Name: Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez une méthode économique pour analyser la migration des cellules de la crête neurale tronculaire en utilisant une chambre de Zigmund modifiée. Cette technique permet de distinguer la chimiotaxie des autres influences migratoires.

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Nous remercions chaleureusement Lino Kim, Steve Guzman et Ujit Satyarthi pour leur assistance technique durant le développement de cette méthode. Myron Hawthorne, Richard Spengel et Roberto Rojas ont usiné les chambres utilisées ici et ont fourni une assistance technique essentielle. Notamment, Roberto Rojas a réalisé la Figure 4. Nous sommes également reconnaissants envers Scott Fraser pour ses précieux conseils avant le développement du test de chimiotaxie décrit ci-dessus. Ce travail a été partiellement soutenu par une subvention NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 attribuée à MEdB, ainsi que par une aide provenant du programme de soutien aux thèses de troisième cycle de la CSU, campus de Northridge, attribuée à CW.

1. Jour 1: Isolement des tubes du tronc de neurones pour une nuit de culture sur des lamelles <ol><li> Oeufs chiches Incuber 56 h à 38 ° C. Retirer les oeufs de l'incubation, les pulvériser légèrement à l'éthanol 70%, puis laissez-les sécher. Casser les oeufs s'ouvrent sur un plateau en verre stérilisée aux UV. </li><li> Extrait chaque embryon de son jaune d'oeuf et le placer dans chiches Ringer. Pour ce faire, la première coupe autour de ses îles de sang avec des ciseaux courbes, puis, avec une pince émoussée, choisissez l'embryon par sa membrane extra-embryonnaires et le placer dans une boîte de Pétri stérile en plastique contenant une solution de Ringer chiches. </li><li> Isoler le tronc de chaque embryon par le parage des membranes extra-embryonnaires l'excédent ainsi que crânienne, vagal, et sacrée niveaux axiaux à l'aide d'une aiguille de tungstène (Fig. 1). D'abord, sélectionnez environ 9 embryons qui sont entre les stades HH15-17 11. Pour les stades HH15 et plus, les axes cerveau et du cerveau postérieur forment un angle aigu et donc la tête semble incliner caudalement. Astade de HH17, le bourgeon caudal est présent et s'incline face ventrale, mais ne contient pas encore somites. Avec une aiguille de tungstène, coupez les membranes extra-embryonnaires à environ 2 mm de l'embryon et de couper toute les tissus embryonnaires antérieure à somite 10. Également supprimer tous les tissus embryonnaires à partir de caudale autour de la cinquième plus somite nouvellement formé. </li><li> Placez les troncs isolés embryonnaire dans dispase (0,24 U / ml de DMEM) et les incuber pendant 1 h 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2. Une fois les troncs d'incubation commence, commencer à préparer six lamelles (CS) pour des explants NT culture (01/05 au 01/08 étapes). </li><li> Rincez 6 CS d'éthanol à 70% (dilué dans de l'eau stérile ultrapure), puis laissez-les sécher. L'utilisation d'un marqueur de laboratoire, dessiner un cercle au centre de chaque CS qui est d'environ 1 cm de diamètre (ce cercle va vous aider à identifier plus tard, où une couche de fibronectine a été appliqué). Sur la même face de chaque CS, écrire le mot «être» (ou tout autre mot ou asymétrique de forme) en dehors du cercle tracé (ce qui aidera à yous déterminer si le côté marqué du CS est orientée vers le haut ou vers le bas). </li><li> Placez chaque CS dans un 40 x 10 séparés plat mm stérile avec la surface marquée vers le bas et permettre le plat de s'asseoir ouverte sous un lampe UV germicide pendant 10 min. </li><li> Appliquer 60 fibronectine ul (FN, 10 pg / ml DMEM) à la surface banalisée de la CS, tout en veillant toute la zone au sein du cercle de 1 cm est recouvert. Placez les plats à incuber à 37 ° C pendant 30 min puis aspirer délicatement la fibronectine de chaque CS. </li><li> Ajouter 250 ul "culture" moyen [DMEM avec L-glutamine (2 mM), pénicilline (100U/ml), streptomycine (100 mcg / ml), et 8% de sérum bovin fœtal (FBS)] pour la zone FN-enduite le CS. Placez les boîtes contenant chacune CS à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à ce que le SNRC ont été isolés. </li><li> Transfert de tous les troncs d'embryons incubés à un plat de 5 cm en verre de Pétri contenant du milieu L15 et commencer à disséquer chaque NT à l'aide de pinces fines et une aiguille de tungstène (Fig. 1). Carefully tranche le long de la frontière de la NT et les somites avec une aiguille de tungstène forte tout en étant prudents de ne pas endommager le NT. Il est souvent plus facile de commencer à isoler chaque NT à partir de l'extrémité caudale-la plupart du tronc. </li><li> Sélectionnez 6 de la plus longue et la plus droite NTs à la culture durant la nuit (SNRC entre environ 8 et 15 somites longues sont recommandées). En utilisant une pointe de micropipette apprêtée avec un milieu de culture, le transfert de chacune des 6 nuits à ses propres préalablement préparé CS (de 1,5 à 1,8 étapes). Soyez sûr que le NT ne reste flottant à la surface. Si le NT est flottant, au goutte à goutte milieu sur lui jusqu'à ce qu'il coule à l'aide d'une micropipette. </li><li> Placez chaque plat à 37 ° C et CO 2 5% durant la nuit. Soyez prudent de s'assurer que chaque NT est dans la zone FN enduits de ses respectives CS immédiatement avant de placer le plat dans l'incubateur (en utilisant le cercle tracé à l'étape 1.5 comme référence). Une micropipette peut être utilisé afin de mieux ajuster la position de chaque NT si nécessaire. </li><li> Place àau moins 2 ml de milieu de culture (sans sérum) dans un tube à centrifuger stériles de 15 ml et incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Laissez le bouchon légèrement dévissé pour permettre le pH du milieu pour ajuster la nuit. Pré-incuber le milieu est importante pour aider à prévenir la formation de bulles dans votre chambre, ce qui peut perturber l'établissement d'un gradient moléculaire. Ces «pré-incubées" milieu doit être utilisé dans toutes les étapes futures. Lorsqu'il n'est pas utilisé, ce milieu doit être en incubation à 37 ° C. </li></ol> 2. Jour 2: Chargement de la chambre modifiés Zigmond et time-lapse d'analyse de la migration cellulaire <ol><li> Sur les 6 nuits en culture, sélectionnez les 3 cultures mieux adaptées à l'analyse. Généralement, les cultures de la CCN qui ont au moins un long bord droit doit être sélectionné (figure 2A). Les 3 meilleures cultures seront utilisés pour charger et film 3 chambres modifiés Zigmond toute la journée, chacun avec un traitement différent. Sur les trois cultures, choisissez l'une des loading la première chambre et remet les autres dans l'incubateur pour une utilisation ultérieure. </li><li> En utilisant un coton-tige, appliquez une fine couche de gelée de pétrole entourant les réservoirs et le pont d'une seule chambre modifiés Zigmond. </li><li> Avec une aiguille de tungstène, retirez délicatement le NT à partir de la CS, tout en laissant le CNC entourant attaché à la surface de la CS. Marquer le plat avec un stylo à retenir l'orientation des droites bord de la culture de la CCN. </li><li> Placez quelques gouttes de milieu préincubées sur le pont. Ramassez la CS avec une pince fine, tamponnez le bord de la CS contre un Kimwipe pour enlever la plupart du milieu de culture ancienne, puis placez immédiatement le CS sur la chambre modifiés Zigmond sorte que le bord droit de la culture d'être filmé est centré sur la longueur du pont et à peu près perpendiculaire à la frontière du pont-réservoir (Fig. 2A, B). </li><li> En utilisant un microscope inversé, déplacer la frontière droite de la CCN pour être sur le côté du pont le plus proche de ee réservoir qui contiendra les chemotactant suspectée (figure 2B; pour les contrôles de cela correspondra à réservoir est chargé selon seconde). En outre, plus finement aligner le bord droit de la culture à être perpendiculaire à la frontière du pont-réservoir. </li><li> Soigneusement, mais solidement appuyer sur le CS en la gelée de pétrole présents sur la chambre Zigmond, en s'assurant qu'il est complètement étanche à la chambre, puis placez pétroliers supplémentaires de gelée le long du bord de la CS pour mieux garantir qu'il sera hermétique. Beaux-ajuster l'angle de la frontière de la CCN à nouveau pour corriger tout mouvement pendant le processus d'étanchéité. </li><li> Charger le réservoir qui ne contient pas le chemotactant soupçonnés première (figure 2B). Le faire par le chargement d'une seringue de 1 ml (25 G x 1,5 po aiguille attachée) avec environ 300 moyennes préincubées ul et injecter le support dans le réservoir jusqu'à complet (tout en faisant attention de ne pas générer de bulles dans le réservoir). Branchez le réservoir sur les deux côtés avec un suffmontant icient de gelée de pétrole avant de charger le réservoir suivant. </li><li> Répétez l'étape 2.7, sauf que cette fois en utilisant un milieu contenant du préincubées chemotactant candidat. Il est essentiel lors de la génération d'un gradient moléculaire à travers la culture de toujours charger le réservoir contenant la molécule à tester après le chargement du réservoir manque la molécule testée. </li><li> Placez la chambre chargée Zigmond à 37 ° C à incuber pendant 1 h avant le tournage. Image les plus droites frontières de la culture de la CCN pour 3 h à 90 s intervalles tout en incubation à environ 37 ° C (Fig. 2A, B). Avant de créer n'importe quel film, assurez-vous d'aligner la caméra de sorte que le bord des images d'être obtenus sont alignés avec et toucher le bord du pont qui borde le dernier réservoir chargé (Fig. 2B, panneau supérieur; zone en pointillés représente idéale position pour l'imagerie). Cela facilitera plus tard, un logiciel d'analyse par la standardisation de la directionnalité du gradient moléculaire appliquée et thélectronique à distance à partir du réservoir filmé dans chaque film produit. </li><li> Pour les contrôles, répétez les étapes 2.2 à 2.9 pour chacune des deux cultures de la CCN d'autres sélectionnés (à l'étape 2.1), mais remplir chaque réservoir avec un milieu approprié. Pour un type de contrôle de remplir les deux réservoirs de moyenne préincubées ne contenant pas la molécule à tester. Pour un traitement de contrôle de second, le premier le pont avec quelques gouttes de milieu préincubées contenant le chemotactant suspectée avant de monter le CS. Ensuite, chargez les deux réservoirs avec le même milieu contenant le chemotactant suspectée. </li><li> Utilisez ImageJ (NIH) suivi manuel <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / piste / track.html)</a> et le chimiotactisme et la Migration Tool v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / applications / ap_chemo.html)</a> plugins pour suivre la migration des CNC périphérique le long de la frontière droite de la culture jUST imagé et d'analyser les différents paramètres des trajectoires migratoires obtenus (Fig. 2B-C). </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Un échantillon de trajectoires de cellules à partir d'un film où le tronc de nombreux CNC ont été sensibles à un facteur chimiotactique candidat en utilisant la technique ci-dessus est montré (Fig. 2D). La plupart des cellules dans cet exemple d'une réponse positive affiché un net mouvement jusqu'à le gradient chimiotactique (comme indiqué en rouge). Données de trajectoire peut être utilisé pour analyser d'autres propriétés de la migration des cellules aussi bien. Afin d'évaluer visuellement un gradient appliqué dans une chambre modifiés Zigmond, une Alexa Fluor 488 IgM conjugué (MW ~ 900 kDa) a été chargé dans le second réservoir d'une chambre modifiés Zigmond (à environ 40 pg / ml H 2 O). Un gradient a été établi par 1 h et encore un peu présent après 26 h, mais fortement diminuée par 50 h (fig. 3). Si la molécule à tester est plus petit, alors le gradient appliquée wiLL se dégradent plus vite que ce qui est montré. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Explantation du tronc au niveau du SNRC pour la culture de la nuit sur ​​la fibronectine revêtement des lamelles. Parce que le tronc CNC se décoller de la dorsale NT situé à côté de somites 8-28, ce segment de la NT est isolée par microdissection et cultivées pendant une nuit sur un CS fibronectine revêtement pour permettre l'émigration des CNC à partir de l'explant NT. NTs isolés qui sont entre 8-15 somites long et relativement droites sont les mieux adaptées pour la culture du jour au lendemain comme ils ont tendance à donner plus aux cultures CCN frontières droites. Régions du tube neural qui donnent lieu à d'autres neurones niveaux de crête axiale sont présentés dans une police plus petite. s, somites. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Méthode d'évaluation de la migration des CNC tronc explantésen utilisant une chambre modifiés Zigmond. (A) Allongée tronc cultures CCN sont préparés par mise en culture de nuit de NTS et résultante des cultures de la CCN avec au moins une longue frontière droite sont sélectionnés pour l'expérimentation. La plus longue frontière droite d'une culture choisie est alors positionné perpendiculairement à la frontière du pont-réservoir, et donc parallèle au vecteur du gradient de l'avenir appliqué. (B) Après le beau-ajustement de la position de la culture de la CCN sur la chambre Zigmond et d'étanchéité la lamelle de la chambre, la chambre est chargée. Lors du test de chimiotactisme, le réservoir qui ne contient pas le chemotactant suspectée (-) est chargé en premier et scellé. Ensuite, l'autre réservoir est chargé avec la chemotactant suspectée (+) et scellé. CNC périphérique long de la frontière préalablement sélectionnés peuvent ensuite être visualisés et suivis en utilisant le plugin Manuel de suivi pour ImageJ (panneau inférieur). (C) de nombreuses caractéristiques migratoires en réponsele gradient appliqué peut être évaluée à partir des données de suivi. Par exemple, un indice de chimiotactisme peut être calculée en divisant le déplacement d'une cellule le long de l'axe x par la distance totale qu'il a migré. (D) Un exemple d'une réponse intéressante est représentée par une parcelle de trajectoire cellule initialement générées par le chimiotactisme et la migration Outil pour le plugin ImageJ. Le point de départ de chaque trajectoire est fixé à l'origine (0,0). Notez combien de cellules migrent vers le centre source.The chimiotactique de la masse de toutes les cellules à leur position finale (croix bleue; toutes les cellules pondération égale) est aussi proche de la source chimiotactique. CNC, les cellules de la crête neurale, pistes rouges, les cellules qui ont migré vers le réservoir chargé avec un chimioattractive soupçonné; pistes noires, les cellules qui ont migré loin; (+), une concentration plus élevée chemotactant; (-), concentration inférieure chemotactant. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> profils d'intensité à travers le pont d'une chambre modifiés Zigmond à différents moments après l'ajout d'un Alexa Fluor 488 conjugué IgM. La chambre a été chargé d'une manière semblable à celle décrite dans le protocole avec les principales exceptions que l'eau préincubé (au lieu de moyennes préincubées) a été utilisé pour diluer l'anticorps à 40 pg / ml, et de petites poches d'air ont été présentes aux extrémités du pont (loin de la tranche où les profils d'intensité prises ci-dessus où). Au départ, aucun gradient était présent dans la plupart des ponts. Par une pente ha a été créé et est resté présent à travers à 26 h. En 50 h la présence de la pente était incompatible à différents domaines de la passerelle, et lorsqu'il est présent, la raideur de la pente a été grandement diminuée. Tous les profils ont été générés à partir d'un morceau identique sur le pont (d'un pont-réservoir frontière à l'autre) en utilisant le logiciel AxioVision 4.6. Notez que même lorsque l'airpoches étaient présents, le gradient n'a pas été perturbé. Haute, de haute intensité; faible, de faible intensité; axe des x, distance à travers toute la largeur du pont (2 mm); (+), d'un réservoir chargé de l'Alexa Fluor 488 conjugué IgM; (-), le réservoir n'est pas chargé avec le conjugué. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Zigmond modification des spécifications de chambre. Montré est un diagramme de la chambre modifiés Zigmond utilisé ici avec son cahier des dimensions (± 0,2 mm). Les mesures peuvent être modérément ajustées afin de correspondre à des préférences individuelles. Protocole complémentaire: Fabrication d'une Chambre de modification Zigmond S'il vous plaît se référer à la figure 4 comme une référence pour le protocole ci-dessous: <ol><li> Achat d'une feuille de 3 / 16 "polies acryliques épais (4,45 mm d'épaisseur réelle). </li><li> En utilisant une scie circulaire, couper les blancs de chambre surdimensionné pour l'dimensions approximatives de 33,25 mm x 64,57 mm. Cela permet à 3,175 mm matériels supplémentaires pour l'usinage. </li><li> Réglez la vierge de chambre sur un étau. Avec une fraiseuse et un 6,35 mm (1 / 4 ") bit fraise en bout, la finition d'usinage sur les côtés de la chambre de leurs dimensions exactes: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Position de la chambre de vide sur la machine de fraisage et de localiser le centre de la vierge le long des axes x et y avec un palpeur, puis à zéro l'emplacement du centre. </li><li> Acquérir la hauteur de chambre (axe z) en touchant le petit moulin à terme à la surface supérieure et zéro de la hauteur. </li><li> L'utilisation d'un mm 3,91 (0,154 ") bit fraise en bout, de compenser les bits 3,03 mm le long de l'axe des x (sens positif) pour le premier réservoir. Commencez d'usinage dans la chambre à une profondeur de 2,84 mm tout en se déplaçant le long de l'axe y (sens positif) à 7,62 mm (0,300 "), puis traverser à 7,62 mm (0,300") dans le sens opposé (négatif) en direction d'un réservoir complet longueur de 15,24 mm (0,600 "). Offsetle bit à 3,03 mm (0,119 ") le long de l'axe x (sens négatif) et répétez le même processus pour le deuxième réservoir. </li><li> Position de la chambre sur son bord et percer un trou avec un 1,09 mm (0,043 po) foret sur la fin de chaque réservoir (4 au total) qui relie l'extrémité du réservoir sur le côté de la chambre pour le chargement de support lors de l'expérimentation. </li><li> Faire tremper la chambre bien dans l'eau chaude savonneuse pour aider à éliminer tous les contaminants chimiques. </li><li> Trempez et rincez la chambre bien à l'eau bidistillée pour enlever tout le savon. Les chambres sont maintenant prêts à utiliser comme décrit ci-dessus. </li></ol>

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La recherche sur la chimiotaxie des cellules de la crête neurale (NCC) du tronc s'est révélée difficile pour plusieurs raisons. Les NCC du tronc constituent une population hétérogène de cellules souches qui se différencient si elles sont cultivées sur le long terme ; par conséquent, ces cellules doivent être obtenues par explantation primaire du tube neural (NT) au niveau du tronc. Les méthodes classiques d'étude de la réponse chimiotactique de populations cellulaires homogènes in vitro sont difficiles à appliqu...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Omega Scientific</td><td>DM-22</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine</td><td>Omega Scientific</td><td>PS-20</td><td>Concentration stock 100X</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60</td><td>Concentration stock 100X</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td>Lot n° 105247 (ou un autre lot comparable)</td></tr><tr><td>Chambre de Zigmond modifiée</td><td>Fabriquée maison</td><td>N/A</td><td>Volume du réservoir : ~ 160 &amp;mu;l par réservoir ; pour d'autres spécifications, voir la Figure 4 et le protocole de fabrication supplémentaire</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire</td><td>Denville</td><td>T6040</td><td>40 x 10 mm</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Stock 10X préparé en diluant 1 mg de FN dans 1 ml d'H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O et 9 ml de DMEM</td></tr><tr><td>Couvre-objets</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>Prénettoyés ; 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Milieu L15</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30525.02</td><td></td></tr><tr><td>Substance grasse (vaseline)</td><td>Comforts</td><td>011110794642</td><td>100 %</td></tr><tr><td>Tube de centrifugation</td><td>Biologix</td><td>10-9152</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Cell Systems</td><td>4Z0-850</td><td>Concentration stock 100X</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD</td><td>309602</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>BD</td><td>305127</td><td>25 G x 1,5 po</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-IgM</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td>Stock à 2 mg/ml ; 7 moles de colorant par mole d'IgM</td></tr><tr><td>Pinces anatomiques</td><td>FST</td><td>Divers</td><td>Dumont n°5 ou 55 ; extrémité droite ; en acier inoxydable ou en titane</td></tr><tr><td>Aiguille en tungstène</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fabriquée maison ; insérée dans un porte-épingle</td></tr><tr><td>Pinces émoussées</td><td>Tiemann</td><td>160-18</td><td>Utilisées pour transférer les embryons du jaune d'œuf vers la solution de Ringer</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Protocole supplémentaire : Fabrication d'une chambre de Zigmond modifiée&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Veuillez vous référer à la Figure 4 comme référence pour le protocole ci-dessous :&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Acheter une feuille d'acrylique poli de 3/16&quot; d'épaisseur (4,45 mm d'épaisseur réelle).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;À l'aide d'une scie à table, découper des ébauches de chambre de dimensions supérieures aux dimensions finales de 33,25 mm x 64,57 mm. Cela permet d'avoir 3,175 mm de matériau supplémentaire pour l'usinage.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Placer l'ébauche de chambre dans une mâchoire de serrage. À l'aide d'une fraiseuse et d'une fraise de 6,35 mm (1/4&quot;), usiner finalement les côtés de la chambre à leurs dimensions exactes : 30,07 mm x 61,39 mm.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Positionner l'ébauche de chambre sur la fraiseuse et localiser le centre de l'ébauche selon les axes x et y à l'aide d'un chercheur de bords ; puis mettre à zéro la position du centre.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Obtenir la hauteur de la chambre (axe z) en amenant la fraise en contact avec la surface supérieure, puis mettre à zéro la hauteur.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;À l'aide d'une fraise de 3,91 mm (0,154&quot;), décaler la fraise de 3,03 mm selon l'axe x (direction positive) pour le premier réservoir. Commencer à usiner la chambre sur une profondeur de 2,84 mm tout en se déplaçant selon l'axe y (direction positive) sur 7,62 mm (0,300&quot;), puis traverser sur 7,62 mm (0,300&quot;) dans la direction opposée (négative) pour obtenir une longueur totale de réservoir de 15,24 mm (0,600&quot;). Décaler ensuite la fraise de 3,03 mm (0,119&quot;) selon l'axe x (direction négative) et répéter le même processus pour le second réservoir.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Positionner la chambre sur son bord et percer un trou à l'aide d'un foret de 1,09 mm (0,043 po) à chaque extrémité des réservoirs (4 au total), afin de relier l'extrémité de chaque réservoir au côté de la chambre pour le chargement du milieu pendant l'expérimentation.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Imbiber soigneusement la chambre dans de l'eau chaude savonneuse afin d'éliminer les contaminants chimiques éventuels.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Imbiber et rincer soigneusement la chambre à l'eau distillée doublement distillée pour éliminer tout résidu de savon. Les chambres sont désormais prêtes à être utilisées comme décrit précédemment.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

analyse de la migration cellulaire tronc crête neurale en utilisant une modification zigmond chambre assay

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de passage de cellules présentes dans le développement des vertébrés qui émigrent à partir du tube neural dorsal (NT) après avoir subi une 1,2 transition épithélio-mésenchymateuses. Après EMT, CNC migrer de grandes distances le long des voies stéréotypés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent leurs objectifs. CNC se différencier en un vaste éventail de types de cellules, y compris les neurones, cellules gliales, les mélanocytes et les cellules chromaffines 1-3. La capacité du CNC à atteindre et à reconnaître leurs emplacements cible appropriée est fondamentale pour la formation appropriée de toutes les structures contenant le tronc de la CCN composants dérivés 3. Élucider les mécanismes d&#39;orientation pour le tronc de la CCN de migration a donc été un sujet de grande importance. Plusieurs molécules ont été démontrés pour guider la CCN migrations 4. Par exemple, les CNC du tronc sont connus pour être repoussés par des signaux de guidage négatifs tels que Semaphorin, Ephrine et les ligands fente 5-8. Cependant, ne pasjusqu&#39;à récemment toute chimiotactiques du CNC du tronc été identifiés 9. Conventionnel dans les approches in vitro pour étudier le comportement chimiotactique de cellules adhérentes mieux travailler avec immortalisé, de façon homogène les cellules distribuées, mais sont plus difficiles à appliquer à certaines cultures primaires de cellules souches qui n&#39;ont pas d&#39;abord une distribution homogène et rapide de différencier (comme CNC). Une approche pour homogénéiser la répartition de la CNE du tronc pour les études de chimiotactisme est d&#39;isoler les CNC du tronc de l&#39;enseignement primaire des cultures d&#39;explants NT, puis soulevez et replate qu&#39;ils soient près de 100% de confluence. Cependant, cette approche nécessite plaquage des quantités substantielles de temps et d&#39;effort pour explant suffisamment de cellules, est rude, et distribue des CCN du tronc d&#39;une manière différente à celle trouvée dans des conditions in vivo. Nous rapportons ici une approche in vitro, qui est en mesure d&#39;évaluer la chimiotaxie et d&#39;autres réponses migratoires des CNC tronc sans requirindistribution de ga cellulaire homogène. Cette technique utilise imagerie time-lapse du primaire, imperturbable CNC tronc intérieur d&#39;une chambre modifiés Zigmond (une chambre standard de Zigmond est décrit ailleurs 10). En exposant CNC tronc à la périphérie de la culture à un gradient de chemotactant qui est perpendiculaire à leur directivité naturelle prédit, des altérations de la polarité migratoires induits par le gradient chemotactant appliquée peut être détecté. Cette technique est peu coûteuse, nécessite la mise en culture d&#39;explants NT seulement deux pour le traitement de reproduire, de levage évite de cellules dures (telles que la trypsine), laisse les CNC malle dans une distribution plus semblable à des conditions in vivo, réduit la quantité de temps entre l&#39;explantation et l&#39;expérimentation (ce qui réduit probablement le risque de différenciation), et permet time-lapse d&#39;évaluation des caractéristiques de nombreux migrateurs.

Une approche pour analyser la migration de cellules issues d'explants (cellules de la crête neurale trunkale) est décrite. Cette méthode est peu coûteuse, douce et capable de distinguer la chimiotaxie à la fois de la chimokinèse et des autres influences sur la polarité migratoire, telles que celles provenant des interactions entre cellules au sein de la culture primaire de cellules de la crête neurale trunkale.

Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire transitoire présente lors du développement des vertébrés, qui émigrent du tube neural (TN) dorsal après...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la capacité d'une molécule à induire la chimiotaxie et d'autres réponses migratoires chez des cellules de la crête neurale tronculaire explantées. Cette évaluation est réalisée en isolant d'abord les tubes neuraux au niveau du tronc, d'une longueur comprise approximativement entre huit et quinze somites, puis en cultivant chaque tube neural pendant la nuit sur des lamelles séparées recouvertes de fibronectine, afin de permettre l'émigration des cellules de la crête neurale. Ensuite, on sélectionne une culture optimale de cellules de la crête neurale.Le tube neural est retiré de la culture et le lamelle contenant la culture est monté sur une chambre de Zigmund modifiée de manière à ce que le bord le plus droit de la culture soit parallèle au vecteur du gradient moléculaire à appliquer à travers la culture. La troisième étape consiste à générer un gradient moléculaire à travers la culture, puis à filmer la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long du bord droit précédemment sélectionné de la culture. L'étape finale consiste à suivre et analyser la migration des cellules de la crête neurale périphérique positionnées le long du bord sélectionné de la culture à l'aide du logiciel Image J.En fin de compte, on peut déterminer si la molécule sélectionnée est capable de modifier la directionnalité cellulaire ou d'autres caractéristiques migratoires, telles que la vitesse, grâce à l'analyse des données de trajectoire cellulaire obtenues. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de chambre de Boyden, réside dans son très faible coût. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la migration de cellules déjà polarisées situées en périphérie de cultures primaires d'explant à l'aide d'une imagerie en time-lapse.Après avoir incubé les œufs de poulet pendant 56 heures à 38 degrés Celsius, retirez les œufs de l’incubateur, vaporisez-les légèrement avec de l’éthanol à 70 %, puis laissez-les sécher pendant que les œufs s’assèchent. Remplissez une boîte de Petri en plastique stérile avec de la solution de Ringer pour poulet et stérilisez une plaque en verre par rayonnement UV. Remplissez une boîte de Petri en verre de cinq centimètres avec des affichages de dis.À présent, cassez les œufs et videz-les dans le plateau en verre stérilisé par rayonnement UV. Extrayez chaque embryon de son vitellus en découpant d'abord autour des îlots sanguins de l'embryon à l'aide de ciseaux courbes. Puis, à l’aide de pinces non effilées, saisissez l’embryon par sa membrane extra-embryonnaire et déposez-le dans la boîte de Pétri préparée contenant du liquide de Ringer.Ensuite, sélectionnez environ neuf embryons se situant entre les stades hamburger et Hamilton 15 à 17. À l’aide d’une aiguille au tungstène, sectionnez tous les tissus embryonnaires situés en avant du somite 10 et retirez tous les tissus embryonnaires cordaux à partir d’environ le cinquième somite le plus récemment formé. Puis, découpez les membranes extra-embryonnaires jusqu’à environ deux millimètres de l’embryon.Placer les troncs embryonnaires isolés dans des bacs et les incuber pendant une heure et 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, pendant que les troncs embryonnaires sont en incubation. Préparer six lamelles pour la culture. Commencer par les rincer dans de l'éthanol à 70 % et les laisser sécher.Ensuite, à l’aide d’un marqueur de laboratoire, dessinez un cercle au centre de chaque lamelette d’un diamètre d’environ un centimètre, afin d’identifier ultérieurement la couche de connexion fibrineuse sur la même face de chaque lamelette. Écrivez un mot ou un symbole asymétrique à l’extérieur du cercle tracé pour faciliter l’identification de la face supérieure et inférieure de la lamelette. Placez maintenant chaque lamelette dans une boîte stérile séparée de 40 par 10 millimètres, côté étiqueté vers le bas, et laissez la boîte ouverte sous une lampe UV germicide pendant 10 minutes.Ensuite, appliquer 60 microlitres de fibronectine sur la surface non marquée du lamelle à l'intérieur du cercle d'un centimètre, en veillant à ce que toute la surface du cercle soit recouverte. Placer les boîtes dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la période d'incubation, aspirer soigneusement la fibronectine de chaque lamelle.Ensuite, ajoutez 250 microlitres de milieu de culture sur la zone recouverte de FI nin. La lame, puis incubez de nouveau les lames jusqu'à ce que les tubes neuronaux aient été isolés. Pendant l'incubation des lames, remplissez une boîte de Pétri en verre de cinq centimètres avec du milieu L 15.Transférez maintenant tous les troncs embryonnaires incubés dans la boîte de Pétri préparée. Utilisez des pinces fines ainsi qu'une lame et une aiguille pointues pour disséquer le tube neural en incisant soigneusement le long de la limite entre le tube neural et les somites à l’aide de l’aiguille. Retirez les lamelles de l’incubateur.Sélectionnez six des tubes neuraux les plus longs et les plus droits, puis, à l’aide d’une micropipette dont la pointe a été préalablement chargée avec du milieu de culture, transférez un tube neural sur chacun de six lamelles. Veillez à ce que chaque tube neural se trouve bien dans la zone recouverte de fibronectine de sa lamelle respective à l’aide d’une micropipette, puis incubez toute la nuit à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, placez au moins deux millilitres de milieu de culture sans sérum dans un tube conique stérile de 15 millilitres.Laisser le bouchon légèrement desserré pendant l'incubation du tube toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l'ajustement du pH du milieu. Après la culture nocturne, sélectionner les trois meilleures cultures de cellules de la crête neurale présentant chacune au moins un long bord droit parmi les trois cultures. En choisir une pour charger la première chambre, et replacer les autres dans l'incubateur pour une utilisation ultérieure.Ensuite, à l’aide de notre coton-tige, appliquez une fine couche uniforme de vaseline sur les zones entourant les réservoirs et le pont d’une chambre de Sigmund modifiée. Puis, à l’aide d’une aiguille en tungstène, retirez délicatement le tube neural du lamelle contenant la culture de cellules de la crête neurale sélectionnée, en laissant les cellules de la crête neurale environnantes attachées au revêtement de fibronectine. Marquez la boîte avec un marqueur de laboratoire afin de vous souvenir de l’orientation du bord le plus droit de la culture de cellules de la crête neurale.Ensuite, déposez quelques gouttes du milieu pré-incubé sur le pont de la chambre de Zigmund modifiée. Puis, prenez le couvre-objet avec une pince fine. Essuyez le bord du couvre-objet contre une serviette Kim pour éliminer la majeure partie de l'ancien milieu de culture, puis placez immédiatement le couvre-objet sur la chambre de Zigmund modifiée de sorte que la bordure droite des cellules de la crête neurale à filmer soit centrée sur la longueur du pont et approximativement perpendiculaire au bord du réservoir du pont.À l’aide d’un microscope inversé, déplacer la bordure droite des cellules de la crête neurale vers le côté du pont le plus proche du réservoir. Cela permettra de contenir le chémotact supposé et d’aligner plus précisément la bordure droite des cellules de la crête neurale perpendiculairement à la bordure du réservoir du pont. Appuyer maintenant soigneusement mais fermement sur la lamelle, en la glissant dans la gelée de pétrole présente dans la chambre de Zigmund, en veillant à ce qu’elle soit parfaitement scellée sur la chambre.Ensuite, appliquez une couche supplémentaire de vaseline le long du bord de la lame couvre-objet afin d'assurer une étanchéité optimale. Ajustez à nouveau l'angle de la limite des cellules de la crête neurale pour corriger tout déplacement survenu pendant le processus d'installation sur le support. Chargez ensuite environ 300 microlitres de milieu pré-incubé dans une seringue d'un millilitre.Avec une aiguille de 25 gauge sur 1,5 pouce attachée. Injecter le milieu dans le réservoir qui ne contiendra aucun chémotactique jusqu'à ce qu'il soit plein. Faire attention à ne pas générer de bulles dans le réservoir.Ensuite, boucher le réservoir des deux côtés avec une quantité suffisante de vaseline avant de charger le réservoir suivant. Charger maintenant une deuxième seringue avec 300 microlitres de milieu pré-incubé contenant le chimiotactique souhaité. Puis injecter le milieu dans le réservoir opposé de la même manière.De nouveau, sceller soigneusement le réservoir avec de la vaseline. Incuber ensuite la chambre Sigmund chargée à 37 degrés Celsius pendant une heure avant l'enregistrement. Puis, pendant l'incubation à environ 37 degrés Celsius, filmer la bordure la plus droite de la culture de cellules de la crête neurale pendant trois heures à des intervalles de 92 secondes ; pour les témoins, charger des chambres Zigmund contenant chacune des deux autres meilleures cultures de cellules de la crête neurale, comme vient d'être indiqué.Utiliser les traitements témoins appropriés pour remplir les réservoirs et amorcer le pont. Utiliser le plugin de suivi manuel ImageJ pour suivre la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long de la bordure droite de la culture. Utiliser le plugin d'analyse de la chimiotaxie et de la migration pour analyser divers paramètres des trajectoires migratoires obtenues.Des cultures de cellules de la crête neurale du tronc allongées ont été préparées par une culture nocturne de tubes neuronaux et de cultures de cellules de la crête neurale résultantes, en sélectionnant celles présentant au moins un bord long et droit pour l'expérimentation. Le bord droit le plus long d'une culture sélectionnée a ensuite été positionné perpendiculairement au bord du réservoir-pont, et donc parallèlement au vecteur du gradient appliqué ultérieurement. Le réservoir ne contenant pas le chémoadjuvant présumé, représenté ici par un signe moins, a d'abord été chargé puis scellé.Ensuite, l'autre réservoir a été chargé avec l'agent chimiotactique présumé, représenté par un signe plus, et les cellules de la crête neurale périphérique situées le long de la frontière précédemment sélectionnée ont été scellées puis observées et suivies à l'aide du module de suivi manuel pour ImageJ. De nombreuses caractéristiques migratoires en réponse au gradient appliqué peuvent être évaluées à partir des données de suivi obtenues, comme illustré par ce graphique. Par exemple, un indice de chimiotaxie peut être calculé en divisant le déplacement de la cellule le long de l'axe des x par la distance totale qu'elle a parcourue. La réponse attractive de toutes les cellules suivies est illustrée par le tracé des trajectoires cellulaires présenté ici.Chaque piste rouge représente la trajectoire d'une cellule ayant migré vers le réservoir chargé d'un chimioattractant suspecté. Sur cette figure, on observe un nombre nettement plus élevé de pistes rouges par rapport aux pistes noires. Dans un autre test, la capacité d'une chambre sigmund modifiée à maintenir un gradient moléculaire a été validée.Un conjugué Alexa Fluor 488 IGM a été ajouté au réservoir gauche et l'intensité de fluorescence à travers le pont a été mesurée à différents moments. Le gradient est resté stable pendant au moins 26 heures. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser la capacité d'une molécule à induire la chimiotaxie et d'autres comportements migratoires dans des cultures de cellules de la crête neurale trunkale explantées, en utilisant un essai modifié de chambre de Zigmund.

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