Une chambre simple pour l'imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

L’objectif global de ce système d’imagerie est d’utiliser la microscopie confocale à fluorescence pour observer le développement des organes végétaux sur plusieurs jours à une résolution subcellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la morphogenèse des plantes, telles que comment les cellules d’organismes multicellulaires coordonnent-elles leurs modèles de croissance et de prolifération au cours de l’organogenèse ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple à mettre en place et qu’elle ne repose pas sur les équipements spécialisés souvent utilisés dans l’imagerie time lapse, comme les systèmes de profusion.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois en lisant la publication de Littlejohn et Love, dans New Phytologist qui décrit les avantages de la perfluorodécaline pour l’imagerie dans les tissus foliaires. Pour commencer, utilisez un coupe-verre pour faire des bandes de verre de trois millimètres de large à partir d’une lame d’un millimètre d’épaisseur. Ensuite, à l’aide de colle cyanoacrylate ou de ruban adhésif double face, fixez les bandes à environ 45 millimètres de distance sur la largeur d’une nouvelle lame.

Réalisez une diapositive supplémentaire de mêmes dimensions pour servir de moule. Maintenant, fabriquez un joint de la même hauteur à partir de gomme PDMS perméable aux gaz. Mouillez une deuxième lame avec un peu d’éthanol absolu et aplatissez le PDMS sur la diapositive à la hauteur des bandes de verre.

Ensuite, mouillez une lame avec de l’éthanol absolu et coupez tout excès de PDMS. Ceci est essentiel car les outils mouillés avec de l’éthanol ne collent pas au PDMS. Ensuite, aplatissez le PDMS jusqu’à la hauteur de la bande.

Ensuite, découpez une cavité dans le PDMS qui contiendra le semis et la plaque de gélose. Pour produire une cavité de taille constante, nous utilisons un cutter fait maison sur mesure construit à partir de perspecs, mais une lame de rasoir peut être utilisée à la place. Ensuite, coupez autour du bord extérieur pour faire en sorte que le joint ait environ deux millimètres d’épaisseur.

Maintenant, sur une glissière sans le joint PDMS, posez une lamelle sur les deux bandes de verre. Ensuite, dans l’espace sous la lamelle, pipetez environ un millilitre de gélose liquéfiée chaude suffisamment pour remplir l’espace. La gélose peut contenir des composés expérimentaux d’intérêt.

Ensuite, équilibrez une partie du VFI en secouant un petit volume de VFI dans un tube. Une fois que la gélose a pris, chargez environ 200 microlitres de VFI dans le joint PDMS, mais ne le remplissez pas complètement. Retirez la lamelle de la plaque de gélose et coupez-la en une forme qui s’adaptera au puits du joint en gel PDMS.

Laissez un espace de deux à quatre millimètres entre la gélose et la paroi du joint. Ensuite, remplissez complètement la chambre avec un VFI équilibré en air. Pour imager les racines primaires gravitropes, une membrane cellulosique est utilisée comme barrière physique à la surface de la plaque de gélose.

La plaque de gélose doit également être plus molle avec 0,8 % de gélose plutôt que 1,5 % d’agar. Coupez un morceau de la membrane qui a à peu près les mêmes dimensions que le bloc de gélose. Ensuite, stérilisez-le avec de l’éthanol à 80 % et laissez-le sécher à l’air.

Une fois séchée, trempez la membrane dans un milieu de croissance liquide, puis transférez-la à la surface de la gélose. Pour commencer, placez soigneusement jusqu’à trois plants sur l’agar. Leur positionnement est crucial.

Les cotylédons et l’hypocotyle doivent pendre au-dessus du bord de la gélose, flottant dans la VFI. Il faut prévoir de l’espace entre les plantules pour permettre la croissance. Les semis peuvent être enroulés s’ils sont trop gros pour tenir dans la chambre.

Ensuite, fermez la chambre à l’aide d’une lamelle d’une épaisseur correspondant à l’objectif choisi. Appuyez doucement le long du bord pour que le contact se fasse avec les bandes de verre. À l’aide d’une autre lame de verre, appuyez doucement sur la lamelle de protection afin qu’elle repose uniformément sur les deux bandes de verre.

Ensuite, fixez la lamelle à l’aide d’un ruban chirurgical microporeux coupé en deux dans le sens de la longueur. Maintenant, laissez l’échantillon reposer pendant environ une demi-heure avant l’imagerie. Pour préparer les plants d’arabidopsis thaliana pour les chambres, stérilisez d’abord les graines avec de l’éthanol à 70 %.

Et puis plantez-les sur un milieu supplémenté. Stétafiez les graines plantées pendant deux ou quatre jours à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez les graines plantées à 22 degrés Celsius et faites-les pousser verticalement sous un cycle de lumière quotidien de 16 heures.

Pour imager les racines latérales, faites pousser les plantes pendant sept à 10 jours, puis transférez-les dans des chambres d’imagerie. Les racines latérales poussant à des taux physiologiques dans les chambres d’imagerie ont été documentées toutes les demi-heures. Les racines latérales ont également été cultivées sur des plaques de Petri standard dans le même milieu à des fins de comparaison.

Le taux de croissance des racines individuelles variait beaucoup dans les deux configurations, mais la fourchette était similaire dans les deux conditions. Dans l’ensemble, le taux de croissance augmentait avec la longueur. Le taux de croissance des plantes dans les chambres d’imagerie ou sur les plaques était indiscernable au cours des 27 premières heures de croissance.

Les deux groupes ont commencé avec la même longueur moyenne de racine latérale. Les racines latérales co-exprimant un marqueur de membrane plasmique et un marqueur de micro-tubule ont été imagées à des intervalles d’une heure dans les chambres d’imagerie. Les racines étaient très stables dans leurs positions, ce qui a permis plusieurs heures d’imagerie confocale.

Des indicateurs visuels de prolifération ont été observés tout au long de l’expérience. Dans les cellules méristématiques, les bandes de pré-prophase, les fuseaux mitotiques et les phragmoplastes ont tous pu être identifiés. Sur trois jours, la croissance des racines latérales n’était pas significativement différente dans les chambres d’imagerie par rapport aux plaques de Petri au cours des premières 48 heures, mais au bout de 72 heures, le taux de croissance moyen a chuté.

Cependant, une proportion importante de racines dans les chambres a encore poussé à des taux comparables aux racines sur plaques sur 72 heures. Une fois masterisé, deux slides peuvent être réalisés en 15 minutes si tout se passe bien. Il est possible d’utiliser ce système d’imagerie pour étudier l’effet des traitements pharmacologiques, bien que d’autres méthodes plus complexes comme les systèmes de perfusion soient nécessaires pour les expériences de lavage.

Après son développement, cette technique a fourni un moyen simple et peu coûteux de suivre les événements cellulaires qui sous-tendent la morphogenèse des plantes, en particulier pour explorer le rôle des bords cellulaires, des demandes spatiales partageant l’organogenèse dans les racines latérales d’arabidopsis thaliana.