Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est de mesurer quantitativement les activités de régulation génique des éléments régulateurs CIS ou CRE actifs au cours du développement gastrométamorphique de la drosophile. Commencez par des méthodes d’intégration spécifiques au site pour générer des lignées d’ERC incorporées transgéniquement en tant que transgènes rapporteurs. À l’aide d’un stéréomicroscope, obtenez des échantillons transgéniques du bon stade de développement.

Retirez les échantillons de la pub extérieure et montez-les sur un microscope en verre. Procédez à l’enregistrement du niveau et du modèle d’expression de la protéine rapporteure fluorescente dans des échantillons entiers par analyse microscopique confocale. Enfin, quantifiez le niveau d’expression de la protéine rapporteure fluorescente pour les images confocales enregistrées à l’aide de l’outil logiciel Image J.

Ces résultats attribuent un niveau d’activité régulatrice des gènes pour aider l’élément régulateur et faciliter d’autres études comparatives d’expression génique sur les versions modifiées de l’ERC. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés et se sent intéressé par la régulation des gènes et comment cette régulation des gènes est codée. L’ADN ressemble à la biologie du développement et de l’évolution.

Cette procédure a été développée pour fournir des informations sur les éléments régulateurs cis qui fonctionnent au cours du développement métamorphique de la drosophila melanogaster. En principe, cependant, il peut être appliqué à des éléments régulateurs cis qui fonctionnent au cours d’autres stades de développement et à d’autres espèces de mouches des fruits, voire à d’autres organismes modèles. Afin d’élargir les lignées transgéniques, installez deux flacons avec plusieurs mouches mâles et femelles en alternance.

Transférez les mouches de l’un des flacons dans un nouveau flacon. Répétez cette opération pendant une semaine. Au bout de deux semaines, vérifiez que les mouches transgéniques des fruits vont des stades de développement larvaire aux stades adultes.

Commencer à stadifier les spécimens à la fin du troisième stade larvaire, lorsque le RE est formé. Notez que l’échantillon n’est pas mobile. L’ER est blanc adouci et les sphériques ont évité de spécifier ce point de temps.

Comme zéro HAPF. Distinction entre les mâles et les femelles par la présence de gonades situées bilatéralement près du milieu du corps qui apparaissent comme des cercles translucides pour la stadification en fonction de la longueur de la métamorphose. À zéro HAPF, transférer les échantillons dans un flacon frais à l’aide d’un pinceau humidifié.

Ajoutez un morceau de lingette Kim et humidifiez avec de l’eau pour empêcher les spécimens de se dessécher. Maintenant, incubez le flacon à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que le HAPF souhaité. Alternativement, classer les spécimens par tri basé sur l’identification de la présence et de la position de plusieurs marqueurs morphologiques comme détaillé dans le texte ci-joint.

Avec du ruban adhésif de laboratoire, collez un morceau de ruban adhésif sur une planche de dissection avec la surface du ruban adhésif vers le haut. Mouillez un pinceau et appliquez de l’humidité sur les échantillons à l’aide d’un pinceau. Transférez les échantillons dans une lingette Kim.

Transférez les échantillons sur le ruban d’emballage et collez-les avec la surface dorsale vers le haut. Laissez sécher les échantillons pendant 15 minutes. Ouvrez progressivement le RE à l’aide d’une pince.

Commencez par l’extrémité antérieure ou permanente et continuez vers l’extrémité postérieure. Transférez ensuite le pui dans une goutte d’huile visqueuse sur une lame de microscope et évaluez l’échantillon au microscope pour les échantillons entiers. Utilisez soit l’objectif Forex, soit l’objectif 10 x pour mettre l’échantillon au point.

À l’aide du logiciel de microscope confocal, ajustez la longueur d’onde d’excitation de la protéine fluorescente souhaitée afin d’éviter le photoblanchiment. Commencez par une intensité laser de 5 à 10 %Si le signal est décevant, augmentez l’intensité si nécessaire afin d’améliorer le rapport signal/bruit. Pour les images confocales, activez les paramètres logiciels qui font la moyenne des mesures de pixels à partir de balayages répliqués, tels que la moyenne de Kalman pour les comparaisons quantitatives de l’activité CRE utilise la césarienne là où la fluorescence semble la plus intense.

Passez à une table de recherche d’avertissement de saturation et ajustez le gain de tension du canal et le décalage sur des paramètres où peu de pixels sont saturés. Si nécessaire, ajustez l’ouverture confocale. Une fois les paramètres optimaux déterminés, exécutez le balayage ZS pour obtenir une série d’images le long de l’axe Z.

Une fois le balayage terminé, convertissez la pile d’images en projection et enregistrez ce fichier image au format TIF. Pour une comparaison quantitative des activités de l’ERC, utiliser les mêmes paramètres confocaux pour tous les échantillons répétés et les lignées transgéniques rapporteures. Pour l’expérience avec le programme Image J démarrée, ouvrez une image TIFF à évaluer.

Cliquez sur le bouton de sélection à main levée et tracez le contour de la zone de l’échantillon où la quantification est souhaitée. Pour obtenir une statistique de valeur de pixel, cliquez sur l’onglet Analyser, puis sélectionnez mesurer. Enregistrez le score de valeur moyenne en pixels dans la zone de résultats.

Collectez également une deuxième valeur moyenne en pixels à partir d’une région d’arrière-plan où l’ERC n’est pas actif. Pour obtenir une valeur moyenne de pixel ajustée, continuez à générer des statistiques de valeur de pixel pour les échantillons répétés. Ensuite, à partir des valeurs moyennes des pixels ajustées de la réplique, déterminez l’activité régulatrice moyenne pour A CRE et calculez également l’erreur type de la moyenne.

Cette expérience utilise l’intensité du phénotype de l’œil de sauvetage blanc pour rendre les lignées transgéniques homozygotes. Un fond génétique mutant de gène blanc avec une séquence de site d’atterrissage A TTP est utilisé pour l’intégration de transgènes spécifiques au site. Les individus transgéniques, hémizygotes et homozygotes pour le vecteur intégré se distinguent par l’intensité du phénotype de la couleur de l’œil sauvé par le nombre de copies du gène mini blanc intégré.

Des lignées homozygotes sont ensuite établies en croisant des mouches mâles et femelles avec le phénotype de la couleur des yeux la plus foncée. Des marqueurs morphologiques sont utilisés pour déterminer le stade métamorphotique de la drosophile lors de la métamorphose de la larve à la mouche des fruits adulte. Le spécimen passe par une série de morphologies stéréotypées qui peuvent être utilisées pour déterminer le sexe et se rapprocher du stade de développement. Ici.

Une version de type sauvage de A CRE appelée élément dimorphe entraîne des niveaux élevés d’expression du rapporteur EGFP dans le segment abdominal ASIC du puy femelle. Une séquence de 13 paires de bases au sein de cette CRE s’est avérée être un site de liaison pour le facteur de transcription DSX et l’importance in vivo de cette séquence est démontrée en quantifiant l’activité régulatrice de l’ERC lorsque ce site de liaison est muté. Des analyses quantitatives indiquent que la mutation de ce site DSX a réduit l’activité régulatrice à 28 plus ou moins 3 % de l’expression de type sauvage dans le contexte du site d’insertion du transgène utilisé ici.

Des comparaisons similaires évaluent les activités de régulation pour les allèles CRE intra-spécifiques ou entre les ERC autologues d’espèces distinctes, par exemple, par rapport aux niveaux d’EGFP dans le segment femelle. Un six conduit par la souche gastrique D, Melin, Canin S, des ERC autologues pour les espèces D, stimulants et D, posséderont des activités régulatrices égales à 75 plus ou moins 4 % et zéro, plus ou moins 0 %, respectivement. Les méthodes de procédure suivantes, telles que l’interférence ARN, peuvent être utilisées avec les gènes des facteurs de transcription pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont ces gènes de facteurs de transcription interagissent avec les éléments régulateurs du CYS.

Cela serait indiqué par l’augmentation et la diminution de l’expression de la protéine rapporteure fluorescente qui sont entraînées par les éléments régulateurs du CIS après son développement. Cette procédure a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régulation des gènes pour explorer l’importance fonctionnelle des motifs d’éléments régulateurs cis et des mutations évoluées sur l’expression des gènes.