Quantifier l'activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

L'objectif général de cette procédure est d'électroporer des implants rétiniens de souris portant des rapporteurs transcriptionnels fluorescents et de quantifier leurs niveaux d'expression. Cela est réalisé en premier lieu par l'isolement du tissu rétinien de souris néonatales par dissection. La deuxième étape de la procédure consiste à électroporer la rétine avec des constructions d'ADN rapporteur fluorescentes.

La troisième étape de la procédure consiste à cultiver les rétines électroporées en tant qu'implants pendant huit jours. La dernière étape de la procédure consiste à récolter l'explant rétinien et à quantifier les niveaux d'expression des marqueurs fluorescents. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les niveaux d'expression relatifs de différents construits rapporteurs promoteurs dans la rétine de souris en développement par électroporation de x explants, suivie d'une analyse quantitative des données.

Je m'appelle Joe Corbo et je suis membre du corps professoral du Département de pathologie et d'immunologie à la faculté de médecine de l'Université de Washington à St. Louis. Aujourd'hui, nous allons présenter un protocole vidéo démontrant la technique d'électroporation X explant dans les rétines de souriceaux nouveau-nés afin de quantifier l'activité d'éléments régulateurs cis spécifiques aux photorécepteurs, et ce protocole sera démontré par une étudiante diplômée de mon laboratoire, Cindy Montana. Commencez par stériliser la chambre d'électroporation et tous les instruments avec de l'éthanol à 70 % en prévision du prélèvement oculaire.

Désinfectez les gants et le plan de travail avec de l'éthanol et maintenez des conditions stériles tout au long de la procédure. Ensuite, dans une hotte de culture tissulaire, pipetez six millilitres de milieu de dissection dans une boîte de Pétri stérile de 60 millimètres et trois millilitres de milieu dans deux boîtes stériles de 35 millimètres. De retour au plan de travail, désinfectez la tête et le cou d’un souriceau nouveau-né avec de l’éthanol à 70 %.

Après avoir rapidement décapité la tête à l’aide de ciseaux, transférez la tête dans une boîte stérile de 100 millimètres, puis découpez le cuir chevelu avec de petits ciseaux afin d’exposer les yeux sous un microscope stéréo. À l’aide de pinces courbes, retirez délicatement l’œil de son orbite, puis placez l’œil dans une boîte de 35 millimètres contenant le milieu de dissection. Continuez à collecter des yeux de manière à obtenir trois à quatre yeux par aliquot d’ADN à électroporer, en conservant les yeux et le milieu de dissection à température ambiante jusqu’à la fin de la procédure.

Stérilisez une lame de rasoir et l'emballage d'une pipette de transfert en plastique stérile à l'aide d'éthanol à 70 %, puis utilisez la lame pour couper l'extrémité de la pipette suffisamment haut afin de pouvoir pipeter un œil entier. À l'aide de la pipette élargie, transférez un œil depuis la boîte de 35 millimètres vers la boîte de 60 millimètres sous un microscope stéréoscopique à fort grossissement. Utilisez une pince fine pour retirer tout tissu, comme les muscles extraoculaires et la graisse, situés à la surface de l'œil.

Ensuite, retirez le nerf optique en le pincant à la base. Afin d'isoler la rétine, percez un petit trou dans la sclérotique au niveau du limbe ; la sclérotique et l'épithélium pigmentaire de la rétine apparaissent brillants par rapport au tissu rétinien, qui est gris mat. Insérez une branche de chaque paire de forceps dans l'orifice et déchirez délicatement la sclérotique et l'ÉPR.

Veillez à laisser l'objectif en place. Utilisez la pipette élargie pour transférer la rétine disséquée dans la deuxième boîte de 35 millimètres contenant le milieu. Récupérez toutes les rétines et conservez-les dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.

Jusqu'à l'électroporation, travailler sous hotte de culture tissulaire pour chaque ADN Eloqua à électroporer : remplir une boîte stérile de 35 millimètres avec du milieu de dissection et une deuxième boîte avec du milieu de culture. À l’aide d’une pipette P200, rincer les chambres de la boîte d’électroporation avec 1× PBS stérile, trois fois. Remplir les chambres avec les aliquots d’ADN de 60 microlitres et compléter les chambres inutilisées avec 60 microlitres de 1× PBS.

Connectez les électrodes au plat d'électroporation et saisissez les paramètres appropriés sur l'appareil d'électroporation. Utilisez une pince fine pour saisir les rétines par le cristallin et transférez-les dans les chambres d'électroporation. Placez jusqu'à quatre rétines dans chaque chambre.

Disposez les rétines de manière à ce que la lentille s'appuie contre la barre métallique fixée à l'électrode positive. Essuyez la pince entre chaque chambre afin d'éviter tout transfert d'ADN d'une chambre à l'autre. Une fois toutes les rétines alignées, appuyez sur démarrer pour l'électroporation.

De petites bulles doivent se former sur la barre métallique fixée à l'électrode négative. Déconnectez les électrodes et éteignez l'électro à l'aide de pinces. Éloignez délicatement les rétines des parois de la chambre.

Transférez les rétines des chambres vers les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de dissection. À l’aide d’une pipette stérile, transférez les rétines du milieu de dissection vers les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de culture. Étiquetez les puits d’une plaque de culture stérile à six puits et ajoutez trois millilitres de milieu de culture dans chaque puit.

Utilisez des pinces stériles pour placer délicatement des filtres ronds Watman Nucleo à la surface du milieu dans chaque puits, le côté brillant des filtres étant orienté vers le haut. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, transférez un seul œil sur le filtre à l’aide d’une pipette de transfert stérile, le côté lentille vers le bas. Si l’œil se pose côté lentille vers le haut, réaspirer délicatement dans la pipette et recommencez.

Placez au maximum quatre rétines dans chaque puits et maintenez-les dans des gouttelettes séparées. Une fois les rétines placées dans les puits, transférez la plaque de culture dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et laissez pousser pendant la durée souhaitée. Habituellement, huit jours sont suffisants ; ici, une électroporation réussie se traduit par une expression du construit d'ADN sur un quart à un tiers de la surface rétinienne.

Les niveaux de fluorescence sont quantifiés en comparant des régions électroporées de manière uniforme exprimant le construit CRE à des régions situées en dehors de la rétine, puis en normalisant par rapport à l'expression contrôlée de la GFP. Les photorécepteurs en bâtonnets sont particulièrement efficacement transduits, comme indiqué. Voici les résultats d'une électroporation dans laquelle deux promoteurs spécifiques des bâtonnets dirigent l'expression de la GFP et du DS rouge dans la couche nucléaire externe.

En superposant les deux profils d'expression avec la coloration au DPI, indiquée ici en bleu, l'expression spécifique aux photorécepteurs devient évidente. Aucune expression n'est observée ni dans la couche interne claire ni dans la couche des cellules ganglionnaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de disséquer, d'effectuer l'enregistrement électrophysiologique et de cultiver des explants rétiniens de souris afin de quantifier l'activité des éléments régulateurs des kystes rétiniens.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.