Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la capacité d’une molécule à provoquer une chimiotaxie et d’autres réponses migratoires dans les cellules explantées de la crête neurale du tronc. Ceci est accompli en isolant d’abord les tubes neuraux au niveau du tronc entre environ huit et 15 somites de longueur et en cultivant chacun des tubes neuraux pendant la nuit sur des lamelles séparées enrobées de fibronectine pour permettre l’émigration de la crête neurale. Ensuite, une culture optimale de la crête neurale est sélectionnée.

Le tube neural est retiré de la culture et la lamelle contenant la culture est montée sur une chambre en zigmund modifiée de sorte que le bord le plus droit de la culture soit parallèle au vecteur du gradient moléculaire à appliquer sur la culture. La troisième étape consiste à générer un gradient moléculaire à travers la culture, puis à filmer la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long de la bordure droite de la culture préalablement sélectionnée. La dernière étape consiste à suivre et à analyser la migration des cellules de la crête neurale périphérique positionnées le long du bord sélectionné de la culture à l’aide du logiciel Image J.

En fin de compte, il est possible de déterminer si la molécule sélectionnée peut modifier la directionnalité cellulaire ou d’autres caractéristiques migratoires telles que la vitesse grâce à l’analyse des données de trajectoire cellulaire obtenues. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme le test en chambre de Boyden, est qu’elle est à très faible coût. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la migration de cellules déjà polarisées à la périphérie des cultures primaires explan à l’aide de l’imagerie time-lapse.

Après avoir incubé des œufs de poussin pendant 56 heures à 38 degrés Celsius, retirez les œufs de l’incubateur, vaporisez-les légèrement avec de l’éthanol à 70 %, puis laissez sécher les œufs pendant que les œufs sèchent. Remplissez une boîte de Pétri en plastique stérile avec la solution de sonnerie de poussin et stérilisez un plateau en verre aux UV. Remplissez une boîte de Pétri en verre de cinq centimètres avec des présentoirs.

Ouvrez maintenant les œufs dans le plateau en verre stérilisé aux UV. Extrayez chaque embryon de son jaune en coupant d’abord autour des îlots sanguins de l’embryon avec des ciseaux incurvés. Ensuite, avec une pince émoussée, saisissez l’embryon par sa membrane embryonnaire supplémentaire et placez l’embryon dans la boîte de Pétri préparée contenant des sonneurs.

Ensuite, sélectionnez environ neuf embryons qui se trouvent entre hamburger et Hamilton. Les stades 15 à 17 avec une aiguille en tungstène coupent tous les tissus embryonnaires antérieurs à l’acarien 10 et enlèvent tous les tissus embryonnaires cordaux à partir d’environ le cinquième plus récemment formé. Ensuite, coupez les membranes embryonnaires supplémentaires à environ deux millimètres de l’embryon.

Placez les troncs d’embryons isolés dans des fosses et incubez-les pendant une heure et 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant que les troncs d’embryons sont en incubation. Préparez six lamelles pour la culture. D’abord en les rinçant à l’éthanol à 70 % et en les laissant sécher.

Ensuite, à l’aide d’un marqueur de laboratoire, tracez un cercle au centre de chaque lamelle d’environ un centimètre de diamètre pour une identification ultérieure de la couche de liaison de fibrine sur la même face de chaque lamelle. Écrivez un mot ou un symbole asymétrique à l’extérieur du cercle dessiné pour faciliter l’identification du haut et du bas du bordereau de couverture. Placez maintenant chaque lamelle dans une boîte stérile séparée de 40 x 10 millimètres, avec le côté étiqueté vers le bas, et laissez la boîte ouverte sous une lampe UV germicide pendant 10 minutes.

Appliquez ensuite 60 microlitres de fibronectine sur la surface non marquée de la lamelle à l’intérieur du cercle d’un centimètre, en vous assurant que toute la surface du cercle est recouverte. Placez la vaisselle dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la période d’incubation, aspirez soigneusement le fi nin de chaque lamelle.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de milieu de culture à la zone enrobée de FI nin. Le couvercle, puis incubez à nouveau les feuillets jusqu’à ce que les tubes neuraux aient été isolés. Pendant que les lamelles cuivent les lamelles, remplissez une boîte de Pétri en verre de cinq centimètres avec du milieu L 15.

Transférez maintenant tous les troncs d’embryons incubés dans la boîte de Pétri préparée. À l’aide d’une pince fine, d’une langue pointue et d’une aiguille, disséquez le tube neural en coupant soigneusement le long du bord du tube neural et des somites avec l’aiguille. Retirez les lamelles de l’incubateur.

Sélectionnez six des tubes neuraux les plus longs et les plus droits, puis à l’aide d’une pointe de micro-pipette amorcée avec un milieu de culture, transférez un tube neural sur chacune des six lamelles de recouvrement. Assurez-vous que chaque tube neural se trouve dans la zone recouverte de fibronectine de sa lamelle respective à l’aide d’une micro-pipette et incubez la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, placez au moins deux millilitres de milieu de culture sans sérum dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres.

Laissez le veau légèrement dévissé pendant la nuit pendant l’incubation du tube à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre au pH du milieu de s’ajuster. Après la culture pendant la nuit, sélectionnez les trois meilleures cultures de cellules de la crête neurale qui ont au moins un long bord droit sur les trois cultures. Choisissez-en un pour charger la première chambre et retournez les autres dans l’incubateur pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, à l’aide de notre coton-tige, appliquez une fine couche uniforme de vaseline sur les zones entourant les réservoirs et le pont d’une chambre Sigmund modifiée. Ensuite, à l’aide d’une aiguille en tungstène, retirez délicatement le tube neural de la lamelle contenant la culture cellulaire de la crête neurale sélectionnée, en laissant les cellules de la crête neurale entourées attachées à l’enveloppe de fibronectine. Marquez la parabole avec un marqueur de laboratoire afin de vous rappeler l’orientation du bord le plus droit de la culture cellulaire de la crête neurale.

Ensuite, placez quelques gouttes du milieu pré-incubé sur le pont de la chambre zigmund modifiée. Ramassez ensuite la lamelle à l’aide d’une pince fine. Tamponnez le bord de la lamelle contre une lingette Kim pour enlever la majeure partie de l’ancien milieu de culture, et placez immédiatement la lamelle sur la chambre Zigmund modifiée de sorte que la bordure droite de la cellule de la crête neurale à filmer soit centrée sur toute la longueur du pont et à peu près perpendiculaire à la bordure du réservoir du pont.

À l’aide d’un microscope inversé, déplacez la bordure droite de la crête neurale vers le côté du pont le plus proche du réservoir. Cela contiendra le tact de chimiothérapie suspecté et alignera plus finement le bord droit des cellules de la crête neurologique perpendiculaire au bord du réservoir de pont. Maintenant, appuyez soigneusement mais fermement sur le couvercle, glissez-le dans la vaseline présente sur la chambre zigmund, en vous assurant qu’elle est complètement scellée sur la chambre.

Placez ensuite de la vaseline supplémentaire le long du bord de la lamelle pour vous assurer qu’elle sera bien étanche à l’air. Ajustez à nouveau l’angle de la bordure de la cellule de la crête neurale pour corriger tout mouvement pendant le processus de plafond. Ensuite, chargez environ 300 microlitres de milieu pré-incubé dans une seringue d’un millilitre.

Avec une aiguille attachée de calibre 25 par 1,5 pouce. Injectez le milieu dans le réservoir qui ne contiendra pas de tact de chimiothérapie jusqu’à ce qu’il soit plein. Veiller à ne pas générer de bulles dans le réservoir.

Ensuite, bouchez le réservoir des deux côtés avec une quantité suffisante de vaseline avant de charger le réservoir suivant. Chargez maintenant une deuxième seringue de 300 microlitres de milieu pré-incubé contenant le tact de chimiothérapie souhaité. Injectez ensuite le fluide dans le réservoir opposé de la même manière.

Encore une fois, scellez soigneusement le réservoir avec de la vaseline. Ensuite, incubez la chambre Sigmund chargée à 37 degrés Celsius pendant une heure avant le tournage. Ensuite, pendant l’incubation à environ 37 degrés Celsius, le bord le plus droit de la culture cellulaire de la crête neurale pendant trois heures à 92e intervalles pour les témoins, chargez des chambres de zigmund contenant chacune des deux autres meilleures cultures de cellules de la crête neurale, comme nous venons de le voir.

Utilisation des traitements de contrôle appropriés pour le remplissage des réservoirs et l’amorçage du pont. Utilisez le plugin image J manual trackin pour suivre la migration des cellules de la crête neurale périphérique le long du bord droit de la culture. Utilisez le plugin d’outil de chimiotaxie et de migration pour analyser divers paramètres des trajectoires migratoires obtenues.

Des cultures de cellules de la crête neurale du tronc allongé ont été préparées par culture nocturne de tubes neuraux, et les cultures de cellules de la crête neurale résultantes avec au moins une longue bordure droite ont été sélectionnées pour l’expérimentation. La bordure droite la plus longue d’une culture sélectionnée a ensuite été positionnée perpendiculairement à la bordure du réservoir du pont, et donc parallèle au vecteur du futur gradient appliqué. Le réservoir qui ne contenait pas l’attractif de chimiothérapie suspecté représenté ici par un signe moins a été chargé en premier et scellé.

Ensuite, l’autre réservoir a été chargé avec l’attractif de chimiothérapie suspecté représenté par un signe plus, et les cellules de la crête neurale périphérique scellées le long de la bordure précédemment sélectionnée ont ensuite été imagées et suivies à l’aide du plug-in de suivi manuel pour l’image J.De nombreuses caractéristiques migratoires en réponse au gradient appliqué peuvent être évaluées sur la base des données de suivi obtenues, comme illustré par ce graphique. Par exemple, un indice de chimiotaxie peut être dérivé en divisant le déplacement d’une cellule le long de l’axe x par la distance totale qu’elle a migrée. La réponse attractive de toutes les cellules suivies est démontrée par le tracé de la trajectoire cellulaire montré ici.

Chaque trace rouge est la trajectoire d’une cellule qui a migré vers le réservoir chargé d’un attractif de chimiothérapie suspecté. Dans cette figure, il y a beaucoup plus de traces rouges que de pistes noires. Dans un autre test, la capacité d’une chambre Sigmund modifiée à maintenir un gradient moléculaire a été validée.

Un conjugué Alexa Fluor 4 88 IGM a été ajouté au réservoir gauche et l’intensité de fluorescence à travers le pont a été mesurée à différents moments. Le gradient est resté pendant au moins 26 heures Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la capacité d’une molécule à provoquer une chimiotaxie et d’autres comportements migratoires dans des cultures de cellules de crête neurale du tronc explantées à l’aide d’un test de chambre de Zigmund modifié.