Une méthode simple pour l'imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d'imagerie infiltratives

L'objectif général de cette procédure est de minimiser la dégradation des images biologiques causée par les espaces aériens présents dans les feuilles de plantes, afin d'obtenir des images plus nettes des cellules vivantes au sein de la feuille. Si la feuille est montée dans un milieu de montage aqueux et qu'un fluorophore est excité par un laser, de nombreux espaces aériens non remplis ainsi que les variations de l'indice de réfraction au sein du tissu, indiqués en orange, limitent l'intensité du signal en profondeur dans le tissu sur l'image résultante. En revanche, si la feuille est montée dans du perfluorodécaline (PFD), l'excitation laser du fluorophore est moins atténuée, ce qui permet une meilleure transmission des signaux émis.

En fin de compte, l'utilisation de la microscopie confocale à balayage laser avec le milieu de montage PFD permet d'obtenir des images nettes de cellules vivantes à l'intérieur de la feuille végétale à une profondeur supérieure au double de celle accessible avec un milieu de montage aqueux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la fixation ou le montage de feuilles dans des milieux aqueux, est qu'elle réduit la réfraction au sein du mésophylle et permet une imagerie plus précise de cellules vivantes situées plus profondément dans la feuille, ce qui posait auparavant des problèmes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles en biologie végétale, telles que l'étude du mésophylle, de la biologie cellulaire et de la signalisation in vivo, la colonisation des feuilles par des agents pathogènes et les interactions entre pathogènes et mésophylle, bien qu'elle puisse également fournir des informations sur la biologie fondamentale des plantes.

Il peut également être appliqué à d'autres tissus fortement réfractaires riches en espaces aériens, comme les spirales d'insight ou le poumon des vertébrés. Cette procédure sera démontrée par le Dr. George Littlejohn de mon laboratoire To Mount Leaf. La préparation des échantillons en PFD commence par la mise en place d'une lame de microscope munie d'un joint perméable aux gaz en polydiméthylsiloxane ou P-D-M-S. Le P-D-M-S est un polymère viscoélastique qui peut être moulé pour former une chambre adaptée aux besoins expérimentaux.

Équilibrez le PFD avec de l'air en agitant un petit volume de PFD dans un flacon rempli d'air. Cette opération peut également être réalisée en faisant barboter de l'air à travers le PFD, puis versez délicatement le PFD dans une boîte de Pétri ouverte et faites flotter une plantule entière ou une feuille excisée à la surface du liquide pendant cinq minutes. Le tissu doit devenir translucide, rappelant un tissu vitrifié.

Les feuilles peuvent apparaître plus foncées ou plus claires qu'avant l'exposition au PFD, selon les conditions d'éclairage et l'âge du tissu utilisé. Enfin, remplissez la chambre en PDMS avec du PFD équilibré à l'air et transférez soigneusement les échantillons de tissu depuis la boîte de Pétri d'incubation vers la chambre en PDMS. Scellez la lame avec un couvre-objet et effectuez l'acquisition d'image.

En fonction des exigences expérimentales, des feuilles ont été incubées pendant cinq minutes dans une suspension de protéine verte fluorescente recombinante ou GFP. L'inspection microscopique en PFD des échantillons de feuilles incubés en PFD montre que la majorité des espaces aériens sont inondés par la GFP recombinante en suspension dans la PFD. La GFP apparaît en vert, et le rouge représente la chlorophylle, la fluorescence autofluorescente et les cellules du mésophylle.

Il est évident que la feuille est inondée après incubation avec du DFP, mais que des poches d'air occasionnelles peuvent subsister. L'eau n'envahit pas la feuille dans ces conditions. Ici, des feuilles d'opsys exprimant Venus, une variante du PFP, qui se localise dans le cytosol, sont incubées et montées dans l'air, l'eau ou le DFP pour une analyse par microscopie à balayage laser. L'examen confocal des échantillons montre un avantage du DFP par rapport à l'air et à l'eau, avec un accroissement d'environ deux fois la profondeur d'imagerie.

Lors de la comparaison entre le PFD et l'eau, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à dix minutes si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que le delin périphérique dissout le vernis à ongles et le téflon, mais qu'il est compatible avec la graisse de silicone. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilisation du delin perfluoré comme milieu de montage pour améliorer l'imagerie des cellules des feuilles de plantes.

N'oubliez pas que, bien que le perfluorodécaline soit non toxique, nous recommandons d'adopter les pratiques de sécurité standard lors de la réalisation de cette procédure.