Une méthode simple pour l'imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d'imagerie infiltratives

L’objectif global de cette procédure est de minimiser la dégradation des images biologiques causée par les espaces aériens dans les feuilles des plantes afin d’obtenir des images plus claires des cellules vivantes à l’intérieur de la feuille. Si la feuille est montée dans un milieu d’enrobage aqueux et qu’un fluorophore est excité par un laser, de nombreux espaces d’air non remplis et des changements d’indice de réfraction dans le tissu indiqués en orange limitent l’intensité du signal en profondeur à l’intérieur du tissu dans l’image résultante. Si la feuille est plutôt montée en ligne fluoro ou PFD, l’excitation laser résultante du fluorophore est moins atténuée et permet une meilleure transmission des signaux émis.

En fin de compte, l’utilisation de la microscopie confocale laser à balayage avec le milieu de montage PFD donne des images claires des cellules vivantes à l’intérieur de la feuille de la plante à une profondeur plus du double de celle possible lorsqu’un milieu de montage aqueux est utilisé. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la fixation ou le montage des feuilles et des milieux aqueux, est qu’elle réduit la réfraction dans le méso remplissage et permet une imagerie plus précise des cellules vivantes plus profondes dans la feuille, ce qui a été rendu problématique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en science végétale, telles que le remplissage de méso, la biologie cellulaire et la signalisation in vivo, la colonisation des feuilles par des agents pathogènes et les interactions de remplissage d’agents pathogènes, bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la biologie végétale fondamentale.

Il peut également être appliqué à d’autres tissus hautement réfractifs qui sont riches en espace aérien, tels que les spirales de perspicacité ou le poumon des vertébrés. La démonstration de cette procédure sera le Dr George Littlejohn de mon laboratoire To Mount Leaf. Les échantillons en PFD commencent par la préparation d’une lame de microscope avec un joint perméable au gaz de poly diméthyl Sloane ou P-D-M-S-P-D-M-S est un polymère viscoélastique qui peut être moulé pour fournir une chambre adaptée aux exigences expérimentales.

Équilibrez le VFI avec l’air en secouant un petit volume de VFI dans une bouteille remplie d’air. Cela peut également être réalisé en faisant bouillonner l’air à travers le PFD ensuite, en décantant le PFD dans une boîte de Pétri ouverte et en faisant flotter un semis entier ou une feuille d’accise sur le liquide pendant cinq minutes. Le tissu doit devenir translucide rappelant le tissu vitrifié.

Les feuilles peuvent apparaître plus foncées ou plus claires qu’avant l’exposition au PFD, selon les conditions d’éclairage et l’âge du tissu utilisé. Enfin, remplissez la chambre PDMS avec un VFI aérodynamique équivalent et transférez soigneusement les échantillons de tissus de la boîte de Pétri d’incubation à la chambre PDMS. Scellez la diapositive avec un couvercle, un feuillet et une image.

Selon les exigences expérimentales, des feuilles de plusieurs mois ont été incubées pendant cinq minutes dans une suspension de protéine fluorescente verte recombinante ou GFP. L’inspection microscopique d’échantillons de feuilles incubées par le PFD montre que la majorité des espaces aériens sont inondés de GFP recombinant en suspension dans le PFD. La GFP est en vert, et le rouge représente la chlorophylle, la fluorescence du lotto et délits les cellules de remplissage méso.

Il est évident que la feuille est inondée lors de l’incubation par un VFI, mais qu’il peut rester des poches d’air occasionnelles. L’eau n’inonde pas la feuille dans ces conditions. Ici, une feuille opsys exprimant Vénus, une variante de YFP, qui se localise au cytosol sont incubées et montées dans l’air, l’eau ou le balayage laser PFD. La microscopie confocale des échantillons montre un avantage de la PFD par rapport à l’air et à l’eau, avec une augmentation d’environ deux fois de la profondeur de l’imagerie.

Lorsque l’on compare le VFI et l’eau Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à 10 minutes si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que le delin périphérique dissout le vernis à ongles et le téflon, mais il est compatible avec la graisse silicone. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser per fluro delin comme support de montage pour améliorer l’imagerie dans les cellules des feuilles des plantes.

N’oubliez pas que bien que le fluor delin ne soit pas toxique, nous recommandons d’adopter des pratiques de sécurité standard lors de l’exécution de cette procédure.