Name: Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant lacide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez comment identifier et valider des éléments régulateurs génomiques appelés enhanceurs. Cette méthode utilise l'analyse ChIP-seq et des cellules souches embryonnaires pour étudier la régulation transcriptionnelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Bence Daniel, Matt Peloquin, le Dr Endre Barta, le Dr Balint L Balint et les membres du laboratoire Nagy pour les discussions et les commentaires sur le manuscrit. L.N est soutenu par des subventions du Fonds hongrois pour la recherche scientifique (OTKA K100196 et K111941) et cofinancé par le Fonds social européen, le Fonds européen de développement régional et le Programme hongrois de recherche sur le cerveau - Subvention n°. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Enhancer Sélection basée sur l&#39;analyse de Chip-seq <ol><li> Télécharger le fichier fastq de données brutes RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) de http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Télécharger et extraire le fichier d&#39;index BWA requis pour l&#39;alignement (dans notre cas: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz NOTE: Visite https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts pour plus d&#39;informations sur les étapes de l&#39;analyse bioinformatique et pour télécharger les scripts utilisés ci-dessous. </li><li> Alignez le fichier exemple de fastq au génome de mm10 (utiliser le script: perform_alignment.sh). Cela va créer un dossier avec un fichier .bam et les statistiques de l&#39;alignement. RXR données ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), et le fichier d&#39;index correspondant (.bai) sont disponibles ici: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ NOTE: BWA est un logiciel qui aligne relaséquences relativement courtes (par exemple, les résultats de ChIP-seq) à une base de données de séquence, tels que le génome de référence de la souris (par exemple, mm10) 13. </li><li> Exécutez le script (callpeaks.sh) pour le pic appelant et de novo analyse de motif. Utilisez le fichier .bam comme entrée. Le script est basé sur Homer findPeaks 14. REMARQUE: Les fichiers de sortie nous donnent des informations sur le nombre total de pics, l&#39; enrichissement des motifs, le pourcentage de l&#39;arrière - plan, et les séquences cibles avec des motifs, etc. (Figure 1). Typiquement plusieurs motifs sont énumérés dans l&#39;ordre de leur importance. </li><li> Remappez le # 1 motif classé (NR demi `AGGTCA`) (utiliser le script: remap_motif.sh) NOTE: Comme résultat, le script génère un fichier .bed qui montrera que CHIP-pics couvrent des régions génomiques qui contiennent le site de liaison canonique du facteur de transcription d&#39;intérêt. </li><li> Télécharger et visualiser les résultats du RXR lit ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (également télécharger le .bai)) et les occurrences AGGTCA motifs (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) par intégratif de génomique Viewer (IGV) 15 pour identifier les RAR putative / sites de liaison RXR (figure 2 et figure 3). NOTE: L&#39; intégration des différentes données ChIP-seq permettra de prédire avec précision plus de bons activateurs candidats 16,17. Des études récentes ont révélé que des amplificateurs actifs sont généralement enrichis en P300 et sont en corrélation avec H3K4me1 et H3K27ac, et sont situées dans des régions de chromatine ouvertes, affichant ainsi DNase I hypersensibilité est également recommandée 18-21. </li><li> Utilisez la &quot;Définir une région d&#39;intérêt&quot; dans IGV 15 pour obtenir 200-400 séquence de pb de la région génomique sélectionnée et utiliser ces séquences pour la conception d&#39;amorces ultérieures. </li></ol> 2. Reporter Assay NOTE: Le système luciférine / luciférase est utilisécomme un essai rapporteur très sensible pour la régulation transcriptionnelle. En fonction de l&#39;activité de l&#39;activateur de cet enzyme luciférase est produite qui va catalyser l&#39;oxydation de la luciférine à l&#39;oxyluciférine entraînant bioluminescense, qui peut être détectée. Dans un premier temps, des séquences amplificatrices putatives identifiées devraient être sous - clonés dans un vecteur rapporteur (par exemple, TK-luciférase 22, pGL3 ou NanoLuc). <ol><li> Conception Primer <ol><li> Amorces Conception PCR pour l&#39; amplification de 200-400 pb de régions amplificatrices putatives par Primer3 (disponible ici: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copiez-collez la séquence génomique de IGV qui comprend le site de liaison putatif en Primer3 (voir étape 1.7). Set gamme de taille de produit à 250-300 pb Primer3. </li><li> Valider les amorces de PCR en utilisant le navigateur UCSC Genome est in silico outil PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 NOTE: Ce protocole dans une étape ultérieure utilise HindIIrestriction I et BamHI enzymes pour le clonage. Vérifier si la séquence amplifiée par PCR , comme prévu par l&#39;outil de PCR UCSC in silico contiendront des sites de restriction ou AAGCTT GGATCC (par exemple http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> Obtenir les amorces nécessaires à partir d&#39;un fournisseur commercial. </li></ol></li><li> Amplification PCR de Enhancer séquence d&#39;ADN génomique <ol><li> Purifier l&#39; ADN génomique modèle à partir de cellules primaires (par exemple, les fibroblastes embryonnaires primaires). Utilisez kit commercial pour ADNg isolement et suivre les instructions du fabricant. NOTE: La haute qualité de ADNg est essentiel pour l&#39;amplification de la PCR réussie. Les clones BAC appropriés peuvent être utilisés si la PCR est pas facile de ADNg. </li><li> Préparer réaction de PCR de 50 pi contenant 100 ng d&#39; ADNg, 5 pi de 10 x tampon, 3 ul MgSO4 (25 mM), 5 pi de dNTP (2 mM chacun), 1,5 ul Fwd amorce (10 pM), 1,5 pi de Rev amorce (10 pM) , 1 ul d&#39;ADN polymerase <li> Définir le cycle de PCR (2 minutes 95 ° C (20 sec 95 ° C, 10 secondes 58-65 ° C, 18 sec à 70 ° C) répéter les opérations x25, 2 min 70 ° C, toujours à 4 ° C). Régler la température de recuit de l&#39;examen de l&#39;amorce de valeurs prédites Tm. </li><li> Purifier le produit PCR avec un kit de purification PCR commerciale et suivez les instructions du fabricant. </li><li> Introduire les sites de restriction pour le clonage en répétant la PCR avec des amorces tel qu&#39;il est utilisé ci - dessus, mais en y ajoutant des surplombs sur leurs extrémités 5 &#39;(par exemple Fwd: 5&#39;-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3&#39; (Hind III), Rev: 5&#39;-GGATCC TATA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 &#39;(Bam HI)). </li><li> Exécutez 5 ul du produit de PCR sur gel d&#39;agarose pour vérifier les produits de PCR non spécifiques. NOTE: Si plusieurs bandes sont détectées, exécutez le produit PCR entier et purifier la bande appropriée par un kit d&#39;extraction de gel commercial. </li></ol&gt; </li><li> Restriction NOTE: Pour cloner insert en amont du promoteur TK 22 le produit purifié PCR et le vecteur (par exemple, TK-Luc) devrait être digéré par HindIII et BamHI. <ol><li> Préparer un mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 ug produit a été purifié par PCR, 1 pl de HindIII (20 U / pl), 1 ul de BamHI (20 U / pl) et 5 pi de tampon 10x. </li><li> Préparer un vecteur contenant 250 mélange réactionnel pl de 5 pg (TK Luc ou vecteur rapporteur alternatif), 5 ul Hind III (20 U / pl), 5 ul de BamHI (20 U / pl), 5 ul thermosensibles Phosphatase alcaline (1 U / pl) et 25 ul de 10 x tampon. REMARQUE: le traitement AP du vecteur diminue fortement l&#39;auto-ligature du seul vecteur digéré et donc l&#39;arrière-plan. </li><li> Incuber les mélanges réactionnels pendant 4 heures à 37 ° C, puis on purifie les produits de PCR digérés et le vecteur avec un kit de purification PCR commerciale. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Mettre en place la réaction de ligature dans des tubes de PCR comprenant 2 pl 10x T4 tampon de ligase d&#39;ADN, 10 ng TK-Luc vecteur, insérer 50 ng (produit de PCR digéré), 1 ul d&#39;ADN ligase de T4 (400 U / pl) et sans nucléases eau jusqu&#39;à 20 ul. NOTE: Préparer un contrôle négatif où la réaction ne contient pas insert. </li><li> Mélanger délicatement la réaction par pipetage de haut en bas, centrifuger brièvement les tubes de PCR en utilisant un mini-centrifugeuse puis incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Heat inactiver à 65 ° C pendant 10 minutes puis refroidir sur la glace et utiliser 5 pi du produit de transformation dans 50 ul de cellules compétentes (par exemple, DH5a). </li><li> Utilisez la procédure de choc thermique standard pour transformer des bactéries, ramasser des colonies et isoler l&#39;ADN plasmidique avec un kit commercial. Validez toutes les constructions par séquençage avant les prochaines étapes. </li></ol></li><li> La transfection de cellules ES <ol><li> Utiliser des plaques à 48 puits. Ajouter 200 ul de 0,1% de gélatine solutions / puits 30 min avant le placage des cellules. </li><li> Plate souches embryonnaires (ES) cellules par jour avant la transfection. Utiliser des cellules et la plaque ES libre nourricières à une densité de 3 x 10 4 cellules par puits dans 250 ul ES médias / puits. </li><li> Préparer les mélanges de plasmides (chaque mélange est calculé pour 8 puits, 4 non traité et 4 traités à l&#39; acide rétinoïque) Mélanger 1:. 1.250 ng TK-Luc Empty (contrôle négatif), 950 ng β-galactosidase vecteur de codage (ßGal), Mix 2 : 1,250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (contrôle positif), 950 ng ßGal, Mix 3: 1,250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (région d&#39;intérêt), 950 ng ßGal. NOTE: Les cellules ES expriment les facteurs de transcription souhaités (RAR / RXR). Laisser les puits non transfectées pour déterminer les valeurs de base plus tard au cours de la luciférase et de la β-galactosidase mesures. </li><li> Ajouter des médias sériques réduits de qualité de transfection pour chaque plasmide mélanger jusqu&#39;à 106 ul volume total (suffisant pour 8 puits). </li><li> Ajouter 4,5 ul transfecter de qualité ESréactif ion, puis mélanger soigneusement par pipetage 15 fois haut et en bas. Laisser incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 13 ul du mélange de transfection des cellules par puits, mélanger par pipetage. Placez les cellules de nouveau dans l&#39;incubateur (37 ° C) O / N avant le traitement de ligand. </li><li> Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules et ajouter 250 ul frais media / puits contenant 0,01 - 1 uM all trans-acide rétinoïque (RA) que la concentration finale ou DMSO comme véhicule. Incuber les cellules pendant 24-48 h. NOTE: L&#39;acide rétinoïque est sensible à la lumière. </li></ol></li><li> Préparation des lysats cellulaires <ol><li> Diluer Lysis Buffer 5x (1,25 ml Tris 0,5 M pH = 7,8, 1 ml de 1 M de dithiothréitol (DTT) (dans H 2 O), 10 ml d&#39; EDTA 0,1 M pH = 8,0, 50 ml de glycerol, 5 ml de Triton X-100, stériles de l&#39;eau jusqu&#39;à 100 ml) à l&#39;aide d&#39;eau 1x stérile, ajouter 20 ul de DTT 1 M / 10 ml et équilibrer à la température ambiante avant utilisation. Préparer 10 ml pour une plaque à 48 puits le jour du dosage. </li&gt; <li> Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules. Rincer les cellules une fois avec PBS 1x. Ajouter 200 ul de 1 x tampon de lyse / puits directement aux cellules. </li><li> Agiter pendant 2 h à RT (lyse chimique). Congeler les lysats cellulaires sur la plaque à -80 ° C (lyse mécanique). Les lysats peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs jours. </li><li> Décongeler les lysats. Après décongélation complète, le transfert des lysats cellulaires à une plaque à 96 puits en utilisant une pipette électronique multicanaux. Transfert 80 pi du lysat cellulaire à plaque de 96 puits clair pour le dosage β-galactosidase et 40 pi de lysat cellulaire à une plaque blanche pour la mesure de la luciférase. Éviter la formation des bulles. </li></ol></li><li> β-galactosidase Assay NOTE: galactosidase Beta ou deuxième journalistes alternatifs devraient être utilisés comme un contrôle interne pour tenir compte des variations expérimentales non spécifiques. <ol><li> Préparer un tampon de substrat β-galactosidase: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g de NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g de KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, font jusqu&#39;à 1000 ml avec de l&#39; eau stérile. Ajuster le pH à 7,4. Filtre Stériliser (0,2 micron) et conserver à 4 ° C </li><li> Mélanger le tampon de substrat 1 ml de β-galactosidase avec 4 mg ONPG (o-nitrophényl-β-D-galactosidase). Ajouter 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (ßME) par 1 ml de tampon juste avant utilisation. Ajouter un tampon de substrat de β-galactosidase de 100 pi à 80 pi de lysat cellulaire. </li><li> Incuber les réactions à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;une couleur jaune pâle a développé. Lire l&#39;absorbance à DO 420 nm sur un lecteur de plaque et d&#39;exportation des données. REMARQUE: La durée varie en fonction de l&#39;efficacité de transfection, généralement pas plus de 30 min. </li></ol></li><li> luciférase Assay <ol><li> Préparer 50 ml luciférine réactif de substrat: 15,1 mg de sel de D-luciférine, 82,7 mg de sel ATP, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, ajouter 50 ml Tube en polypropylène,puis ajouter 1,5 ml de tampon 1 M HEPES, 48,5 ml ATP eau libre, vortex, assurez-vous que tous les composés se dissolvent complètement. Gardez 5 - 10 ml aliquotes à -80 ° C. </li><li> Chaud 5 ml substrat luciférine réactif à la température ambiante avant de commencer. Distribuer 100 ul substrat réactif pour chaque puits de la plaque blanche contenant les 40 pi de lysat cellulaire et de mesurer le signal immédiatement en utilisant un luminescent compteur machine. </li><li> Obtenir des activités d&#39;au moins trois expériences indépendantes dans des transfections en triple. </li><li> Calculer d&#39;abord l&#39;activité de la luciférase normalisée de base et des valeurs normalisées β-galactosidase de base pour chaque puits en soustrayant les valeurs moyennes mesurées pour les cellules non transfectées provenant de chaque valeur mesurée. Calcule ensuite le rapport de l&#39;activité luciférase / β-galactosidase. </li></ol></li></ol> 3. Caractérisation de l&#39;ARN Enhancer REMARQUE: Un indicateur plus directe de l&#39;activité d&#39;activateur a émergé de la récente génome wétudes ide qui ont identifié de nombreux ARN non-codants courts, dont la taille varie de 50 à 2000 nt, qui sont transcrits à partir des amplificateurs, et sont appelés ARN enhancer (Ernas) 16,25,26 (figure 4). erna induction est fortement corrélé à l&#39;induction de gènes codant pour des exons adjacents. Ainsi, l&#39; activité d&#39;activateur dépendant du signal peut être quantifiée in vivo en comparant la production Erna entre les différentes conditions par RT-qPCR. <ol><li> Lignes directrices pour la conception Primer pour la détection Erna par RT-qPCR <ol><li> Sélectionnez régions génomiques pour des mesures Erna qui sont au moins 1,5 à 2 kb loin des sites de début de transcription annotés. NOTE: Il est important, des niveaux élevés de transcription de l&#39;ARNm dans exhausteurs intragéniques prévenir une quantification précise de Erna dans l&#39;orientation sens, Ernas antisens à exhausteurs intragéniques sont détectables et sont semblables dans le niveau de Ernas à exhausteurs extragéniques. </li><li> En règle générale, utiliser des régions 200 - 1000 pb from le centre du site d&#39;intérêt pour la conception d&#39;amorce soit sur ​​le sens ou brin antisens (figure 4 et figure 6) liant le facteur de transcription. NOTE: Si GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 ou données H3K27ac ChIP-seq sont disponibles à partir des types cellulaires souhaités et les conditions, il peut être utilisé pour la conception d&#39;amorce plus précis. Ernas sont transcrits à partir de régions amplificatrices putatives caractérisées par des niveaux élevés de H3K4me1 et me3. L&#39;expression de Ernas corrélation positive avec l&#39;enrichissement de activé marque activateur de histone H3K27ac. </li><li> Amorces Conception PCR pour base de colorant fluorescent mesure RT-qPCR de Ernas par Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Générer séquence anti-sens (complément du brin sens inverse) pour la conception d&#39;amorce selon: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Insérez 2-300 pb de séquence sens ou anti-sens pour la conception d&#39;amorce. </li></ol></li><li> Mesure de Erna Transcription </strong&gt; <ol><li> Isoler l&#39;ARN total à partir de cellules traitées avec du phénol acide commercial / réactif d&#39;extraction à base de chloroforme selon les recommandations du fabricant. </li><li> Utilisez DNaseI pour traiter l&#39;ARN isolé avant de les utiliser dans la réaction de transcription inverse. Inactiver DNase selon les recommandations du fabricant avant la transcription inverse. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ARN après traitement à la DNase I et utiliser 1000 ng par réaction RT. Utilisez inverse de haute qualité transcriptase. Remarque: Comme un grand nombre de Ernas ne peut pas être polyadénylé, la transcription inverse nécessite l&#39;utilisation d&#39;amorces aléatoires. </li><li> Détecter une transcription inverse Erna par RT-qPCR en utilisant la procédure standard. Mesurer un ARNm non-traitement dépendant de la normalisation (par exemple, 36B4, PPIA, Gapdh, ACTB). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+enhancers%3A+new+insights+into+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distal enhancers: new insights into heart development and disease.</a> Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature methods. 4, 613-614 (2007).</li>
<li>Muller, F., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+DNA+sequences+in+defining+promoters+for+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation.</a> Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).</li>
<li>Ounzain, S., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+enhancer-associated+long+noncoding+RNAs+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration.</a> Trends Cardiovasc Med. , (2015).</li>
<li>Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+and+regulated+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs.</a> Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-based+identification+of+mammalian+enhancers+using+site-specific+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration.</a> Nature methods. 11, 566-571 (2014).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
<li>Vermunt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+coregulated+enhancer+networks+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+9%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain.</a> Cell reports 9. , 767-779 (2014).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Mahony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-dependent+dynamics+of+retinoic+acid+receptor+binding+during+early+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis.</a> Genome Biol. 12 (R2), (2011).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38, 576-589 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Daniel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+enhancer+network+operated+by+liganded+RXR+supports+angiogenic+activity+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages.</a> Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+enhancer+transcription+and+activity+from+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications.</a> Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 311-318 (2007).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470, 279-283 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces dernières années, les progrès de la technologie de séquençage ont permis de prédire à grande échelle les amplificateurs dans de nombreux types de cellules et de tissus 7-9. Le flux de travail décrit ci-dessus permet d’effectuer une caractérisation primaire des amplificateurs candidats choisis sur la base des données ChIP-seq. Les étapes détaillées et les notes aideront toute personne à mettre en place une validation d’amplificateur de routine en laboratoire.
L’étape la plus crit...

Le développement d’un organisme multicellulaire nécessite l’expression précisément régulée de milliers de gènes dans les tissus en développement. La régulation de l’expression des gènes est accomplie en grande partie par des amplificateurs. Les amplificateurs sont de courts éléments d’ADN non codants qui peuvent être liés à des facteurs de transcription (TF) et agir à distance pour activer la transcription d’un gène cible1. Les amplificateurs sont généralement cis et se trouvent le plus souvent juste en amont du site de début de transcription (TSS), mais des études récentes ont également décrit des exemples où des amplificateurs ont été trouvés beaucoup plus en amont, sur les 3' du gène ou même dans les introns et les exons2. 
Il existe des centaines de milliers d’amplificateurs potentiels dans les génomes des vertébrés1. Des méthodes récentes basées sur l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fournissent des données à haut débit de l’ensemble du génome qui peuvent être utilisées pour l’analyse des amplificateurs3-9. Bien que les données obtenues par les expériences ChIP-seq augmentent considérablement la probabilité d’identifier des amplificateurs spécifiques aux cellules et aux tissus, il est important de garder à l’esprit que les sites de liaison détectés n’identifient pas nécessairement la liaison directe à l’ADN et/ou les amplificateurs fonctionnels. Par conséquent, une analyse fonctionnelle plus poussée des amplificateurs nouvellement identifiés est indispensable. Dans ce travail, nous présentons un processus de base en trois étapes d’identification et de validation des amplificateurs actifs présumés. Cela comprend : 1) la sélection de sites de liaison présumés du facteur de transcription par l’analyse bio-informatique des données ChIP-seq, 2) le clonage et la validation de ces séquences régulatrices dans les constructions rapporteures, et 3) la mesure de l’ARN amplificateur (eRNA). 
L’exposition des cellules souches embryonnaires (ES) à l’acide rétinoïque (RA) est fréquemment utilisée pour favoriser la différenciation neurale des cellules pluripotentes 10. La PR exerce ses effets en se liant aux récepteurs de la PR (RARα, β, γ) et aux récepteurs X des rétinoïdes (RXRα, β, γ). Les RAR et les RXR sous une forme d’hétérodimère se lient à des motifs d’ADN appelés éléments de réponse à l’AR, qui sont généralement organisés comme des répétitions directes de la séquence AGGTCA (appelée demi-site) et régulent la transcription. Des expériences de traitement par ligands ont permis d’identifier plusieurs gènes régulés par l’acide rétinoïque dans les cellules ES 11,12. Cependant, les éléments amplificateurs de bon nombre de ces gènes n’ont pas encore été décrits. Pour démontrer comment le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour l’identification et la validation des amplificateurs, nous montrons étape par étape la sélection et la caractérisation de deux amplificateurs dépendants de l’acide rétinoïque dans les cellules souches embryonnaires.

<table><tbody><tr><td>KOD ADN polymérase</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>pour l’amplification PCR de l’amplificateur à partir de l’ADNg</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de mouchoirs&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>pour l’isolement de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>pour la purification de produits PCR</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>pour l’extraction sur gel s’il y a plus de produit PCR</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>enzyme de restriction</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>FastAP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>libération de groupes 5'- et 3'-phosphate à partir de l’ADN</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>pour la ligature</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>pour l’isolement plasmidique</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES media</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acid</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>réactif de transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg ; I Sérum réduit à</td><td>durée de vie moyenne Technologies</td><td>31985-062</td><td>pour la transfection</td></tr><tr>du ligand <td>Sigma</td><td>R2625</td> de<td>l’acide rétinoïque tout-trans</td><td>, pour l’activation de RAR/RXR</td></tr><tr><td>à plaque transparente à 96 puits</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>pour le dosage de la bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>Plaque blanche à 96 puits</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>pour le dosage de la luciférase</td></tr><tr><td>D-luciférine, sel de potassium</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td> pour le dosage de la <td>luciférase ATP</td></tr><tr><td>sel</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>pour le dosage de la luciférase</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226 ; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>pour le dosage de la luciférase</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>pour le dosage de la luciférase</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226 ; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>pour le dosage de la bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226 ; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>pour le dosage de la bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226 ; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td> pour le dosage de la <td>bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td> pour le dosage de la <td>bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophényl-&beta ;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>pour le dosage de la bêta-galactosidase</td></tr><tr><td>TRIzol&reg ;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité Life Technologies</td><td></td><td>4368814</td><td>de la transcription inverse de l’ARNe</td></tr><tr><td>Dnase sans Rnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Traitement de la dnase</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>mastermix CFX384 Touch&trade ; Système de détection PCR en temps réel</td><td>Machine BioRad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques BioTek Synergy 4</td><td>Compteur luminescent BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Le développement embryonnaire est un processus en plusieurs étapes impliquant l&#39;activation et la répression de nombreux gènes. Des éléments amplificateurs dans le génome sont connues pour contribuer à un tissu et un type de cellule spécifique régulation de l&#39;expression génique au cours de la différenciation cellulaire. Ainsi, leur identification et une enquête plus approfondie est important afin de comprendre comment le destin cellulaire est déterminée. L&#39; intégration des données de gènes d&#39;expression (par exemple, microarray ou ARN-Seq) et les résultats de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) à base d&#39; études de l&#39; ensemble du génome (ChIP-seq) permet l&#39; identification à grande échelle de ces régions régulatrices. Cependant, la validation fonctionnelle d&#39;amplificateurs spécifiques du type cellulaire doit être examinée in vitro et dans des procédures expérimentales in vivo. Nous décrivons ici comment exhausteurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement. Ce protocole fournit un flux de travail, étape par étape, qui comprend: 1) l&#39;identification des régions régulatrices par l&#39;analyse, 2) le clonage et exper données ChIP-seqvalidation imental du potentiel réglementaire putatif des séquences génomiques identifiées dans un dosage de rapporteur, et 3) la détermination de l&#39; activité d&#39;activateur in vivo par la mesure du niveau de la transcription de l&#39; ARN d&#39;activateur. Le protocole présenté est suffisamment détaillée pour aider quelqu&#39;un à mettre en place ce flux de travail dans le laboratoire. Surtout, le protocole peut être facilement adapté et utilisé dans un système de modèle cellulaire.

Nous avons utilisé un anticorps RXR pan-spécifique afin d&#39;identifier quels gènes RA réglementés de l&#39;ensemble du génome ont l&#39;enrichissement des récepteurs dans leur proximité. Analyse bio - informatique des données de RXR copeau suivants obtenus à partir de cellules ES traitées à l&#39; acide rétinoïque a révélé l&#39;enrichissement du demi - site du récepteur nucléaire (AGGTCA) sous le RXR sites occupés (figure 1). En utilisant un algorithme de bio - inform...

Dans ce travail, nous fournissons un flux de travail expérimental sur la façon dont les amplificateurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement.

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

L'objectif général de cette vidéo est de fournir un ensemble intégré de méthodes permettant d'identifier et de valider expérimentalement des éléments régulateurs génomiques appelés enhancers. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la transcription et la régulation des événements biologiques, notamment la sélection et l'utilisation des enhancers, lors de la différenciation cellulaire ou en réponse à des stimuli externes. Le principal avantage du flux de travail présenté est que le protocole peut être facilement adapté et utilisé dans n'importe quel système de modèle cellulaire.Je vais démontrer les étapes de la procédure. Pour commencer, choisissez un élément enhanceur candidat en vous basant sur une analyse préexistante de séquençage ChIP. Utilisez un navigateur génomique pour examiner les résultats de l'expérience de séquençage ChIP souhaitée, et identifiez les sites de fixation à proximité du gène d'intérêt.Choisissez Définir une région d'intérêt pour obtenir une séquence de 200 à 400 paires de bases de la région génomique sélectionnée, puis utilisez ces séquences pour la conception ultérieure des amorces. À l'aide de techniques standards de biologie moléculaire, amplifiez et clonez la région génomique sélectionnée dans un vecteur rapporteur. Pour tester l'activité d'un enhancer, transfectez les constructions rapporteuses dans des cellules souches embryonnaires massives en ajoutant d'abord 200 microlitres de solution de gélatine à 0,1 % par puits dans des plaques de 48 puits.Incuber les plaques pendant 30 minutes avant la mise en culture. La veille de la transfection, semer des cellules souches embryonnaires (ES) sans cellules nourricières dans 250 microlitres de milieu ES, à une densité de trois fois 10 à la puissance quatre cellules par puits. Le jour de la transfection, préparer les mélanges de plasmides, en prévoir suffisamment pour huit puits à partir de chaque mélange.Ajouter du milieu à sérum réduit de qualité transfection à chaque mélange de plasmide afin d'ajuster le volume à 106 microlitres. Ensuite, ajouter 4,5 microlitres de réactif de transfection de qualité ES et mélanger soigneusement en pipetant 15 fois de haut en bas. Incuber le mélange de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.Après l'incubation, ajouter 13 micro litres par puits du mélange de transfection aux cellules et mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette. Ensuite, replacer les cellules dans l’incubateur pendant la nuit avant le traitement au lichen. L’efficacité de la transfection est une étape cruciale.Si un autre type cellulaire est utilisé, cette étape nécessite une optimisation. Utilisez le type cellulaire le plus pertinent pour tester l'activité de l'enhancer afin de minimiser les effets dépendant du contexte. Le jour suivant, retirez soigneusement le milieu par aspiration, puis ajoutez 250 µL de milieu frais par puits contenant un micromolaire d'acide tout-trans rétinoïque, ou du DMSO comme véhicule.Incuber les cellules pendant 24 à 48 heures. Après avoir préparé le tampon de lyse conformément au protocole indiqué, aspirer soigneusement le milieu des cellules. Rincer les cellules une fois avec du PBS 1X, puis ajouter 200 microlitres de tampon de lyse 1X par puits.Agiter les cellules à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, pour une lyse cellulaire complète, congeler les lysats cellulaires dans la plaque à 80 degrés Celsius. Après décongélation complète des lysats, utiliser une pipette électronique multicanal pour transférer 80 µL du lysat cellulaire dans une plaque transparente de 96 puits destinée à la bêta-galactosidase, et 40 µL du lysat dans une plaque blanche pour la mesure de la luciférase.Pour réaliser la bêta-galactosidase, mélanger un millilitre de tampon substrat bêta-gal avec quatre milligrammes d'OMPG. Ajouter ensuite 3,5&nbsp;µL de bêta-mercaptoéthanol au mélange et immédiatement ajouter 100&nbsp;µL du tampon à 80&nbsp;µL de lysat cellulaire. Incuber les réactions à 37&nbsp;°C jusqu'à l'apparition d'une couleur jaune pâle.Lisez l'absorbance à 420 nanomètres sur un lecteur de plaques et exportez les données. Pour réaliser le test de luciférase, après avoir préparé le réactif substrat selon le protocole indiqué, laissez le réactif substrat de luciférase atteindre la température ambiante avant de commencer. Ensuite, pipetez 100 micro litres dans chaque puits de la plaque blanche contenant les 40 micro litres de lysat cellulaire.Utilisez immédiatement un compteur de luminiscence pour mesurer le signal. Obtenez les activités à partir d'au moins trois transfections et expériences indépendantes. Effectuez les calculs pour les deux tests selon le protocole décrit dans le texte.Pour concevoir les amorces destinées à la détection des ARN d'enhancer par RT-PCR, sélectionnez une région génomique située à au moins 1,5 à deux kilobases de tout transcrit génique annoté. Identifiez le sens relatif du gène et déterminez la position des transcrits sens et antisens. Pour concevoir des amorces permettant la quantification des ARN d'enhancer, choisissez des régions situées entre 200 et 1 000 paires de bases du centre du site de fixation du facteur de transcription.Si le gène est situé sur le brin négatif, copiez 200 à 300 paires de bases du brin positif et convertissez la séquence pour obtenir la séquence complémentaire inverse. Ensuite, utilisez cette séquence pour la conception ultérieure des amorces. Réglez la plage de taille du produit entre 80 et 150 paires de bases.Pour mesurer la transcription des ARN-e, après avoir isolé l'ARN total à partir de cellules traitées selon le protocole décrit dans le texte, détecter l'ARN-e rétrotranscrit par RT-PCR en utilisant une procédure standard. Mesurer un ARNm indépendant du traitement pour la normalisation. Comme illustré ici, une analyse bioinformatique de données de séquençage ChIP pour RXR obtenues à partir de cellules ES traitées par l'acide rétinoïque a révélé un enrichissement du demi-site du récepteur nucléaire au niveau des sites occupés par RXR.À l'aide d'un algorithme de bioinformatique, les résultats de la recherche de motifs pour le demi-site ont été replacés sur les données de séquençage chromatinien (chip seq) de RXR. Cette analyse a révélé des pics de séquençage chromatinien co-localisant avec des sites de fixation canoniques des récepteurs nucléaires. La visualisation des sites dans IGV a montré un enrichissement des facteurs de transcription à proximité de Hoxa1.Une cible précédemment caractérisée des RAR et RXR. Un enhancer régulateur pour une nouvelle chaîne cible de l'acide rétinoïque, PRMT8, a également été identifié. Les régions enhancer identifiées ont été clonées dans un vecteur rapporteur de luciférase TK, et les cellules ES ont été transfectées avec ces constructions.L'activité de la luciférase a été mesurée en l'absence et en présence d'acide rétinoïque (RA). Les constructions contenant l'élément de réponse à l'acide rétinoïque, ou RARE, ont montré une intensité accrue du signal de luciférase après traitement par le RA, tandis que la construction dépourvue du RARE n'a pas été induite. Afin de déterminer si l'expression des eARN sens et antisens de l'enhancer lié à RAR RXR du gène Hoxa1 est corrélée à l'expression de l'ARNm du gène, le niveau d'eARN de Hoxa1 a également été mesuré. Les résultats ont confirmé que l'activité de l'enhancer est induite par un traitement bref au RA.Une fois maîtrisée, cette charge de travail peut être réalisée en quelques jours en effectuant l'expérience piégeage d'enhancer décrite et la quantification de l'enhancer ; cela permet de fournir des preuves fonctionnelles solides d'une activité d'enhancer. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier et caractériser les enhancers punitifs. Une fois qu'un enhancer est identifié et validé, d'autres méthodes, comme la capture de confirmation chromosomique, ou CCC, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions importantes, telles que quel gène est régulé par l'enhancer validé ?

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d'identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement.

Essai Reporter Oct4GiP d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

La vidéo montre la méthode permettant d’induire la différenciation des cellules souches en progéniteurs neuraux à l’aide de l’acide rétinoïque et de la méthode de culture de gouttes suspendues.

Différenciation de cellules embryoïdes en progéniteurs neuraux à l’aide d’acide rétinoïque

Cette vidéo présente une technique d’évaluation de l’activité de l’acide rétinoïque chez les embryons de souris. Après avoir isolé des cellules d’embryons de souris, les cellules sont co-cultivées avec des cellules rapporteures d’acide rétinoïque (AR). Les cellules embryonnaires produisent de l’AR, qui induit l’expression de la bêta-galactosidase dans les cellules rapporteures, indiquant l’activité de l’AR dans les cellules embryonnaires.

Utilisation de cellules rapporteures dans une co-culture pour étudier la production d’acide rétinoïque par des cellules embryonnaires de souris

des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches

La manipulation de l’expression temporelle des gènes dans les cellules souches embryonnaires (CSE) en différenciation peut être réalisée à l’aide de systèmes de gènes inductibles. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires est coûteuse et prend du temps. Ce protocole permet l’expression rapide d’un transgène dans la différenciation des cellules dérivées de l’ES et l’analyse ultérieure de la différenciation hématopoïétique en aval.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l'endoderme définitif pour l'amélioration des applications en aval et d'autres différenciations.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

Il n’existe pas de méthodes permettant de mesurer avec précision les niveaux d’acide rétinoïque (AR) dans de petites quantités de tissus. Ce protocole décrit la mesure quantitative et facile des niveaux relatifs de PR dans les embryons et les neurosphères E8.5 à l’aide d’une lignée cellulaire rapporteure de PR.

Mesure quantitative des niveaux relatifs à l&#39;acide rétinoïque E8.5 Embryons et Neurosphère Cultures Utilisation du F9 RARE-Lacz base de cellules Reporter Assay

Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.

Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

Le test des billes trempées implique l’administration ciblée de réactif de test à n’importe quel moment du développement pour étudier la régulation de la différenciation cellulaire et de la morphogenèse. Un protocole détaillé, applicable à tout modèle animal expérimental, pour préparer trois types différents de perles trempées et les implanter dans l’interdigit d’un embryon de poulet est présenté.

Analyse de la différenciation cellulaire, de la morphogenèse et de la modelation au cours de l’embryogenèse du poulet à l’aide du test des perles trempées

Découvrez comment identifier et valider des éléments régulateurs génomiques appelés enhanceurs. Cette méthode utilise l'analyse ChIP-seq et des cellules souches embryonnaires pour étudier la régulation transcriptionnelle.

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant lacide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l'acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Explorer plus de vidéos