tube toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l'ajustement du pH du milieu. Après la culture nocturne, sélectionner les trois meilleures cultures de cellules de la crête neurale présentant chacune au moins un long bord droit parmi les trois cultures. En choisir une pour charger la première chambre, et replacer les autres dans l'incubateur pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, à l’aide de notre coton-tige, appliquez une fine couche uniforme de vaseline sur les zones entourant les réservoirs et le pont d’une chambre de Sigmund modifiée. Puis, à l’aide d’une aiguille en tungstène, retirez délicatement le tube neural du lamelle contenant la culture de cellules de la crête neurale sélectionnée, en laissant les cellules de la crête neurale environnantes attachées au revêtement de fibronectine. Marquez la boîte avec un marqueur de laboratoire afin de vous souvenir de l’orientation du bord le plus droit de la culture de cellules de la crête neurale.

Ensuite, déposez quelques gouttes du milieu pré-incubé sur le pont de la chambre de Zigmund modifiée. Puis, prenez le couvre-objet avec une pince fine. Essuyez le bord du couvre-objet contre une serviette Kim pour éliminer la majeure partie de l'ancien milieu de culture, puis placez immédiatement le couvre-objet sur la chambre de Zigmund modifiée de sorte que la bordure droite des cellules de la crête neurale à filmer soit centrée sur la longueur du pont et approximativement perpendiculaire au bord du réservoir du pont.

À l’aide d’un microscope inversé, déplacer la bordure droite des cellules de la crête neurale vers le côté du pont le plus proche du réservoir. Cela permettra de contenir le chémotact supposé et d’aligner plus précisément la bordure droite des cellules de la crête neurale perpendiculairement à la bordure du réservoir du pont. Appuyer maintenant soigneusement mais fermement sur la lamelle, en la glissant dans la gelée de pétrole présente dans la chambre de Zigmund, en veillant à ce qu’elle soit parfaitement scellée sur la chambre.

Ensuite, appliquez une couche supplémentaire de vaseline le long du bord de la lame couvre-objet afin d'assurer une étanchéité optimale. Ajustez à nouveau l'angle de la limite des cellules de la crête neurale pour corriger tout déplacement survenu pendant le processus d'installation sur le support. Chargez ensuite environ 300 microlitres de milieu pré-incubé dans une seringue d'un millilitre.

Avec une aiguille de 25 gauge sur 1,5 pouce attachée. Injecter le milieu dans le réservoir qui ne contiendra aucun chémotactique jusqu'à ce qu'il soit plein. Faire attention à ne pas générer de bulles dans le réservoir.

Ensuite, boucher le réservoir des deux côtés avec une quantité suffisante de vaseline avant de charger le réservoir suivant. Charger maintenant une deuxième seringue avec 300 microlitres de milieu pré-incubé contenant le chimiotactique souhaité. Puis injecter le milieu dans le réservoir opposé de la même manière.

De nouveau, sceller soigneusement le réservoir avec de la vaseline. Incuber ensuite la chambre Sigmund chargée à 37 degrés Celsius pendant une heure avant l'enregistrement. Puis, pendant l'incubation à environ 37 degrés Celsius, filmer la bordure la plus droite de la culture de cellules de la crête neurale pendant trois heures à des intervalles de 92 secondes ; pour les témoins, charger des chambres Zigmund contenant chacune des deux autres meilleures cultures de cellules de la crête neurale, comme vient d'être indiqué.

Utiliser les traitements témoins appropriés pour remplir les réservoirs et amorcer le pont. Utiliser le plugin de suivi manuel ImageJ pour suivre la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long de la bordure droite de la culture. Utiliser le plugin d'analyse de la chimiotaxie et de la migration pour analyser divers paramètres des trajectoires migratoires obtenues.

Des cultures de cellules de la crête neurale du tronc allongées ont été préparées par une culture nocturne de tubes neuronaux et de cultures de cellules de la crête neurale résultantes, en sélectionnant celles présentant au moins un bord long et droit pour l'expérimentation. Le bord droit le plus long d'une culture sélectionnée a ensuite été positionné perpendiculairement au bord du réservoir-pont, et donc parallèlement au vecteur du gradient appliqué ultérieurement. Le réservoir ne contenant pas le chémoadjuvant présumé, représenté ici par un signe moins, a d'abord été chargé puis scellé.

Ensuite, l'autre réservoir a été chargé avec l'agent chimiotactique présumé, représenté par un signe plus, et les cellules de la crête neurale périphérique situées le long de la frontière précédemment sélectionnée ont été scellées puis observées et suivies à l'aide du module de suivi manuel pour ImageJ. De nombreuses caractéristiques migratoires en réponse au gradient appliqué peuvent être évaluées à partir des données de suivi obtenues, comme illustré par ce graphique. Par exemple, un indice de chimiotaxie peut être calculé en divisant le déplacement de la cellule le long de l'axe des x par la distance totale qu'elle a parcourue. La réponse attractive de toutes les cellules suivies est illustrée par le tracé des trajectoires cellulaires présenté ici.

Chaque piste rouge représente la trajectoire d'une cellule ayant migré vers le réservoir chargé d'un chimioattractant suspecté. Sur cette figure, on observe un nombre nettement plus élevé de pistes rouges par rapport aux pistes noires. Dans un autre test, la capacité d'une chambre sigmund modifiée à maintenir un gradient moléculaire a été validée.

Un conjugué Alexa Fluor 488 IGM a été ajouté au réservoir gauche et l'intensité de fluorescence à travers le pont a été mesurée à différents moments. Le gradient est resté stable pendant au moins 26 heures. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser la capacité d'une molécule à induire la chimiotaxie et d'autres comportements migratoires dans des cultures de cellules de la crête neurale trunkale explantées, en utilisant un essai modifié de chambre de Zigmund.