Name: Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Découvrez l'imagerie multiphotonique en time-lapse pour visualiser la migration des cellules de crête neurale chez les embryons de poisson-zèbre. Cette technique offre une pénétration tissulaire profonde et une faible phototoxicité pour l'étude de la biologie du développement.

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Les auteurs remercient Thomas Schilling pour gifting gentiment le poisson Tg (sox10:eGFP) et Mary Halloran pour gentiment gifting le poisson(foxd3:GFP) de Tg.

Le protocole décrit ici a été réalisé conformément aux directives pour le traitement sans cruauté des animaux de laboratoire établies par le Comité de l’Université du Michigan sur l’utilisation et le soin des animaux (UCUCA).
1. Collection d’embryons pour l’imagerie en accéléré
<ol>
	<li>Entre 15 et 21 heures, installez le poisson zèbre transgénique adulte mâle et femelle Tg (sox10 :EGFP) ou Tg (foxd3 :GFP) dans un bassin d’élevage divisé pour un accouplement par paires. 
	REMARQUE : Les poissons Tg(sox10 :EGFP) et Tg(foxd3 :GFP), aimables cadeaux de Thomas Schilling et Mary Halloran, respectivement, ont été croisés dans le fond Casper (roy -/-, nacre -/-) pour diminuer l’auto-fluorescence et l’interférence avec la pigmentation.
	<ol>
		<li>Assemblez le réservoir d’élevage (réservoir intérieur à fentes + réservoir extérieur solide) et remplissez-le d’eau du système d’osmose inverse (OI).</li>
		<li>Transférez jusqu’à 3 femelles et 3 mâles dans les côtés opposés de l’aquarium séparés par un séparateur ; jusqu’à 6 poissons peuvent être élevés par paires dans un seul réservoir d’élevage.</li>
		<li>Le lendemain matin, retirez le séparateur peu après l’allumage des lumières dans le vivarium. 
		REMARQUE : Dans la présente étude, les lumières sont allumées sur un cycle de 14 heures (allumé à 9 h) et d’obscurité de 10 heures (éteint à 23 h).</li>
		<li>Laisser l’accouplement tranquille pendant 20 minutes ou jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’embryons soit produit ; les embryons seront au fond du réservoir de reproduction. Lorsque des œufs sont observés, soulevez le réservoir intérieur fendu avec les poissons et placez-les rapidement (poisson et réservoir intérieur) dans un réservoir extérieur solide et propre rempli d’eau osmosée.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparez un milieu embryonnaire standard 1X en ajoutant les éléments suivants par 1 L d’eau osmosée : 0,287 g (4,9 mM) de NaCl, 0,127 g (0,17 mM) de KCl, 0,048 g (0,33 mM) de CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) de MgSO4 (anhydre). Remuez la solution jusqu’à ce que les sels soient complètement dissous.
	<ol>
		<li>Ajouter 100 μL de bleu de méthylène à 0,1 % comme fongicide. Ajoutez 0,25 g de bicarbonate de sodium pour ajuster le pH à 7,75. Conserver le milieu à température ambiante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prélevez les œufs dans le réservoir extérieur à l’aide d’un tamis de collecte d’œufs et transférez-les dans des boîtes de Pétri (~50 embryons par boîte) contenant 30 ml de milieu embryonnaire 1X. Incuber les œufs collectés à 28,5 °C.</li>
	<li>Préparation de l’embryon
	<ol>
		<li>Embryons de Tg(sox10 :EGFP).
		<ol>
			<li>Pour les embryons Tg(sox10 :EGFP), 12 h après la fécondation (hpf), prélever les ovules morts et évaluer le stade de développement des embryons. Dépister les embryons positifs à la GFP à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent dissectionnant avec un filtre d’excitation passe-bande standard de 460-490 nm. À l’aide d’une pince, retirez les chorions de 3 ou 4 embryons qui expriment la GFP et transférez ces embryons dans une boîte de Pétri séparée contenant 30 ml de milieu embryonnaire frais 1X.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tg(foxd3 :GFP) embryons.
		<ol>
			<li>Pour les embryons de Tg(foxd3 :GFP), à 22-24 hpf, prélever les œufs morts et évaluer le stade de développement des embryons. Dépister les embryons positifs à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent à dissection avec un filtre d’excitation passe-bande standard de 460-490 nm. À l’aide d’une pince, retirez les chorions de 3-4 embryons qui expriment la GFP.</li>
			<li>Préparer une solution mère de phénylthiourée 1000X (PTU) en dissolvant 0,75 g (3 %) de PTU dans 25 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Aliquote et conserver la solution mère à 4 °C. Ajouter 30 μL de solution mère 1000X PTU (3 %) à 30 mL de milieu embryonnaire 1X pour générer une solution PTU 0,003</li> %.
			<li>Placez les embryons positifs à la GFP dépilotés et déchorionnés dans une solution de PTU à 0,003 % pour inhiber la pigmentation. Ne pas commencer le traitement des embryons avec de la PTU avant 20 hpf, car un traitement précoce (à <20 hpf) peut avoir des effets néfastes sur la crête neurale et le développement neuroépithélial. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Avant de réaliser l’expérience en accéléré, surveillez les embryons à l’aide d’une imagerie en direct à l’aide d’un stéréomicroscope standard à des intervalles de 12 à 24 heures dans des comparaisons d’âge appariées comme contrôle de la dérive de température.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montage de l’embryon pour l’imagerie en accéléré
<ol>
	<li>Préparation de milieux embryonnaires time-lapse
	<ol>
		<li>Préparez une solution mère étalon de tricaïne à 0,4 % en ajoutant 0,004 g de tricaïne à 100 ml d’eau osmosée. Aliquote (~1 mL) la solution mère dans des tubes à centrifuger frais de 1,5 mL et conservez-la à -20 °C.</li>
		<li>Préparez un milieu embryonnaire time-lapse (50 ml de milieu embryonnaire 1X, 0,016 % de tricaïne) en ajoutant 2 ml de solution de tricaïne à 0,4 % à 48 ml de milieu embryonnaire 1X. Si vous utilisez des embryons >22 hpf, ajoutez également 50 μL de solution mère de PTU à 3 % (concentration finale.003 % PTU) au milieu embryonnaire.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation de 2 % d’agarose à bas point de fusion
	<ol>
		<li>Ajouter 0,4 g de poudre d’agarose à faible point de fusion à 20 ml de milieu embryonnaire 1X. Chauffer pendant 1 à 2 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire et que toutes les particules soient dissoutes. 
		REMARQUE : L’augmentation du pourcentage de gel d’agarose diminue la porosité de la matrice, ce qui peut entraver physiquement la croissance et le développement de l’embryon. Par conséquent, la solution d’agarose peut être réduite à 1,5 % pour minimiser ces effets. Cependant, lorsque le faisceau d’excitation est maintenu stationnaire pendant la microscopie à balayage laser, un échauffement plus important peut se produire, augmentant rapidement dans une relation logarithmique avec le temps. Dans ce protocole, l’échauffement dû à l’absorption de fluorophores est fortement localisé dans la région focale. Ainsi, dans la région d’intérêt, la température pourrait augmenter jusqu’à une valeur suffisamment élevée (≥ 30 °C) pour faire fondre des solutions d’agarose produites à des pourcentages inférieurs à 1,5, exposant ainsi directement l’embryon au laser ou permettant des conditions dans lesquelles l’embryon flotte hors du plan focal. Pour cette raison, l’utilisation de solutions d’agarose inférieures à 1,5 % n’est pas recommandée.</li>
		<li>Aliquote (~1 ml) la solution d’agarose dans des tubes à centrifuger frais de 1,5 ml pour l’entreposage. Conservez l’excès de solution d’agarose sous forme liquide sur un bloc chauffant (60-70 °C) pendant 2-3 semaines.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montage de l’embryon
	<ol>
		<li>Pour installer la chambre de bain ouverte, placez une petite quantité de graisse sous vide poussé sur la base de la chambre de bain ouverte. Placez une lamelle circulaire en verre sur la base et vissez le haut de la chambre de bain ouverte sur la base jusqu’à ce qu’elle soit bien serrée ( Figure 1A, B).</li>
		<li>Pipette (~500-700 μL) de solution d’agarose à 2 % (60-70 °C) dans la chambre de bain ouverte jusqu’à ce que la base soit remplie aux ~3/4 ( <classe forte = « xfig">Figure 1C). Notez qu’une fois que la solution d’agarose se trouve dans la chambre de bain ouverte sur la paillasse du laboratoire, la température de la solution diminue d’environ 1 °C/s.</li>
		<li>Attendre 30 s pour laisser l’agarose refroidir légèrement (~30-40 °C), sans polymériser complètement, puis transférer un seul embryon au centre de la base ( Figure 1D, E).</li>
		<li>Sous un stéréomicroscope fluorescent, positionnez l’embryon à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 à 10 μL, en vous assurant que l’embryon est placé près du bas de l’agarose, car l’embryon peut flotter lorsqu’il est recouvert d’un milieu embryonnaire s’il est placé trop près de la surface de l’agarose. 
		REMARQUE : Dans les vidéos présentées (Vidéos 1-3), les embryons sont orientés latéralement, mais selon la zone d’intérêt, les embryons peuvent être orientés ventralement ou dorsalement.</li>
		<li>Surveillez et repositionnez l’embryon jusqu’à ce que l’agarose ait pris. Une fois que l’agarose a pris, utilisez une pipette de transfert pour remplir entièrement la chambre ouverte assemblée avec un milieu embryonnaire time-lapse ( Figure 1F).</li>
		<li>Placez la chambre de bain ouverte dans la plate-forme de remplacement rapide, qui s’adapte à l’adaptateur de scène ( Figure 1G). Placez l’ensemble de l’installation (embryon, chambre de bain ouverte, plate-forme de remplacement rapide et adaptateur de platine) sur la platine du microscope immédiatement au-dessus du condenseur ( Figure 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Configuration du microscope pour l’imagerie en accéléré
<ol>
	<li>Détermination des paramètres laser
	<ol>
		<li>Détermination de la longueur d’onde laser à utiliser. Utilisez une longueur d’onde deux fois supérieure à la longueur d’onde d’excitation du fluorophore d’intérêt (par exemple, une longueur d’onde comprise entre 880 et 940 nm pour la GFP). 
		REMARQUE : Dans la présente étude, la longueur d’onde de la GFP était comprise entre 880 et 940 nm. Plus la longueur d’onde est élevée, plus la puissance de sortie du laser est faible.</li>
		<li>Déterminez la transmission laser. Un pourcentage élevé de transmission laser tuera l’embryon, utilisez le niveau de transmission le plus bas (recommandé). Pour les études en accéléré de 24 à 48 heures, telles que présentées ici, maintenez la transmission en dessous de 5 %.</li>
		<li>Déterminez les systèmes de détection par microscope et assurez-vous que les filtres appropriés pour le fluorophore sont en place. 
		REMARQUE : Pour les microscopes multiphotoniques, il existe plusieurs systèmes de détection avec différentes sensibilités pour la fluorescence émise. En général, un système de détection interne est moins sensible qu’un système de détection externe. Pour les lignées transgéniques avec des niveaux élevés d’expression de GFP, le système de détection interne est adéquat. Pour les lignées transgéniques avec de faibles niveaux d’expression de la GFP ou avec d’autres fluorophores (par exemple, la protéine fluorescente rouge), un système de détection externe peut être nécessaire pour maintenir le pourcentage de transmission laser à un niveau raisonnable. Quel que soit le système de détection utilisé, les filtres appropriés pour le fluorophore doivent être en place.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Réglage des paramètres du logiciel sur le microscope multiphotonique
	<ol>
		<li>À l’aide de l’objectif 5X, localisez l’embryon. Soulevez manuellement la platine à la position la plus haute et utilisez la mise au point fine pour positionner l’embryon au milieu de la portée du microscope.</li>
		<li>Abaissez manuellement la platine et remplacez l’objectif 5X par l’objectif à immersion dans l’eau 25X (ouverture numérique NA, 0,95). Soulevez soigneusement la scène pour ramener l’embryon au point.</li>
		<li>Dans le logiciel, cliquez sur le mode « xyzt » pour obtenir plusieurs images à intervalles de temps (t) dans le plan x-y sur une profondeur de « z ». Utilisez la vue épifluorescence ou en fond clair pour trouver la profondeur de champ dans la zone d’intérêt, ce qui délimitera la pile Z.
		<ol>
			<li>Dans le logiciel, cliquez sur le bouton « commencer » ; pour ces expériences, le bord latéral de l’œil était le début de la pile Z. Cliquez sur le bouton « Fins » ; la ligne médiane de l’embryon était l’extrémité de la pile Z. 
			REMARQUE : La taille du pas était de 0,3 à 0,6 μm et il y avait un total de ~200 pas pour une taille de pile z de 60 à 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Cliquez sur le menu permettant de régler le temps d’acquisition et la fréquence d’imagerie. Pour le système actuel, ~200 étapes nécessitent environ 5 minutes pour chaque acquisition de pile z. Pour une récupération adéquate du fluorophore et la survie de l’embryon, prévoyez un rapport d’au moins 1:3 entre l’acquisition de la pile z (mise sous tension du laser) et le temps de récupération (mise hors tension du laser). 
		REMARQUE : Par exemple, les piles z sont acquises toutes les 20 minutes avec 5 minutes d’acquisition de pile Z et 15 minutes de récupération. Pour ce protocole, des piles z plus grandes peuvent être obtenues, mais augmenteraient de manière appropriée le temps entre les acquisitions de piles z, ce qui entraînerait moins d’images au cours du laps de temps.
		<ol>
			<li>Avec un temps approprié pour la récupération de l’embryon, réglez le temps entre les piles z dans la fenêtre désignée. Définissez la durée totale de l’expérience dans la fenêtre appropriée.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ajustements finaux du logiciel, du laser et de l’embryon.
		<ol>
			<li>Activez le paramètre d’image en direct pour effectuer les derniers réglages des paramètres laser. Ajustez la transmission laser (voir 3.1.2), le gain et les curseurs de décalage dans le logiciel pour optimiser l’image fluorescente. Ajustez également l’orientation de l’embryon, au besoin, en fonction de la durée de l’expérience, de la croissance prévue de l’embryon, etc. Assurez-vous que la zone d’intérêt reste dans le cadre pendant toute la durée de l’expérience.</li>
			<li>Éteignez la source de lumière épifluorescente car elle n’est plus nécessaire lors de l’acquisition en accéléré. Couvrez la platine avec le boîtier de sécurité laser ( Figure 1I). Lors de l’utilisation du système de détection interne, le boîtier de sécurité laser est adéquat pour la protection contre la lumière de fond. Appuyez sur « start ». 
			REMARQUE : Cependant, avec des systèmes de détection externes plus sensibles, le boîtier de sécurité laser ne bloque pas suffisamment la lumière de fond et des couvercles supplémentaires sont nécessaires pour éviter de perturber l’acquisition d’images.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pendant l’acquisition en accéléré
<ol>
	<li>Remplissez la chambre de bain ouverte avec du milieu embryonnaire time-lapse toutes les 8 à 12 h (au moins 2 fois par jour) pendant l’acquisition time-lapse à travers les portes coulissantes du boîtier de sécurité laser ( Figure 1I).</li>
	<li>Avant d’ouvrir les portes du boîtier de sécurité laser, assurez-vous que le microscope n’est pas en train d’acquérir activement une image. 
	REMARQUE : L’utilisation de réchauffeurs et de systèmes de circulation n’est pas nécessaire pour les expériences d’imagerie en accéléré d’une durée de 24 à 48 h. En effet, les températures des réchauffeurs de scène et en ligne sont difficiles à contrôler, et lors de l’acquisition de l’image, l’embryon présente un taux de développement adéquat à une plage de température de 25 à 28 °C. De plus, les systèmes de fluides circulants ont tendance à déborder et à endommager potentiellement l’équipement. Ainsi, tous les embryons sont systématiquement stadés après l’acquisition.</li>
</ol>
5. Traitement post-acquisition
<ol>
	<li>Dans le logiciel, cliquez sur le menu « fichier » et choisissez « enregistrer ».</li>
	<li>Ouvrez le fichier dans un logiciel de traitement d’images (voir la Table des matériaux). Mettez en surbrillance la série d’images correcte. Dans le logiciel, choisissez le menu « Process ». Cliquez sur Déconvolution 3D et « Appliquer » pour déconvolution chaque z-stack. 
	REMARQUE : Le fichier est volumineux ; Par conséquent, cette étape peut prendre plusieurs heures.</li>
	<li>Dans le logiciel, sous le menu « Process », cliquez sur « projection maximale ». Cliquez sur « Appliquer » pour lancer la projection maximale afin de générer 1 image par z-stack. Exportez chaque fichier projeté maximum (1 image par z-stack) sous forme de tiff.</li>
	<li>Importez des fichiers tiff individuels dans un logiciel de traitement vidéo. Sélectionnez tous les fichiers tiff et faites-les glisser dans l’éditeur vidéo. Ajustez la longueur de chaque image de la vidéo à 0,1 s. Exportez la vidéo sous forme de fichier mov ou mp4.</li>
</ol>

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</ol>

Ce travail a été soutenu financièrement par le biais de subventions accordées par le National Eye Institute du National Institutes of Health (K08EY022912-01) et Vision Research Core (P30 EY007003).

Les Time-lapse imagerie multiphotonique permet le suivi in vivo des populations de cellules migratrices et transitoire. Cette technique puissante permet d’étudier les processus embryonnaires en temps réel, et dans la présente étude, les résultats de cette méthode a amélioré les connaissances actuelles de la migration des cellules neurales de crête et le développement. Les études d’imagerie Time-lapse antérieures utilisent généralement laser confocal, microscopie à balayage. 29 ,</sup...

Les maladies oculaires congénitales peuvent causer la cécité chez l’enfant et sont souvent dues à des anomalies de la crête neurale crânienne. Les cellules de la crête neurale sont des cellules souches transitoires qui proviennent du tube neural et forment de nombreux tissus dans tout le corps. 1,2,3,4,5 Les cellules de la crête neurale, dérivées du prosencéphale et du mésencéphale, donnent naissance à l’os et au cartilage des régions médiane du visage et du front, ainsi qu’à l’iris, à la cornée, au réseau trabéculaire et à la sclérotique du segment antérieur de l’œil. 4,6,7,8 Les cellules de la crête neurale du rhombencéphale forment les arcs pharyngés, la mâchoire et la voie d’écoulement cardiaque. 1,3,4,9,10 Des études ont mis en évidence les contributions de la crête neurale au développement oculaire et périoculaire, soulignant l’importance de ces cellules dans le développement oculaire des vertébrés. En effet, la perturbation de la migration et de la différenciation des cellules de la crête neurale conduit à des anomalies craniofaciales et oculaires observées dans le syndrome d’Axenfeld-Rieger et le syndrome de Peters Plus. 11,12,13,14,15,16,17 Ainsi, une compréhension complète de la migration, de la prolifération et de la différenciation de ces cellules de la crête neurale donnera un aperçu des complexités sous-jacentes aux maladies oculaires congénitales.
Le poisson-zèbre est un organisme modèle puissant pour l’étude du développement oculaire, car les structures de l’œil du poisson-zèbre sont similaires à celles de leurs homologues mammifères, et de nombreux gènes sont conservés au cours de l’évolution entre le poisson-zèbre et les mammifères. 18,19,20 De plus, les embryons de poisson-zèbre sont transparents et ovipares, ce qui facilite la visualisation du développement oculaire en temps réel.
Développant les travaux précédemment publiés,6,7,20 le schéma migratoire des cellules de la crête neurale a été décrit à l’aide de l’imagerie par fluorescence multiphotonique en accéléré sur des lignées de poissons-zèbres transgéniques marquées avec de la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle transcriptionnel de la SRY (région déterminant le sexe Y)-boîte 10 (sox10) ou de la boîte Forkhead D3 (foxd3) régions régulatrices des gènes. 21,22,23,24. L’imagerie time-lapse par fluorescence multiphotonique est une technique puissante qui combine les techniques optiques avancées de la microscopie à balayage laser avec l’excitation de fluorescence multiphotonique à grande longueur d’onde pour capturer des images tridimensionnelles haute résolution d’échantillons marqués avec des fluorophores. 25,26,27 L’utilisation du laser multiphotonique présente des avantages distincts par rapport à la microscopie confocale standard, notamment une pénétration accrue des tissus et une diminution du blanchiment des fluorophores.
En utilisant cette méthode, deux populations distinctes de cellules de la crête neurale variant dans le moment de la migration et les voies migratoires ont été discriminées, à savoir les cellules de la crête neurale foxd3-positives dans le mésenchyme périoculaire et les cellules de la crête neurale en développement de l’œil et sox10-positives dans le mésenchyme craniofacial. Avec cette méthode, une approche permettant de visualiser la migration de la crête neurale oculaire et craniofaciale chez le poisson zèbre est introduite, ce qui facilite l’observation de la migration régulée de la crête neurale en temps réel pendant le développement.
Ce protocole fournit des informations pour générer des vidéos en accéléré pendant le développement oculaire précoce chez le poisson zèbre transgénique Tg(sox10 :EGFP) et Tg(foxd3 :GFP), par exemple. Ce protocole peut être appliqué pour la visualisation à haute résolution, tridimensionnelle et en temps réel du développement précoce de toute structure oculaire et craniofaciale dérivée des cellules de la crête neurale chez le poisson-zèbre. De plus, cette méthode peut être appliquée pour la visualisation du développement d’autres tissus et organes chez le poisson zèbre et d’autres modèles animaux.

<table><tbody><tr><td>Réservoirs d’élevage avec séparateurs,</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Crossing Tank Set (1,0 litre), Polycarbonate transparent avec couvercle et insert</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td>, <td>Leica Microsystems, CMS GmbH</td><td></td>, <td>Microscope à stéréofluorescence - FusionOptics et TripleBeam</td></tr><tr><td>Sodium</td><td>Chloride Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Double sac en PE. N° CAS 7647-14-5, n° CE 231-598-3</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Millipore (EMD)</td><td>1049380500</td><td>Chlorure de potassium 99.999 Suprapur. N° CAS 7447-40-7, numéro CE 231-211-8.</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td> Flacon en polyéthylène <td>; 500 g. N° CAS 10035-04-8</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (anhydre)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>Flacon en polyéthylène ; 500 g. N° CAS 7487-88-9, numéro CE 231-298-2</td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Millipore (EMD)</td><td>284-12</td><td>Flacon en verre ; 25 g. Poudre, colorant biologique certifié</td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium</td><td>millipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Flacon en polyéthylène ; 500 g. Poudre, GR ACS. N° CAS 144-55-8, numéro CE 205-633-8</td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98 %. Numéro CAS 103-85-5, Numéro CE 203-151-2</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>Qualité Biologie moléculaire. Numéro CAS 67-68-5, numéro CE 200-664-3</td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaïne</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td> Tricaine-S <td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sieve GQA Agarose à faible point de fusion, 25 g</td></tr><tr><td>Chambre de bain ouverte</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td>Couvre-couvercle en verre à profil élevé</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Verre de couverture circulaire. Graisse sous vide poussé de 25 mm de diamètre</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>Tube de 2,0 lb. DOW CORNING CORPORATION 1658832 Plateforme d’échange</td></tr><tr><td>rapide</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de platine</td><td>35 mm Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td> Microscope multiphotoniques TC SP5 MP <td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Safety Box</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp ; Logiciel</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Logiciel</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Version 10.1.4 Logiciel</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multiphotonique time lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

L’oeil congénitales et des anomalies cranio-faciales reflètent les perturbations dans la crête neurale, une population nomade de cellules souches migratrices qui donnent lieu à nombreux types de cellules dans tout le corps. Comprendre la biologie de la crête neurale a été limité, ce qui reflète un manque de modèles génétiquement tractable pouvant être étudié in vivo et en temps réel. Poisson zèbre est un modèle de développement particulièrement important pour l’étude des populations de cellules migratrices, comme la crête neurale. Afin d’examiner la migration de la crête neurale dans le œil en voie de développement, une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons de grande longueur d’onde de laser a été mis en place pour capturer des vidéos de haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de le œil en développement chez les embryons de poisson-zèbre transgéniques, nommément Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP), comme sox10 et foxd3 ont été présentés dans plusieurs modèles animaux de réglementer une différenciation précoce crête neurale et représentent probablement des marqueurs de cellules neurales de crête. Les Time-lapse imagerie multiphotonique servait à discerner le comportement et les habitudes migratoires des deux populations de cellules neurales de crête contribuant au développement d’oeil au début. Ce protocole fournit des informations pour générer des vidéos time-lapse pendant la migration de poisson-zèbre de crête neurale, à titre d’exemple et peut être davantage appliqué pour visualiser le début du développement de nombreuses structures dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.

L’imagerie de fluorescence multi-photons Time-lapse a généré une série de vidéos qui a révélé les patrons de migration des cellules de la crête neurale crânienne qui donnent lieu à des structures cranio-faciales et les segment antérieur de le œil dans le Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP) lignes de poisson-zèbre. À titre d’exemple, sox10 -cellules neurales de crête positive entre 12 et 30 hpf migrent du bord du tube neural dans la région cranio-faciale (V...

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

L'objectif général de l'imagerie dynamique multiphoton est de capturer en temps réel des images tridimensionnelles haute résolution de populations cellulaires migratrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la cartographie des voies de migration de différentes populations cellulaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à la microscopie confocale traditionnelle réside dans la capacité de pénétration plus profonde des lasers multiphotons dans les tissus et une phototoxicité réduite.Cela augmente la facilité d'utilisation dans les tissus plus épais et permet des périodes plus longues d'acquisition d'images. Pour préparer la collecte d'embryons entre 15 h et 21 h, assemblez les aquariums de reproduction et remplissez-les d'eau provenant d'une osmose inverse, ou eau OI.Transférez jusqu'à trois femelles et trois mâles dans les côtés opposés du réservoir divisé. Le lendemain matin, retirez le séparateur peu de temps après l'allumage des lumières dans le vivarium. Laissez l'accouplement se dérouler sans perturbation pendant 20 minutes ou jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'embryons soit produit.Les embryons se trouveront au fond du réservoir d'élevage. Lorsque des œufs sont observés, soulevez le réservoir intérieur ajouré avec les poissons, puis placez-les rapidement dans un réservoir extérieur propre et plein d'eau RO. Utilisez un tamis de collecte d'œufs pour recueillir les œufs du réservoir extérieur et transférez les œufs dans des boîtes de Pétri contenant 30 millilitres de milieu d'embryon à 1X.Incuber les œufs collectés à 28,5 degrés Celsius. Pour les embryons transgéniques, à 24 heures après la fécondation (HPF), éliminer les œufs morts et évaluer le stade de développement des embryons. À l’aide de pinces, retirer les chorioallantoïdes de trois à quatre embryons exprimant la GFP.Sous un microscope stéréo à fluorescence doté d'un filtre d'excitation standard à bande passante de 460 à 490 nanomètres, recherchez les embryons positifs pour la GFP. Transférez ces embryons vers une boîte de Pétri séparée contenant 30 millilitres de milieu d'embryon frais à 1X. Après 20 HPF, placez les embryons positifs pour la GFP, sélectionnés et déchorionés, dans une solution de PTU à 0,003 % afin d'inhiber la pigmentation.Évitez de commencer le traitement plus tôt car cela peut avoir des effets néfastes sur le développement de la crête neurale et de l'épithélium neural. Ajoutez 0,4 gramme de poudre d'agarose à bas point de fusion à 20 mL de milieu d'embryon 1x. Chauffez le mélange pendant une à deux minutes ou jusqu'à ce que la solution soit claire et que toutes les particules soient dissoutes.Prélevez environ 1 mL de la solution d'agarose et répartissez-la en aliquotes dans de nouveaux tubes de centrifugation de 1,5 mL pour stockage. Pour installer la chambre à bain ouverte, appliquez une petite quantité de graisse à vide élevé sur la base de la chambre à bain ouverte. Placez une lame de verre circulaire sur la base, puis vissez le couvercle de la chambre à bain ouverte sur la base jusqu'à ce qu'elle soit bien serrée.Introduisez environ 500 à 700 microlitres de solution d'agarose à 2 % dans la chambre du bain ouverte jusqu'à ce que la base soit remplie aux trois quarts environ. Attendez 30 secondes pour permettre à l'agarose de refroidir légèrement sans polymériser complètement, puis transférez un seul embryon au centre de la base. Sous un microscope stéréo à fluorescence, utilisez une micro-pipette de 10 microlitres pour orienter l'embryon et le positionner près du fond de l'agarose afin qu'il ne flotte pas lorsque le milieu pour embryon sera ajouté.Une étape cruciale consiste à s'assurer que l'embryon est correctement positionné dans l'agarose. Dans ces expériences, nous orientons l'embryon de manière latérale, mais il peut également être positionné afin de cibler les régions dorsale et ventrale. Surveillez et repositionnez l'embryon jusqu'à ce que l'agarose ait pris.Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour remplir complètement la chambre ouverte assemblée avec le milieu pour embryon en acquisition en continu. Après avoir placé l'ensemble sur la platine du microscope, conformément au protocole écrit, utilisez l'objectif ×5 pour localiser l'embryon. Ensuite, relevez manuellement la platine à la position la plus haute et utilisez le réglage fin de mise au point pour positionner l'embryon au milieu de la plage de vision du microscope.Abaissez manuellement la platine et remplacez l'objectif à 5 fois par l'objectif à immersion dans l'eau à 25 fois. Remontez soigneusement la platine pour ramener l'embryon au point de netteté. Dans le logiciel, cliquez sur le mode XYTZ pour acquérir plusieurs images à des intervalles de temps T dans le plan XY sur une profondeur Z. Utilisez la vue en épifluorescence ou en champ clair pour déterminer la profondeur de mise au point dans la zone d'intérêt, ce qui délimitera le z-stacking.Pour ces expériences, le bord latéral de l'œil correspond au début du z-stacking. Une fois mis au point à cet endroit, cliquez sur le bouton de début dans le logiciel. Après avoir focalisé jusqu'à la ligne médiane de l'embryon, qui marque la fin du z-stacking, cliquez sur le bouton de fin.Une étape cruciale consiste à s'assurer que le pas Z englobe la zone d'intérêt. Dans notre cas, nous souhaitons capturer la largeur de l'œil du bord latéral au bord médial. Cliquez sur le menu permettant d'ajuster le temps d'acquisition et la fréquence d'imagerie.Pour une récupération adéquate du fluor4 et la survie de l'embryon, prévoir un rapport d'au moins un à trois entre l'acquisition du z-stack lorsque la puissance du laser est activée et le temps de récupération lorsque la puissance du laser est désactivée. En tenant compte d'un temps de récupération approprié pour l'embryon, régler l'intervalle entre les z-stacks dans la fenêtre prévue à cet effet. Ensuite, définir la durée totale de l'expérience dans la fenêtre appropriée.Maintenant, activez le mode d’image en direct pour effectuer les réglages finaux des paramètres du laser. Ajustez les curseurs de transmission du laser, de gain et de décalage dans le logiciel afin d’optimiser l’image de fluorescence. Ajustez également l’orientation de l’embryon selon les besoins, en fonction de la durée de l’expérience, de la croissance prévue de l’embryon, etc.Veillez à ce que la zone d’intérêt reste dans le cadre pendant toute la durée de l’expérience. Pendant l’acquisition en laps de temps, éteignez la source de lumière en épifluorescence, recouvrez la platine avec la boîte de sécurité laser, suffisante pour se protéger contre la lumière ambiante, puis appuyez sur démarrer. Accédez à la chambre ouverte en utilisant les portes coulissantes de la boîte de sécurité laser afin de la remplir à nouveau avec le milieu pour embryons en laps de temps toutes les 8 à 12 heures.Après l'acquisition des images, ouvrez les fichiers dans le logiciel de traitement d'image et sélectionnez la série d'images correcte. Dans le logiciel, choisissez le menu traitement, cliquez sur la déconvolution 3D et appliquez-la pour déconvoluer chaque pile z. Importez les fichiers tif individuels dans un logiciel de montage vidéo, puis sélectionnez tous les fichiers tif et glissez-les dans l'éditeur vidéo.Ajustez la durée de chaque image dans la vidéo à 0,1 seconde. Enfin, exportez la vidéo sous forme de fichier mov ou mp4. On observe ici, par imagerie de fluorescence multiphoton, les schémas de migration des cellules de la crête neurale crânienne qui donnent naissance aux structures faciales crâniennes et au segment antérieur de l'œil chez des lignées de poisson-zèbre transgéniques sox10:EGFP et foxd3:GFP.Les cellules de la crête neurale positives pour Sox10 entre 12 et 30 hpf migrent depuis le bord du tube neural vers la région craniofaciale. Les cellules provenant du prosencéphale et du mésencéphale migrent dorsalement et ventralement vers l’œil en développement afin de coloniser le mésenchyme périoculaire. Comme indiqué ici, les cellules positives pour sox10 forment le bourgeon nasal frontal.Les cellules de la crête neurale issues du rhombencéphale migrent de manière ventrale et donnent naissance aux arcs pharyngés. L'imagerie en accéléré de cellules de la crête neurale positives pour foxd3 entre 30 et 60 hpf montre que ces cellules migrent entre la cupule optique et l'ectoderme de surface, traversent la fente oculaire indiquée par la flèche et s'assemblent autour du cristallin marqué par l'astérisque, formant ainsi le stroma de l'iris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours, du début à la fin, si elle est correctement exécutée.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de choisir des embryons présentant une forte fluorescence. La configuration initiale du logiciel peut être difficile, mais une fois les paramètres déterminés, les modifications supplémentaires sont généralement minimes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la microscopie en laps de temps multiphotonique pour imager des cellules en migration dans l'embryon.

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Dans cette vidéo, des techniques pour multicolor confocale imagerie time-lapse et l'ablation des cellules ciblées sont fournis. Time-lapse d'imagerie est utilisée pour surveiller le comportement de plusieurs types cellulaires...

Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Source : Williams, A. L., et al. Imagerie multi-photonique Time Lapse pour visualiser le développement en temps réel : visualisation des cellules de la crête neurale en migration dans les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un protocole d’imagerie time-lapse multiphotonique permettant de visualiser la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre en temps réel avec une haute résolution.

Visualisation de la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre à l’aide de l’imagerie multiphotonique en accéléré

Visualisation des données expérimentales est devenu un élément clé dans la présentation des résultats à la communauté scientifique. Génération de direct enregistrement time-lapse d'embryons croissance contribue à une meilleure présentation et la compréhension des processus de développement complexes. Ce protocole est un guide pour le marquage des cellules par l'intermédiaire de photoconversion de la protéine chez le poisson zèbre kaede étape par étape.

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l&#39;aide Time-lapse de microscopie confocale

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.

Une méthode de montage polyvalent pour l&#39;imagerie à long terme du développement Zebrafish

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Ici, un protocole est fourni pour l’imagerie time-lapse de la morphogenèse oculaire à l’aide d’un microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce et d’un poste de travail de traitement d’images pour analyser les données résultantes. Ce protocole détaille les procédures d’anesthésie embryonnaire, l’intégration dans l’agarose à basse température de fusion, la suspension dans la chambre d’imagerie, la mise en place des paramètres d’imagerie et enfin l’analyse des données d’imagerie à...

Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Découvrez l'imagerie multiphotonique en time-lapse pour visualiser la migration des cellules de crête neurale chez les embryons de poisson-zèbre. Cette technique offre une pénétration tissulaire profonde et une faible phototoxicité pour l'étude de la biologie du développement.

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

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