Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

L’objectif global de l’imagerie multiphotonique est de capturer des images tridimensionnelles en temps réel à haute résolution des populations de cellules migratrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la cartographie des voies de migration de différentes populations cellulaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à la microscopie confocale traditionnelle est que les lasers multiphotons ont une pénétration tissulaire plus profonde et une phototoxicité réduite.

Cela augmente la facilité d’utilisation dans les tissus plus épais et permet des périodes d’acquisition d’images plus longues. Pour vous préparer à la collecte d’embryons entre 15h00 et 21h00, assemblez des réservoirs d’élevage et remplissez-les d’eau d’osmose inverse ou d’osmose inverse.

Transférez jusqu’à trois femelles et trois mâles dans les côtés opposés du réservoir divisé. Le lendemain matin, retirez le séparateur peu de temps après l’allumage des lumières dans le vivarium. Permettre l’accouplement sans être dérangé pendant 20 minutes ou jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’embryons soit produit.

Les embryons seront au fond du bassin d’élevage. Lorsque des œufs sont observés, soulevez le réservoir intérieur fendu avec les poissons et placez-les rapidement dans un réservoir extérieur propre et solide rempli d’eau osmosée. Utilisez un tamis de collecte d’œufs pour recueillir les œufs du réservoir extérieur et transférez les œufs dans des boîtes de Pétri contenant 30 millilitres de milieu embryonnaire 1X.

Incuber les œufs collectés à 28,5 degrés Celsius. Pour les embryons transgéniques, 24 heures après la fécondation ou HPF, retirez les ovules morts et évaluez le stade de développement des embryons. À l’aide d’une pince, retirez les chorions de trois à quatre embryons qui expriment la GFP.

Sous un stéréomicroscope à fluorescence dissectionnante avec un filtre d’excitation passe-bande standard de 460 à 490 nanomètres, dépister les embryons positifs à la GFP. Transférez ces embryons dans une boîte de Pétri séparée contenant 30 millilitres de milieu embryonnaire frais 1X. Après 20 HPF, placez les embryons positifs à la GFP dépilotés et déchorionnés dans une solution de PTU à 0,003 % pour inhiber la pigmentation.

Évitez de commencer le traitement plus tôt, car il peut avoir des effets néfastes sur la crête neurale et le développement neuroépithélial. Ajoutez 0,4 gramme de poudre d’agarose LowMelt à 20 ml de 1 milieu embryonnaire. Faites chauffer le mélange pendant une à deux minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire et que toutes les particules soient dissoutes.

Aliquote environ 1 ml de la solution d’agarose dans des tubes à centrifuger frais de 1,5 ml pour le stockage. Pour installer la chambre de bain ouverte, placez une petite quantité de graisse sous vide poussé sur la base de la chambre de bain ouverte. Placez un couvercle en verre circulaire glissé sur la base et vissez le haut de la chambre de bain ouverte sur la base jusqu’à ce qu’il soit bien serré.

Pipeter environ 500 à 700 microlitres de solution d’agarose à 2 % dans la chambre de bain ouverte jusqu’à ce que la base soit remplie d’environ 3/4. Attendez 30 secondes pour permettre à l’agarose de refroidir légèrement sans polymériser complètement, puis transférez un seul embryon au centre de la base. Sous un stéréomicroscope fluorescent, utilisez une pointe de micro-pipette de 10 microlitres pour orienter l’embryon et le positionner près du bas de l’agarose afin qu’il ne flotte pas lorsque le milieu embryonnaire est ajouté.

Une étape critique consiste à s’assurer que l’embryon est correctement positionné dans l’agarose. Dans ces expériences, nous orientons l’embryon latéralement, mais l’embryon peut également être positionné pour se concentrer sur les zones dorsale et ventrale. Surveillez et repositionnez l’embryon jusqu’à ce que l’agarose ait pris.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, remplissez entièrement la chambre ouverte assemblée avec un milieu embryonnaire time-lapse. Après avoir placé l’ensemble sur la platine du microscope, selon le protocole textuel, utilisez l’objectif cinq fois pour localiser l’embryon. Ensuite, soulevez manuellement la platine à la position la plus haute et utilisez la mise au point fine pour positionner l’embryon au milieu de la portée du microscope.

Abaissez manuellement la platine et changez l’objectif à cinq temps en objectif d’immersion dans l’eau à 25 temps. Soulevez soigneusement la scène pour ramener l’embryon au point. Dans le logiciel, cliquez sur le mode XYTZ pour obtenir plusieurs images à des intervalles de temps ou T dans le plan XY sur une profondeur de Z.Utilisez la vue épifluorescence ou champ clair pour trouver la profondeur de champ dans la zone d’intérêt qui délimitera la pile z.

Pour ces expériences, le bord latéral de l’œil est le début de la pile z. Lorsque vous vous concentrez ici, dans le logiciel, cliquez sur le bouton Commencer. Après vous être concentré sur la ligne médiane de l’embryon, qui est la fin de la pile z, cliquez sur le bouton de fin.

Une étape critique consiste à s’assurer que l’étape Z englobe la zone d’intérêt. Dans notre cas, nous voulons capturer la largeur de l’œil des bords latéraux aux bords médiaux. Cliquez sur le menu permettant de régler le temps d’acquisition et la fréquence d’imagerie.

Pour une récupération adéquate du fluor4 et la survie de l’embryon, prévoyez un rapport d’au moins un à trois entre l’acquisition de la pile z lorsque le laser est allumé et le temps de récupération lorsque le laser est éteint. Avec un temps approprié pour la récupération de l’embryon, réglez le temps entre les piles z dans la fenêtre désignée. Définissez ensuite la durée totale de l’expérience dans la fenêtre appropriée.

Maintenant, activez le paramètre d’image en direct pour effectuer les derniers ajustements des paramètres laser. Ajustez la transmission laser, le gain et le décalage des curseurs dans le logiciel pour optimiser l’image de fluorescence. Ajustez également l’orientation de l’embryon au besoin en fonction de la durée de l’expérience, de la croissance prévue de l’embryon, etc.

Assurez-vous que la zone d’intérêt reste dans le cadre pendant toute la durée de l’expérience. Pendant l’acquisition en accéléré, éteignez la source lumineuse d’épifluorescence, couvrez la platine avec le boîtier de sécurité laser adéquat pour la protection contre la lumière de fond, puis appuyez sur Démarrer. Accédez à la chambre de bain ouverte par les portes coulissantes du boîtier de sécurité laser pour la remplir de milieu embryonnaire en accéléré toutes les 8 à 12 heures.

Après l’acquisition de l’image, ouvrez les fichiers dans le logiciel de traitement d’image, mettez en surbrillance la série d’images correcte. Dans le logiciel, choisissez le menu du processus, cliquez sur Déconvolution 3D et appliquez pour déconvolution chaque pile z. Importez des fichiers tif individuels dans un logiciel de traitement vidéo, puis sélectionnez tous les fichiers tif et faites-les glisser dans l’éditeur vidéo.

Ajustez la durée de chaque image de la vidéo à 0,1 seconde. Enfin, exportez la vidéo sous forme de fichier mov ou mp4. L’imagerie par fluorescence multiphotonique montre les modèles de migration des cellules de la crête neurale crânienne qui donnent naissance aux structures faciales crâniennes et au segment antérieur de l’œil dans les lignées transgéniques de poisson-zèbre sox10 :EGFP et foxd3 :GFP.

Les cellules de la crête neurale positives de Sox 10 entre 12 et 30 hpf migrent du bord du tube neural vers la région crânienne du visage. Les cellules du prosencéphale et du mésencéphale migrent dorsalement et ventralement vers l’œil en développement pour peupler la mésencine périoculaire. Comme indiqué ici, les cellules positives sox10 forment le processus nasal frontal.

Les cellules de la crête neurale du rhombencéphale migrent ventralement et donnent naissance aux arcs pharyngiens. L’imagerie en accéléré des cellules de la crête neurale positive de foxd3 entre 30 et 60 hpf montre que ces cellules ont migré entre la cupule optique et l’ectoderme de surface et à travers la fissure oculaire marquée par la flèche et ont fusionné autour du cristallin marqué par l’astérisque formant le stroma de l’iris. Une fois maîtrisée, cette technique du début à la fin peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de choisir des embryons avec une grande quantité de fluorescence. La configuration initiale du logiciel peut être difficile, mais une fois les paramètres déterminés, les modifications supplémentaires sont généralement minimes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie time-lapse multiphotonique pour imager les cellules migrantes de l’embryon.