Name: Une chambre simple pour limagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Découvrez une technique d'imagerie confocale simple pour observer le développement racinaire chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode économique permet de suivre la morphogenèse végétale à haute résolution sur plusieurs jours.

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Nous remercions le Prof. Geoffrey Wasteneys, de l&#39;Université de la Colombie-Britannique, pour la RFP-TUB6 exprimant les graines et un critique anonyme pour les corrections utiles. Nous sommes reconnaissants au Prof. Hugh Dickinson pour nous avoir informé de l&#39;utilisation du film de cellulose comme support mécanique et de John Baker pour la photographie. Ce travail a été soutenu par des bourses de recherche BBSRC BB / G013993 / 1 et BB / D004055 / 1 à IM, et un prix de formation au doctorat BBSRC et Clarendon Scholarship à CK

1. Création de la Chambre <ol><li> À l&#39;aide d&#39;un coupe-verre, découpez des bandes de 3 mm de largeur à partir de la fin d&#39;une glissière de microscope de 1 mm d&#39;épaisseur. À l&#39;aide d&#39;un super-colle cyanoacrylate ou d&#39;un ruban adhésif double face, collez ces bandes de verre à environ 45 mm d&#39;écart sur la largeur d&#39;une deuxième glissière de microscope ( Figure 1A ). Une glissière par chambre est nécessaire, plus des glissières supplémentaires pour verser des dalles de gélose (une glissière produira 2-3 dalles de gélose). Les diapositives peuvent être réutilisées. </li><li> Entre les bandes de verre, formez un joint d&#39;étanchéité identique à partir de gomme poly (diméthylsiloxane) perméable aux gaz. Placez une boule de gomme de poly (diméthylsiloxane) sur la glissière ( Figure 1B ), mouillez une deuxième glissière avec une petite quantité d&#39;éthanol 100% absolu et aplatiez la boule de gomme de poly (diméthylsiloxane) avec la deuxième glissière jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne la hauteur Des bandes de verre ( figure 1C ). <ol><li> Si nécessaire, couper l&#39;excès de poly (centime d&#39;urgence)Thylsiloxane) avec une lame de rasoir et un aplatissement répété. </li></ol></li><li> À l&#39;aide d&#39;une fraise appropriée ou d&#39;une lame de rasoir humidifiée dans de l&#39;éthanol absolu, enlever la partie intérieure de la gomme de poly (diméthylsiloxane) pour créer la cavité qui tiendra plus tard la dalle de plomb et de gélose ( figure 1D ). </li><li> Coupez soigneusement le gel avec une lame de rasoir pour créer un joint d&#39;étanchéité avec une épaisseur de paroi finale d&#39;environ 2 mm ( Figure 1E ). La perméabilité des gaz à travers une barrière en poly (diméthylsilaxane) est indépendante des épaisseurs supérieures à 50 μm 11 . </li></ol> 2. Création de la plaque de milieu de croissance solidement agarifiée <ol><li> Sur une glissière à microscopie avec deux bandes de verre, placez une lamelle (22 mm x 50 mm) de sorte qu&#39;elle repose sur les deux bandes de verre. </li><li> Pipeter le milieu de croissance Murashige et Skoog à demi-résistance fondu contenant 1% p / v de saccharose et 1,5% p / v d&#39;agar (½ MS) dans l&#39;espace résultantDessous de la lamelle jusqu&#39;à ce que ce dernier soit complètement rempli (environ 1 ml de volume total) et laissez jusqu&#39;à ce que la gélose soit réglée (environ 5 minutes). Note: Les composés pharmacologiques peuvent être administrés par la dalle de gélose en ajoutant des concentrations appropriées au milieu liquide avant que la dalle ne soit versée. Ceci a été testé avec succès pour la dexaméthasone 12 , l&#39;isoxabène, le 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), l&#39;oryzaline et la latrunculine B. </li></ol> 3 . Fin de la configuration de la chambre <ol><li> Air équilibré PFD en secouant un petit volume de PFD dans un tube 7 . Ajouter une petite quantité (environ 200 μl) de PFD équilibrée à l&#39;air dans le puits du joint de gel, mais ne pas remplir complètement la chambre. Cette PFD aidera à éviter le piégeage des bulles d&#39;air sous la dalle de gélose lorsqu&#39;elle est placée dans la chambre. </li><li> Retirez le lamelle de la plaque de gélose (à l&#39;étape 2.2 ci-dessus) et utilisez une lame de rasoir pour couper une partie deTaille et forme sier. Ensuite, placez-le dans le puit du joint de gel ( Figure 1F ). Il devrait y avoir un écart de 2-4 mm sur le joint tout autour. </li><li> Remplissez complètement la chambre avec un PFD équilibré à l&#39;air. </li><li> Placez un ou plusieurs plants de A. thaliana (jusqu&#39;à 3 plants pour une imagerie de plus de 2 à 3 jours) sur la dalle de gélose avec les cotylédons et l&#39;hypocotyle suspendu au bord, flottant dans la PFD ( Figure 1G ). </li><li> Pour obtenir des semis, stériliser des graines avec de l&#39;éthanol à 70%, planter sur milieu ½ MS complété par 1% de saccharose et 0,8% d&#39;agar, stratifier pendant 2 à 4 jours à 4 ° C et pousser sur des plaques orientées verticalement à 22 ° C dans un 16 H lumière / 8 h régime sombre. Pour imaginer les racines latérales, cultiver les plantes pendant 7 à 10 jours avant de transférer dans les chambres d&#39;imagerie. </li><li> Pour fermer la chambre, appliquez une lamelle adaptée à l&#39;optique de l&#39;objectif, en appuyant doucement sur le bord d&#39;une glissière en verre jusqu&#39;à ce que la lamelleRepose sur les deux bandes de verre ( Figure 1H ). </li><li> Fixez la lamelle avec des bandes de ruban chirurgical micropore de 1,25 cm de largeur coupées en longueur à chaque extrémité si désiré ( Figure 1I ). Permettre au spécimen de s&#39;installer pendant environ 30 minutes avant l&#39;imagerie. Cela minimise le mouvement de l&#39;échantillon lors de l&#39;imagerie. </li><li> Effectuer l&#39;imagerie avec un microscope vertical pour maintenir un substrat contrôlé pour la croissance. Utilisez les objectifs 20X / 0.7NA ou 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22(2015).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li>
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<li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li>
<li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li>
<li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La méthode présentée ici est une stratégie simple pour l&#39;imagerie confocale haute résolution du développement de racines latérales pendant deux ou trois jours. Pour des périodes allant jusqu&#39;à 48 h, aucun effet néfaste du système d&#39;imagerie sur le développement de la racine latérale n&#39;a été observé. Après 48 h, la croissance moyenne des racines latérales a commencé à ralentir, même si un sous-ensemble important des racines (37%) a continué de croître à des taux comparables à la croissance moyenne des racines sur les plaques. Par conséquent, grâce à l&#39;imagerie, un nombre suffisamment élevé de racines, les racines dont la croissance ralentit après 48 h peuvent être exclues. Les tests systématiques des chambres d&#39;imagerie n&#39;ont pas été effectués pour des périodes supérieures à 72 h, mais des stratégies alternatives sont recommandées si des périodes d&#39;imagerie étendues sont souhaitées. Les chambres d&#39;imagerie peuvent être laissées au stade du microscope en permanence, si des conditions environnementales appropriées sont fournies ou supprimées dans une installation de croissance et périodiquement retournées au microscope. Cela permet de créer de nombreuses chambres en parallèle. &lt;/ P&gt; Un avantage des chambres décrites ici est que les racines latérales sont fixées dans leur position et peuvent être imagées à l&#39;aide de lentilles d&#39;immersion à eau haute résolution. La stabilité spatiale dépend de manière critique de la concentration en gélose utilisée dans la brame de gant de support. Initialement, on a testé une gamme de concentrations différentes de 0,8% d&#39;agar à 2% d&#39;agar, ce qui révèle que les concentrations élevées dans cette gamme ont localisé des racines fixes dans l&#39;espace, mais la croissance des racines a ralenti rapidement et certaines racines ont montré des signes de contraintes mécaniques, y compris une réduction de l&#39;allongement cellulaire. En revanche, les faibles concentrations d&#39;agar n&#39;ont pas fourni le support requis et les racines dérivées dans x, y et z pendant l&#39;imagerie. La dalle de gélose optimale de 1,5% corrige la position de l&#39;échantillon sans effets mécaniques défavorables. Dans ces conditions, après la décantation dans les 30 premières minutes environ, les racines sont stables pendant plusieurs heures, ce qui permet une acquisition de données pendant la nuit. Lors de l&#39;acquisition de données 4D, les plages de pile z étaient typiquement bRayonné de 5 à 10 μm supplémentaires, mais il s&#39;agissait principalement de supporter une croissance hors-plan des racines latérales plutôt que de la dérive z ou de l&#39;oscillation. Bien que la concentration en gélose standard offre une certaine résistance à la pénétration, les racines croit gravitropiquement finiront par pénétrer dans la gélose. Cependant, grâce à une modification mineure de la chambre d&#39;imagerie, la croissance des racines pourrait être maintenue parallèlement à la lamelle, ce qui permet d&#39;imaginer des racines latérales plus anciennes et des racines primaires. En outre, la chambre d&#39;imagerie basique pourrait facilement être personnalisée pour les hypocotyles. Les hypocotyls flottent plus librement dans ce système, de sorte que le support de l&#39;axe z pour l&#39;acquisition de l&#39;image a été augmenté habituellement à environ 20 μm. Dans cette étude, un microscope vertical a été utilisé partout, ce qui a permis de contrôler les propriétés du substrat. La chambre d&#39;imagerie peut être adaptable aux configurations de microscope inversé, mais l&#39;influence dépendante du temps de la lamelle rigide sur les organes d&#39;interception devra être évaluée. </p&gt; Littlejohn et ses collègues ont souligné que le PFD lui-même ne dissout pas facilement les molécules biologiques, ce qui signifie qu&#39;il ne peut pas être utilisé directement pour la distribution de composés pharmacologiques 7 . Ce problème a été surmonté en fournissant de tels composés à travers la dalle de milieu de croissance solidifié sur laquelle repose la dalle de gélose. Alors que les systèmes de perfusion resteront la méthode de choix pour les expériences de lavage, la chambre d&#39;imagerie a été utilisée avec succès pour l&#39;administration de dexaméthasone 12 et d&#39;autres composés. Une note, bien que cet article soit en préparation von Wagenheim et ses collègues 18 ont décrit une chambre pour l&#39;imagerie du développement de la racine latérale à l&#39;aide d&#39;une microscopie à la lumière.

Pour étudier les processus cellulaires et subcellulaires qui sous-tendent le développement de l&#39;usine, il existe une demande croissante de stratégies d&#39;imagerie à long terme à haute résolution à long terme. Un défi majeur dans de telles expériences d&#39;imagerie est le maintien de conditions physiologiques, y compris un échange gazeux suffisant, plus une réserve d&#39;eau et de nutriments 1 , 2 , 3 . Pour utiliser les objectifs avec des ouvertures numériques élevées pour une résolution optique optimale, les spécimens doivent être positionnés à proximité et orientés parallèlement à la lamelle. Le mouvement dans les directions x, y et z devrait idéalement être minimal lors de l&#39;imagerie. Alors que les semis sont souvent montés dans une solution aqueuse ou aqueuse pour une imagerie à court terme, l&#39;eau a une faible capacité à dissoudre CO 2 et O 2 (1,54 mg / mL et 0,04 mg / mL, respectivement à 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , ce qui rendIl est inadapté à des expériences prolongées. Les systèmes de perfusion qui maintiennent des niveaux constants d&#39;oxygène et de nutriments sont une solution à ce problème et ont été développés à la fois pour la microscopie de balayage laser confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 et la microscopie à lumière (LSM) 5 . Des systèmes comme le RootChip 2 et le RootArray 3 ont été conçus spécifiquement pour l&#39;imagerie temporelle de développement de racines et impliquent la germination de graines dans un dispositif multi-spécimen personnalisé. Ces dispositions assurent une perturbation mécanique minimale et sont conçues pour l&#39;analyse parallèle de semences multiples, mais ne sont pas optimisées pour l&#39;imagerie des structures subcellulaires. Calder et ses collègues ont conçu une chambre d&#39;imagerie à perfusion plus compliquée optimisée pour l&#39;imagerie de structures subcellulaires dans lesquelles l&#39;échantillon est maintenu en position par un maillagePour permettre l&#39;utilisation de lentilles d&#39;immersion à grand grossissement 1 . Voici une solution alternative et simple à ce problème qui ne repose pas sur les systèmes de perfusion, mais utilise la perfluorodécaline (PFD), un perfluorocarbone qui a récemment gagné en popularité en tant que support de base pour l&#39;image d&#39; Arabidopsis 6 , 7 , 8 . Dans de telles applications, la capacité élevée de PFD pour la dissolution de CO 2 et O 2 (1,9 g / mL pour O 2 dans PFD par rapport à 0,04 mg / mL dans l&#39;eau) 9 permet l&#39;échange gazeux par le tissu immergé. En outre, le PFD n&#39;est pas fluorescent et son indice de réfraction (1.313) est comparable à celui de l&#39;eau (1.333) et est plus proche de celui du cytosol (~ 1.4) que l&#39;air (1.000) 6 . On a signalé que les hydrocarbures perflucides avaient un effet physiologique minimal sur une variété de plantes et de végétauxProblèmes 6 , avec des graines de radis gerrissant facilement lorsqu&#39;elles sont immergées dans la PFD et présentent une croissance et un développement normaux pendant au moins deux jours complets lorsqu&#39;ils sont alimentés en eau 10 . Des observations similaires ont été faites pour germer des graines d&#39; Arabidopsis 6 . Basé sur la diffusion estimée de Raman pour imaginer directement la distribution de PFD dans les tissus de feuilles d&#39; Arabidopsis après l&#39;infiltration, Littlejohn et ses collègues concluent que le PFD n&#39;est probablement pas absorbé par les cellules vivantes 8 . Le PFD a déjà été utilisé principalement pour l&#39;image des tissus aériens, où il augmente considérablement la profondeur d&#39;imagerie car il infiltrait facilement les espaces d&#39;air en raison de sa faible tension superficielle 6 . Ici, le PFD est adopté pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement de racines latérales. Dans cette configuration, une ou plusieurs plants sont placés sur une plaque de milieu de croissance solidifiée avec de l&#39;agar et immergée dans PFD. La PFD permet à gDans la chambre d&#39;imagerie, empêchant l&#39;anoxie. Le PFD est très volatil, de sorte qu&#39;il est retenu par un joint d&#39;étanchéité de gomme de poly (diméthylsiloxane) qui a également une perméabilité élevée aux gaz (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 pour le CO 2 ) 11 . Les nutriments et l&#39;eau sont fournis par la dalle de milieu solidifié avec de l&#39;agar. En même temps, cette dalle de gélose appuie doucement la racine contre la lamelle, fixant ainsi sa position relative dans la chambre d&#39;imagerie et permettant l&#39;utilisation de lentilles d&#39;immersion à eau haute résolution. En outre, la dalle de gélose peut être utilisée pour administrer une gamme de traitements pharmacologiques, y compris la dexaméthasone, l&#39;oryzaline et l&#39;isoxabène. Les chambres d&#39;imagerie peuvent être assemblées en grand nombre à partir de lames de microscopie standard en utilisant un équipement minimal. Les chambres d&#39;imagerie ont été développées et caractérisées pour étudier le développement de la racine latérale, mais adaptées à l&#39;imagerie d&#39;autres organes de semis tels que des conseils de racines primaires etHypocotyls.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodécaline</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, Royaume-Uni</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(diméthylsiloxane) gomme&nbsp ;</td><td>Approvisionnement biologique de la Caroline ; Burlington, NC, USA</td><td>Article # 132700</td> Lames de microscope à <td>cavité en gel d’observation Carolina</td></tr><tr><td></td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&nbsp ;UK</td><td>10118-600</td> La <td>cavité a un diamètre de 13 mm et une profondeur de 0,2 à 0,4 mm. N’importe quelle lame de cavité suffira probablement</td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>N’importe quelle « super-colle » adaptée au verre suffira probablement</td></tr><tr><td>Membrane cellulosique cellophane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, Royaume-Uni</td><td></td><td>Film cellulosique 325P ; disque de 80 mm</td></tr></tbody></table>

une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Plusieurs aspects du développement des plantes, comme la morphogenèse de la racine latérale, se produisent sur plusieurs périodes de temps. Pour étudier les processus sous-cellulaires et subcellulaires sous-jacents, des stratégies de microscopie temporelle à haute résolution qui préservent les conditions physiologiques sont nécessaires. Les tissus végétaux doivent avoir un approvisionnement en nutriments et en eau adéquat avec un échange gazeux soutenu, mais, lorsqu&#39;ils sont immergés et immobilisés sous une lamelle, ils sont particulièrement sensibles à l&#39;anoxie. Une stratégie qui a été utilisée avec succès est l&#39;utilisation d&#39;un système de perfusion pour maintenir un apport constant d&#39;oxygène et de nutriments. Cependant, de tels arrangements peuvent être compliqués, encombrants et nécessitent un équipement spécialisé. Présenté ici, il existe une stratégie alternative pour un système d&#39;imagerie simple utilisant la perfluorodécaline comme milieu d&#39;immersion. Ce système est facile à installer, nécessite un équipement minimal et est facilement monté sur une étape de microscope, permettant de configurer et d&#39;imaginer plusieurs chambres d&#39;imagerie au pairAllel. Dans ce système, les taux de croissance de la racine latérale sont indiscernables des taux de croissance dans des conditions standard sur les plaques d&#39;agar pendant les deux premiers jours, et la croissance de la racine latérale se poursuit à des taux réduits pendant au moins un autre jour. Les tissus végétaux sont alimentés en nutriments par une dalle de gélose qui peut également être utilisée pour administrer une gamme de composés pharmacologiques. Le système a été établi pour surveiller le développement de la racine latérale, mais est facilement adaptable à l&#39;image d&#39;autres organes végétaux tels que les hypocotyles et les racines primaires.

Les racines latérales se développent à des taux physiologiques dans les chambres d&#39;imagerie. Les longueurs de racines latérales des plantes dans les chambres d&#39;imagerie ont été mesurées à intervalles horaires ( Figure 2A , gauche, Film 1, n = 23) et les taux de croissance ont été comparés à ceux des racines latérales cultivées sur des plaques de Petri standard contenant le même milieu agar-solidifié ( Figure 2A , à droite, film 2, n = 23). Les taux de croissance peuvent varier considérablement entre les racines latérales, la longueur de la racine étant un facteur déterminant en raison des zones de croissance et de prolifération de plus en plus longues 13 . Par conséquent, des ensembles de racines latérales ont été sélectionnés pour représenter des racines de différentes longueurs initiales (allant de 50 μm à 1150 μm) à la fois dans la chambre d&#39;imagerie et dans la plaque de gélose. Longueur moyenne de la racine latérale au début de l&#39;expérienceÉtait similaire dans chaque ensemble (439 et 442 μm pour les chambres et les plaques d&#39;imagerie, respectivement). Dans l&#39;intervalle de temps analysé de 27 h, la croissance de la racine latérale était approximativement linéaire dans les chambres d&#39;imagerie et sur les plaques, avec un taux de croissance moyen de 52 μm / h (R 2 = 0,997) sur les plaques et de 51 μm / h dans les chambres d&#39;imagerie ( R 2 = 0,993) ( figure 2B ). Les taux de croissance des racines latérales individuelles sont très variables à la fois sur les plaques et dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2C ), allant de 17 μm / h à 82 μm / h dans les chambres d&#39;imagerie et de 13 μm / h à 87 μm / h sur les plaques. Alors que les taux de croissance augmentaient généralement avec la longueur de la racine, les taux de croissance variaient encore sensiblement entre des racines de longueur similaire, mais la variance était similaire dans les chambres d&#39;imagerie et sur les plaques. Les racines latérales prolifèrent dans les chambres d&#39;imagerie et peuvent être imagées à l&#39;aide deGh objectifs d&#39;ouverture numérique. Les racines latérales qui coexistent le marqueur de la membrane plasma NPSN12-YFP 14 et le marqueur des microtubules UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 ont été imagés par CLSM 10 à des intervalles de 1 h pour documenter le comportement des microtubules lors de la prolifération cellulaire dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2D , film 3). Dans ces chambres, les racines latérales étaient très stables dans leur position sur les axes x, y et z, ce qui permet d&#39;acquérir des piles confocales continues en plusieurs heures. Les cellules méristématiques proliféraient constamment, comme en témoigne la formation de bandes préprophasiques ( figure 2D , flèches vertes), les broches mitotiques ( figure 2D , flèches blanches) et les phragmoplastes ( figure 2D , flèches bleues). Comme pour les semis sur des assiettes de Petri,Cellules de racine complètement allongées dans les cheveux radiculaires initiés par les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2A , Figure 2D , têtes de flèche), indiquant en outre que le développement s&#39;est déroulé comme prévu dans les chambres d&#39;imagerie. Pour fournir un large champ de vision, les images de la figure 2D ont été obtenues avec un objectif de 20x / 0.7 NA. Il a également été possible d&#39;obtenir des images haute résolution de racines latérales en utilisant un objectif d&#39;immersion en eau NA 63x / 1,2 NA à grande ouverture numérique ( Figure 2E ). La croissance latérale de la racine est maintenue dans les chambres d&#39;imagerie jusqu&#39;à trois jours. Pour déterminer combien de temps les chambres d&#39;imagerie pourraient soutenir la croissance de la racine latérale à des taux physiologiques, la longueur de racine latérale dans les chambres d&#39;imagerie (n = 27) et sur les plaques (n = 33) a été quantifiée à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h. Les racines choSen étaient inférieurs à 200 μm à 0 h, avec une longueur de racine latérale moyenne de 117 μm dans les chambres d&#39;imagerie et 121 μm sur les plaques. Comme les racines plus courtes se développent plus lentement en moyenne ( figure 2C ), elles se sont développées moins souvent sur le bord de la plaque de gélose et ont été plus faciles à imaginer. La croissance moyenne de toutes les racines latérales n&#39;a pas été significativement différente dans les chambres d&#39;imagerie par rapport aux plaques de Petri dans les premières 48 h ( figure 3A ). Cependant, la croissance moyenne a été considérablement réduite entre 48 h et 72 h ( figure 3A ). Alors que les taux de croissance semblent généralement ralentir dans les chambres d&#39;imagerie après 48 h, les taux de croissance entre les individus restent très variables ( figure 3B , 3C ), ce qui signifie qu&#39;il existe un sous-ensemble important de racines latérales qui se développent à des taux comparables sur les plaques et dans les chambres Sur la période de croissance complète de 72 h. 23 des 33 racines latérales cultivéesSur les plaques (69,7%) atteignent une longueur dans un écart type de la longueur moyenne à 72 h (entre 927 et 3,163 μm, figure 3B , rouge). 10 des 27 (37,0%) des racines latérales dans les chambres d&#39;imagerie atteignent une longueur dans cet intervalle ( Figure 3B , rouge). Les chambres d&#39;imagerie peuvent facilement être adaptées pour les racines latérales plus anciennes, les racines primaires et les hypocotyles . Une des limites de la conception de la chambre d&#39;imagerie originale était que, bien que la dalle de gélose rigide fournissait une certaine résistance mécanique, les racines gravitropiquement croisées pénétraient finalement dans la dalle de gélose, ce qui entraînait une perte de qualité d&#39;image ( figure 4B ) et une croissance supérieure à la distance de travail de NA élevée Les lentilles, même l&#39;objectif relativement long de travail (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2. Les jeunes racines latérales manquent de statolithLes cellules de columelles requises pour le gravitropisme 17 , elles ont d&#39;abord augmenté parallèlement à la lamelle dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2E ). À mesure qu&#39;ils se développent et que les columelles et les statolithes se forment, les racines latérales présentent un gravitropisme positif croissant, tandis que les racines primaires présentent une forte réponse gravitrice à partir de la germination. Cela restreint à quelques heures la période pendant laquelle les racines primaires peuvent être imagées et limite sérieusement la longueur de départ des racines latérales qui peuvent être imagées en continu pendant 48 h ou plus. Pour surmonter cette limitation, la chambre a été modifiée de telle sorte que la croissance soit maintenue parallèlement à la lamelle coulée par une membrane de cellophane cellulosique qui agit comme une barrière de pénétration à la surface de la dalle de gélose ( figure 4A ). Les premières tentatives utilisant une dalle de gélose à 1,5% ont entraîné une réduction de la croissance des racines dans les 24 premières heures, peut-être par des contraintes mécaniques. Des concentrations d&#39;agar plus faibles dans la dalle ont été testées etD il a été constaté que dans les chambres avec une dalle contenant 0,8% d&#39;agar et de film de cellulose, les taux de croissance des racines latérales jeunes ne différaient pas de manière significative par rapport aux taux de croissance dans les chambres conventionnelles pendant les 48 premières heures. Pendant 0-24 h, la croissance moyenne de la racine dans les chambres de cellulose et les chambres conventionnelles était de 242 μm et 262 μm respectivement (p = 0.78 T-Test de l&#39;élève) et 24-48 h était de 330 μm et 355 μm 1 respectivement (p = 0,67 Student&#39;s T-test); N = 12 et n = 11, respectivement. Cet arrangement empêchait efficacement les racines latérales de s&#39;éloigner de la lamelle, de la gélose et permettait également l&#39;imagerie des racines primaires jusqu&#39;à 48 h ( figure 4C ). Pour tester si les chambres d&#39;imagerie pouvaient être adaptées pour des organes autres que des racines, on choisit les hypocotyls Arabidopsis. Les hypocotyls sont sensiblement plus épais que les racines, alors dans la chambre d&#39;imagerie classique, le plus haut cLes coups ont été pressés contre la lamelle, ce qui a entraîné une déformation. Une autre conception a donc été développée à l&#39;aide de diapositives à cavité contenant une dépression ovale dans leur centre ( Figure 4D ). Dans cette configuration, une plaque d&#39;agar de 1 mm d&#39;épaisseur (préparée comme au 2.2 ci-dessus) a été positionnée avec une extrémité faisant saillie de quelques mm dans la cavité coulissante ( figure 4D ). Les hypocotyls ont été positionnés au-dessus de la cavité dans la glissière alors que la racine était positionnée au-dessus de la partie horizontale. Cela a assuré que le plant a été fixé dans l&#39;espace par la racine, mais l&#39;hypocotyle n&#39;a pas été écrasé. Bien que les taux de croissance dans les chambres par rapport aux plaques n&#39;aient pas été systématiquement quantifiés, les hypocotyles dans les chambres d&#39;imagerie présentaient la vague de croissance longitudinale bien décrite migrant l&#39;hypocotyle ( Figure 4E , 4F ) 16 . <img alt="Figure 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1 : Assemblage d&#39;une chambre d&#39;imagerie. Tous les détails sont décrits dans le texte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figure 2 : Les racines latérales poussent dans des conditions physiologiques dans les chambres d&#39;imagerie. ( A ) Développement de la racine latérale d&#39;Arabidopsis dans une chambre d&#39;imagerie (gauche) et sur une plaque (à droite) sur 25 h (lumière constante, incubation horizontale, imagerie simultanée). Barres d&#39;échelle = 200 μm. ( B ) Plot montrant des longueurs de racines latérales supérieures à 27 h (mesurées en 1 h), de racines latérales comme indiqué dans ( A ). IndividRacines tracées en gris (n = 23 pour plaques et chambres d&#39;imagerie), longueur moyenne en cercles rouges. Barres d&#39;erreur = 1 SD. La ligne rouge est ajustée linéairement par des longueurs moyennes. ( C ) Plot montrant le taux de croissance moyen pour toutes les racines latérales indiquées en ( B ) par rapport à leur longueur initiale. ( D ) Projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D acquises à partir de racines latérales exprimant NPSN12-YFP et RFP-TUB6 à des points de temps consécutifs. Inser: grossissement de la zone en boîte. Flèches vertes: bandes préprophasiques; Flèches blanches: broches mitotiques; Flèches bleues: phragmoplastes; Pointes de flèche: les cheveux racines. ( E ) Projections d&#39;intensité maximale des images haute résolution acquises à partir d&#39;une racine latérale jeune de la ligne transgénique montrée en ( D ) en utilisant un objectif 63X / 1.2 NA et un prélèvement Nyquist (dimensions des pixels de 77 nm x 77 nm) à 0 h et 16 H; Les astérisques localisent des cellules identiques à chaque point de temps; La flèche indique une cellule qui se divise entre 0h et 16 h.Barres d&#39;échelle = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figure 3 : Développement de racines latérales à long terme dans les chambres d&#39;imagerie. ( A ) Parcelle montrant la croissance absolue moyenne de la racine dans trois intervalles consécutifs de 24 h dans les chambres d&#39;imagerie par rapport aux plaques. Ns indique p&gt; 0,05; *** indique p &lt;0,001 (test t d&#39;étudiant). N = 33 (plaques) et n = 27 (chambres d&#39;imagerie). ( B ) Tracer les longueurs de racines latérales à des points de temps consécutifs sur toutes les racines utilisées dans (A). Rouge: toutes les racines latérales avec une longueur finale dans 1 SD de la moyenne de toutes les racines latérales cultivées sur plaques (entre 927 et 3163 μm). ( C ) Maximum enProjections de tension des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans les racines latérales, acquises à des moments consécutifs de plus de 72 h. Barres d&#39;échelle = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figure 4 : Les chambres d&#39;imagerie peuvent être adaptées pour d&#39;autres organes végétaux. ( A - C ) Adaptation de la chambre d &#39;imagerie pour les racines primaires. ( A ) Schéma de conception de chambre d&#39;imagerie. Ceci est identique à la conception standard ( Figure 1 ) en dehors de deux modifications: la dalle moyenne MS contient 0,8% d&#39;agar au lieu de 1,5% d&#39;agar, et un film de cellulose (rouge) est placé entre la gélose et la plante pour éviter la croissanceDans la gélose. ( B ) les projections de l&#39;intensité maximale XY (supérieure) et XZ (bas) des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans la racine primaire d&#39;un plant de 7 jours d&#39;imagerie à 0 h et 48 h dans une image conventionnelle chambre. Notez que la racine se développe dans la gélose en raison de sa réponse gravitrice. ( C ) XY (haut) et XZ (en bas) des projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans la racine primaire d&#39;un grappin de sept jours reproduit à 0 h et 48 h dans l&#39;imagerie Chambre avec film de cellulose. Avant l&#39;application, le film de cellulose a été stérilisé dans de l&#39;éthanol à 80% et trempé dans un milieu liquide ½ MS. Notez que la croissance gravitrice de la racine dans la gélose est empêchée. ( D - F ) Adaptation de chambre d &#39;imagerie pour hypocotyls. ( D ) Schéma montrant la conception de la chambre d&#39;imagerie hypocotylique. Un joint de gomme poly (diméthylsiloxane) (gris) est fabriquéRouge sur une glissière cavité entre deux bandes de verre (jaune). Une plaque de 1,5% d&#39;agar d&#39;épaisseur uniforme (beige) est placée sur la glissière, atteignant partiellement dans la cavité. La chambre est remplie de PFD (bleu). Des semelles sont placées sur la dalle de gélose de telle sorte que l&#39;hypocotyle occupe la région en pente descendante de la plaque de gélose dans la cavité tandis que la racine est positionnée sur la partie horizontale de la gélose. La chambre est fermée avec une lamelle. ( E ) Projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans un hypocotyle d&#39;un plant de deux jours reproduit pendant 48 heures à des moments consécutifs. ( F ) Croissance longitudinale en deux intervalles de temps consécutifs de cellules individuelles le long de l&#39;axe basal à apical (positions relatives à 0 h le long de l&#39;axe représenté par E) de l&#39;hypocotyl montré dans ( E ). Notez la vague de croissance précédemment décrite en migration de l&#39;hypocotyle 16 . Barres d&#39;échelle = 100 μM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce film.</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Movie 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce film.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Film 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">S&#39;il vous plaît c</a>Lèche ici pour télécharger ce film.

Présenté ici, il s&#39;agit d&#39;une technique simple pour l&#39;imagerie confocale temporelle à haute résolution du développement de la racine et de l&#39;hypocotylie pendant jusqu&#39;à 3 jours en utilisant des objectifs d&#39;ouverture numérique élevée et la perfluorodécaline comme milieu d&#39;immersion.

Une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

L'objectif général de ce système d'imagerie est d'utiliser la microscopie à fluorescence confocale pour observer le développement d'organes végétaux sur plusieurs jours avec une résolution subcellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en morphogenèse végétale, telles que : comment les cellules d'organismes multicellulaires coordonnent-elles leurs schémas de croissance et de prolifération durant l'organogenèse ? Le principal avantage de cette technique est sa simplicité de mise en place et son indépendance par rapport aux équipements spécialisés souvent utilisés en imagerie temporelle, comme les systèmes de perfusion.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue en lisant la publication de Littlejohn et Love, parue dans New Phytologist, qui décrit les avantages du décaline perfluoré pour l'imagerie au sein des tissus foliaires. Commencez par utiliser un coupe-verre pour fabriquer des bandes de verre de trois millimètres de large à partir d'une lame d'un millimètre d'épaisseur. Ensuite, à l'aide de colle cyanoacrylée ou de ruban adhésif double face, fixez les bandes à environ 45 millimètres d'intervalle, transversalement sur une nouvelle lame.Préparez une lame supplémentaire aux mêmes dimensions pour servir de moule. Confectionnez maintenant un joint de même hauteur en caoutchouc de PDMS perméable aux gaz. Humidifiez une seconde lame avec un peu d'éthanol absolu et appliquez le PDMS sur la lame en l'aplatissant jusqu'à la hauteur des bandes de verre.Ensuite, humidifiez une lame avec de l'éthanol absolu et retirez l'excès de PDMS. Cette étape est cruciale, car les outils imprégnés d'éthanol n'adhèrent pas au PDMS. Puis, aplatissez à nouveau le PDMS jusqu'à atteindre la hauteur du ruban.Ensuite, découpez une cavité dans le PDMS qui accueillera le plantule et le bloc d'agar. Pour obtenir une cavité de taille uniforme, nous utilisons un couteau sur mesure fabriqué maison à partir de perspecs, mais un scalpel peut être utilisé à la place. Puis, taillez les bords extérieurs afin que le joint ait une épaisseur d'environ deux millimètres.Maintenant, sur une lame sans joint en PDMS, placez un lamelle sur les deux bandes de verre. Ensuite, dans l'espace situé sous la lamelle, ajoutez environ un millilitre de milieu gélosé tiède et liquéfié, suffisamment pour remplir l'espace. Ce milieu peut contenir des composés expérimentaux d'intérêt.Ensuite, équilibrer l’air avec un PFD en agitant un petit volume de PFD dans un tube. Une fois que l’agar a gélifié, charger environ 200 microlitres de PFD dans le joint en PDMS, sans toutefois le remplir complètement. Retirer la lame de couverture du bloc d’agar et la découper en une forme adaptée à la cavité du joint en gel de PDMS.Laisser un espace de deux à quatre millimètres entre l'agar et la paroi du joint. Ensuite, remplir complètement la chambre avec du PFD équilibré à l'air. Pour imager les racines principales gravitropiques, une membrane cellulosique est utilisée comme barrière physique à la surface de la tranche d'agar.La lame d'agar doit également être plus molle, avec 0,8 % d'agar plutôt que 1,5 % d'agar. Découpez un morceau de membrane ayant approximativement les mêmes dimensions que le bloc d'agar. Ensuite, stérilisez-le avec de l'éthanol à 80 % et laissez sécher à l'air. Une fois sèche, imbiber la membrane dans un milieu de croissance liquide, puis la transférer à la surface de l'agar. Pour commencer, déposer délicatement jusqu'à trois plantules sur l'agar. Leur positionnement est essentiel.Les cotylédons et l'hypocotyle doivent dépasser du bord de l'agar, en flottant dans le PFD. Un espace suffisant doit être prévu entre les plantules afin de permettre leur croissance. Les plantules peuvent être recourbées si elles sont trop grandes pour tenir dans la chambre.Ensuite, fermez la chambre à l’aide d’une lamelle dont l’épaisseur correspond à l’objectif choisi. Appuyez doucement le long du bord afin d’établir le contact avec les bandes de verre. Utilisez une autre lame de verre pour appuyer délicatement sur la lamelle afin qu’elle repose uniformément sur les deux bandes de verre.Ensuite, fixez la lame à couvrir à l'aide d'un ruban chirurgical microporeux coupé en deux dans le sens de la longueur. Laissez ensuite l'échantillon se déposer pendant environ une demi-heure avant l'observation au microscope. Pour préparer les plantules d'Arabidopsis thaliana dans les chambres, stérilisez d'abord les graines avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, les planter sur un milieu supplémenté. Stratifier les graines semées pendant deux ou quatre jours à quatre degrés Celsius. Puis, transférer les graines semées à 22 degrés Celsius et les faire pousser en orientation verticale sous un cycle lumineux quotidien de 16 heures.Pour imager les racines latérales, faire pousser les plantes pendant sept à dix jours, puis les transférer dans des chambres d'imagerie. Les racines latérales en croissance à des taux physiologiques dans les chambres d'imagerie ont été documentées toutes les demi-heures. Des racines latérales ont également été cultivées sur des boîtes de Pétri standard dans le même milieu à des fins de comparaison.Le taux de croissance des racines individuelles a varié considérablement dans les deux dispositifs, mais l'amplitude était similaire dans chaque condition. Dans l'ensemble, le taux de croissance augmentait avec la longueur. Le taux de croissance des plantes dans les chambres d'imagerie ou sur les boîtes était indiscernable durant les 27 premières heures de croissance.Les deux groupes ont commencé avec la même longueur moyenne de racines latérales. Des racines latérales coexprimant un marqueur de membrane plasmique et un marqueur de microtubules ont été observées à des intervalles d'une heure dans les chambres d'imagerie. Les racines étaient très stables dans leur position, permettant plusieurs heures d'imagerie confocale.Des indicateurs visuels de prolifération ont été observés tout au long de l'expérience. Dans les cellules méristématiques, les bandes de préprophase, les fuseaux mitotiques et les fragmoplastes ont tous pu être identifiés. Sur une période de trois jours, la croissance des racines latérales n'a pas été significativement différente dans les chambres d'observation par rapport aux boîtes de Pétri durant les 48 premières heures, mais au bout de 72 heures, la vitesse moyenne de croissance a diminué.Cependant, une proportion significative des racines dans les chambres a encore poussé à des vitesses comparables à celles des racines sur les boîtes pendant 72 heures. Une fois maîtrisée, la préparation de deux lames peut être réalisée en 15 minutes si tout se déroule sans problème. Il est possible d'utiliser ce système d'imagerie pour étudier l'effet de traitements pharmacologiques, bien que d'autres méthodes plus complexes, comme les systèmes de perfusion, soient nécessaires pour les expériences de lavage.Après son développement, cette technique a fourni un moyen économique et simple de suivre les événements cellulaires sous-jacents à la morphogenèse végétale, en particulier pour explorer le rôle des bords cellulaires et des contraintes spatiales dans la partage de l'organogenèse au niveau des racines latérales d'arabidopsis thaliana.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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