Name: Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez la mesure quantitative des activités des éléments cis-régulateurs chez Drosophila melanogaster. Cette méthode utilise des lignées transgéniques avec des gènes rapporteurs fluorescents pour analyser la régulation génique.

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Nous remercions: Nicolas Gompel et Benjamin Prud&#39;homme pour leurs contributions à l&#39;élaboration de ce protocole; Melissa Williams et quatre examinateurs anonymes pour leurs commentaires sur le manuscrit; l&#39;Université de Dayton Graduate School de bourses de recherche pour la guerre, et l&#39;Université de Dayton Biologie Ministère et l&#39;Institut de recherche (UDRI) pour soutenir la recherche pour TMW. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association 11BGIA7280000 Subvention à TMW.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

éléments cis-régulateurs coder le programme génomique qui spécifie l&#39;expression des gènes et donc le processus de développement 1, et sont des endroits bien visibles pour les deux mutations sous-jacentes évolution morphologique 2-4 et variation phénotypique des traits humains 5,6,19. En dépit de cette importance, la logique réglementaire pour CRE restent mal compris. Une raison importante de ce déficit a été la compréhension de l&#39;absence de méthodes appropriées pour comp...

comparaison quantitative des cis-regulatory element (cre) activités dans transgéniques drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Profils d&#39;expression génique sont spécifiées par l&#39;élément cis-régulatrices (CRE) des séquences, qui sont aussi appelés rehausseurs ou cis-régulation des modules. Un classique de la CRE possède un arrangement de sites de liaison pour plusieurs protéines facteur de transcription qui confèrent une logique réglementaire précisant quand, où et à quel niveau le gène réglementé (s) est exprimée. L&#39;ensemble complet des CRE au sein d&#39;un génome animal encode le programme de l&#39;organisme pour le développement 1 et empiriques ainsi que des études théoriques indiquent que des mutations dans CRE a joué un rôle prépondérant dans l&#39;évolution morphologique 2-4. Par ailleurs, le génome humain études d&#39;association indiquent que la variation génétique à Cres contribuer sensiblement à la variation phénotypique 5,6. Ainsi, la compréhension logique de la réglementation et la façon dont les mutations affectent telle logique est un objectif central de la génétique. Transgènes Reporter fournir une méthode puissante pour étudier la fonction in vivotion de Cres. Voici une séquence connue ou suspectée CRE est couplé à promoteur hétérologue et des séquences codant pour un gène rapporteur codant pour une protéine facilement observables. Quand un transgène rapporteur est inséré dans un organisme hôte, l&#39;activité de la CRE devient visible sous la forme de la protéine rapporteur codée. Transgénèse médié par la P-élément dans l&#39;espèce de mouche drosophile (D.) melanogaster 7 a été utilisé pendant des décennies pour introduire des transgènes rapporteur dans cet organisme modèle, bien que le placement en génomique des transgènes est aléatoire. Ainsi, l&#39;activité du gène rapporteur est fortement influencée par la chromatine des gènes et l&#39;environnement locaux, limitant les comparaisons qualitatives CRE pour être. Ces dernières années, le système d&#39;intégration basé PhiC31 a été adapté pour une utilisation chez D. melanogaster pour insérer des transgènes dans spécifiques de 80 à 10 sites de débarquement du génome. Cette capacité a fait de la mesure quantitative des gènes et, pertinent ici, la CRE d&#39;activité 11-13 Feasible. La production de mouches des fruits transgéniques peuvent être externalisées, notamment PhiC31 intégration basée, éliminant le besoin d&#39;acheter du matériel coûteux et / ou avez une maîtrise spécialisée dans l&#39;injection des protocoles transgène. Ici, nous présentons un protocole général d&#39;évaluer quantitativement une activité de la CRE, et de montrer comment cette approche peut être utilisée pour mesurer les effets d&#39;une mutation introduite sur l&#39;activité de la CRE une et de comparer les activités des CRE orthologues. Bien que les exemples donnés sont pour une activité de la CRE pendant la métamorphose mouche des fruits, l&#39;approche peut être appliquée à d&#39;autres stades de développement, les espèces de mouches des fruits, ou des organismes modèles. Finalement, une utilisation plus généralisée de cette approche de la CRE d&#39;étude devrait faire progresser la compréhension de la logique réglementaire et comment la logique peut varier et évoluer.

Variation phénotypique des traits peut résulter de mutations dans le cis-régulation élément (CRE) des séquences que les modèles de contrôle l&#39;expression des gènes. Méthodes pour une utilisation dérivée de Drosophila melanogaster peuvent comparer quantitativement les niveaux de la répartition spatiale et temporelle de l&#39;expression génique médiée par des variantes de la CRE modifiés ou naturelle.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Les profils d'expression génique sont spécifiés par des séquences d'éléments de régulation cis (CRE), également appelées amplificateurs (enhancers) ou modules de régulation cis. Un CRE typique...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer quantitativement les activités régulatrices des éléments régulateurs en *cis* ou CRE actifs durant le développement métamorphique de *Drosophila melanogaster*. Commencez par des méthodes d'intégration site-spécifique afin de générer des lignées de CRE intégrés transgéniquement comme transgènes rapporteurs. À l’aide d’un microscope stéréo, obtenez des spécimens transgéniques au stade de développement approprié.Retirez les spécimens du pub externe et montez-les sur une lame de microscope en verre. Faites ensuite glisser l'échantillon pour enregistrer le niveau et le motif d'expression de la protéine rapporteur fluorescente dans des échantillons entiers par analyse microscopique confocale. Enfin, quantifiez le niveau d'expression de la protéine rapporteur fluorescente pour les images confocales enregistrées à l'aide de l'outil logiciel ImageJ.Ces résultats attribuent un niveau d'activité régulatoire génique à l'élément régulateur auxiliaire et facilitent des études comparatives supplémentaires sur l'expression génique portant sur des versions modifiées des CRE. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés et intéresse

quantitative-comparison-cis-regulatory-element-cre-activities

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l'ADN, la dissection de la rétine, l'électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Drosophila melanogaster est un organisme modèle exceptionnel pour l’étude du système immunitaire inné et des conséquences physiologiques des infections et des maladies. Ce protocole décrit comment administrer des infections bactériennes robustes et quantitativement reproductibles à D. melanogaster, et comment mesurer par la suite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte.

Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dans ce travail, nous fournissons un flux de travail expérimental sur la façon dont les amplificateurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement.

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de l’enzyme Cas13D ciblant l’ARN (RfxCas13D) chez les mouches.

Ciblage de l’ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila Melanogaster à l’aide de CRISPR/CasRx

Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Dans cet article, nous démontrons comment disséquer le système nerveux central du troisième stade drosophile larves.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

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