Name: Quantifier lactivité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Apprenez à quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs dans la rétine de souris par électroporation d'explants. Cette méthode utilise des rapporteurs fluorescents pour analyser l'expression génique dans les photorécepteurs.

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Les auteurs tiennent à remercier Karen Laurent pour son aide à la construction de la section décrivant la chambre d&#39;électroporation.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
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</ol>

Électroporation explant est un moyen simple de quantifier l&#39;activité cis-régulatrices dans la rétine de souris en développement. Comparé à cis-régulatrices analyse par transgénèse souris, l&#39;électroporation est beaucoup moins cher, nécessitant souriceaux nouveau-nés que l&#39;ADN, d&#39;instruments de dissection, et l&#39;électroporation / équipement de culture de tissus. Il est également beaucoup moins de temps de consommation: l&#39;expérience on exige seulement quelques heures de temps de préparation, une période de culture d&#39;environ huit jours, et quelques heures à la fin de l&#39;expérience de l&#39;imagerie et l&#39;analyse des données. Électroporation explant est également supérieure à la culture cellulaire à base de cis-régulation réelle analyse puisque le tissu rétinien est utilisé. La rétine se développe tout à fait normalement dans les explants culture qu&#39;elle forme trois couches distinctes cellulaire (couche externe nucléaire, couche intérieure nucléaire, et la couche de cellules ganglionnaires), mais ne parviennent pas à élaborer des photorécepteurs segments externes. Un autre avantage est que l&#39;électroporation explant est hautement reproductible. Les mêmes constructions électroporés dans les rétines différentes, voire des jours différents, se traduit généralement par les mêmes niveaux d&#39;expression relative. En outre, depuis les plasmides par électroporation sont pensés pour être maintenu épisomique dans le noyau et ne sont pas incorporés dans les chromosomes, ils ne semblent pas être soumis aux mêmes effets site d&#39;intégration qui perturbent cis-régulatrices analyse effectuée sur des souris transgéniques. Électroporation explantation ne présentent plusieurs limites. D&#39;abord, seules les cellules qui sont encore dans le cycle cellulaire peut être efficacement transduites par électroporation 15. Au P0, baguettes et autres plus tard-types de cellules rétiniennes (cellules bipolaires, cellules amacrines, M ller gliales) sont les principales populations de cellules ciblées par cette méthode. L&#39;électroporation des cônes photorécepteurs par P0 électroporation a été rapporté 16, mais l&#39;efficacité semble être faible. Une deuxième limitation est que la culture des explants-delà des résultats deux semaines dans la malformation progressive de la rétine et n&#39;est donc pas recommandé. Si la quantification promoteur est tenu au timepoints tard, cependant, une électroporation in vivo dans 9 peuvent être effectuées, suivies par une dissection rétine au point de temps désiré, plat de montage de la rétine disséqué, et la quantification comme décrit dans la section 9. Une troisième limitation est que ce test n&#39;est que modérément à haut débit. Contrairement à des analyses de culture à base de cellules qui peuvent tester des centaines de constructions en une seule expérience, la technique décrite dans ce protocole nécessite un minimum d&#39;une rétine de souris entier par la construction. Ainsi, seule une dizaine de constructions de couple peut être raisonnablement électroporation dans une journée. Une mise en garde supplémentaire à l&#39;égard de la quantification de l&#39;activité du promoteur en utilisant l&#39;approche actuelle est qu&#39;il ya un potentiel de «transpercement» de la fluorescence DsRed dans le canal de la GFP, en particulier lorsque les promoteurs dosant très forte. La raison de ceci est que le spectre d&#39;émission de DsRed recouvre partiellement celle de la GFP. Pour contourner ce problème, les filtres d&#39;émission optimisés devrait être utilisé que de minimiser le chevauchement spectral entre DsRed et GFP. Lorsque de tels ensembles de filtres optimisés ne sont pas disponibles, une autre solution possible serait d&#39;utiliser une protéine fluorescente décalée vers le bleu (par exemple, BFP ou CFP) en lieu et place de la GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> L&#39;électroporation vaisselle, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Voir la section 1 du protocole pour les modifications </td></tr><tr><td> 100% silicone caoutchouc aquarium de ciment </td><td> Perfecto fabrication </td><td></td><td></td></tr><tr><td> En rack microtube plastique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Seule la poignée de porte sera utilisé </td></tr><tr><td> Dremel </td><td></td><td></td><td> Pour la coupe de la poignée hors du rack tube en plastique </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> La concentration 100X </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Pour le stock de 1000X, resuspendre au 5mg/ml en 5mm HCl et filtre à stériliser </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square-ondes électroporateur </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtres Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 um </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Lamelles de verre # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0.16mm d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Microscope composé fluorescent équipé d&#39;une caméra </td><td></td><td></td><td> Caméra doit être monochromatique (par exemple, l&#39;ORCA-ER caméra par Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed ensemble de filtres pour microscope composé </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Cette bleedthrough ensemble de filtres minimise entre le rouge et le vert chanenels </td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifier l&#39;activité des cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Les facteurs de transcription dans les réseaux de gènes cellulaires de contrôle du modèle spatio-temporelle et les niveaux d&#39;expression de leurs gènes cibles en se liant aux éléments cis-régulateurs (CRE), courte (~ 300-600 pb) s&#39;étend de l&#39;ADN génomique qui peut rester en amont, en aval, ou dans les introns des gènes qu&#39;ils contrôlent. CRES (ie, exhausteurs / promoteurs) se composent généralement de plusieurs clusters sites de liaison pour les activateurs de la transcription et de répresseurs 1-3. Ils servent d&#39;intégrateurs logique de l&#39;entrée de la transcription de donner une sortie unitaire dans la forme de l&#39;activité du promoteur spatio-temporellement précis et quantitativement exacte. La plupart des études des mammifères cis-régulation à ce jour se sont appuyés sur la transgenèse de la souris comme un moyen de dosage de la fonction enhancer du CRE 4-5. Cette technique est fastidieuse, coûteuse et, à cause des effets de site d&#39;insertion, en grande partie non quantitatives. D&#39;autre part, les tests quantitatifs pour la CRE fonction de mammifères ont été développés dans les systèmes de culture de tissus (par exemple, deux tests luciférase), mais la pertinence in vivo de ces résultats est souvent incertaine. L&#39;électroporation offre une excellente alternative à la transgenèse souris traditionnelle en ce qu&#39;elle permet à la fois l&#39;évaluation spatio-temporelle et quantitative de l&#39;activité cis-régulatrices dans les tissus vivants de mammifères. Cette technique a été particulièrement utile dans l&#39;analyse de cis-régulation dans le système nerveux central, en particulier dans le cortex cérébral et la rétine 6-8. Alors que l&#39;électroporation de souris de la rétine, à la fois in vivo et ex vivo, a été développé et largement décrites par Matsuda et Cepko 6-7,9, nous avons récemment développé une méthode simple pour quantifier l&#39;activité des photorécepteurs spécifiques CRE de la souris électroporées rétines 10. Étant donné que la quantité d&#39;ADN qui est introduit dans la rétine par électroporation peut varier d&#39;une expérience à, il est nécessaire d&#39;inclure «le contrôle de chargement &#39;un co-électroporation dans toutes les expériences. À cet égard, la technique est très similaire à l&#39;essai à double luciférase utilisée pour quantifier l&#39;activité du promoteur dans les cellules cultivées. Lorsque dosant photorécepteur cis-régulatrices d&#39;activité, l&#39;électroporation est généralement effectuée sur des souris nouveau-nés (jour postnatal 0, P0) qui est le temps de la tige de production de pointe 11-12. Une fois les types de cellules rétiniennes deviennent post-mitotiques, l&#39;électroporation est beaucoup moins efficace. Compte tenu du taux élevé de natalité tige dans souriceaux nouveau-nés et le fait que les tiges constituent plus de 70% des cellules dans la rétine de souris adultes, la majorité des cellules qui sont électroporation à P0 sont des tiges. Pour cette raison, les photorécepteurs tige sont le type le plus facile de cellules rétiniennes à l&#39;étude par électroporation. La technique que nous décrivons ici est principalement utile pour quantifier l&#39;activité de la CRE photorécepteur.

Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l&#39;activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l&#39;ADN, la dissection de la rétine, l&#39;électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Les facteurs de transcription au sein des réseaux géniques cellulaires contrôlent le profil spatiotemporel et les niveaux d'expression de leurs gènes cibles en se liant à ...

L'objectif général de cette procédure est d'électroporer des implants rétiniens de souris portant des rapporteurs transcriptionnels fluorescents et de quantifier leurs niveaux d'expression. Cela est réalisé en premier lieu par l'isolement du tissu rétinien de souris néonatales par dissection. La deuxième étape de la procédure consiste à électroporer la rétine avec des constructions d'ADN rapporteur fluorescentes.La troisième étape de la procédure consiste à cultiver les rétines électroporées en tant qu'implants pendant huit jours. La dernière étape de la procédure consiste à récolter l'explant rétinien et à quantifier les niveaux d'expression des marqueurs fluorescents. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les niveaux d'expression relatifs de différents construits rapporteurs promoteurs dans la rétine de souris en développement par électroporation de x explants, suivie d'une analyse quantitative des données.Je m'appelle Joe Corbo et je suis membre du corps professoral du Département de pathologie et d'immunologie à la faculté de médecine de l'Université de Washington à St. Louis. Aujourd'hui, nous allons présenter un protocole vidéo démontrant la technique d'électroporation X explant dans les rétines de souriceaux nouveau-nés afin de quantifier l'activité d'éléments régulateurs cis spécifiques aux photorécepteurs, et ce protocole sera démontré par une étudiante diplômée de mon laboratoire, Cindy Montana. Commencez par stériliser la chambre d'électroporation et tous les instruments avec de l'éthanol à 70 % en prévision du prélèvement oculaire.Désinfectez les gants et le plan de travail avec de l'éthanol et maintenez des conditions stériles tout au long de la procédure. Ensuite, dans une hotte de culture tissulaire, pipetez six millilitres de milieu de dissection dans une boîte de Pétri stérile de 60 millimètres et trois millilitres de milieu dans deux boîtes stériles de 35 millimètres. De retour au plan de travail, désinfectez la tête et le cou d’un souriceau nouveau-né avec de l’éthanol à 70 %.Après avoir rapidement décapité la tête à l’aide de ciseaux, transférez la tête dans une boîte stérile de 100 millimètres, puis découpez le cuir chevelu avec de petits ciseaux afin d’exposer les yeux sous un microscope stéréo. À l’aide de pinces courbes, retirez délicatement l’œil de son orbite, puis placez l’œil dans une boîte de 35 millimètres contenant le milieu de dissection. Continuez à collecter des yeux de manière à obtenir trois à quatre yeux par aliquot d’ADN à électroporer, en conservant les yeux et le milieu de dissection à température ambiante jusqu’à la fin de la procédure.Stérilisez une lame de rasoir et l'emballage d'une pipette de transfert en plastique stérile à l'aide d'éthanol à 70 %, puis utilisez la lame pour couper l'extrémité de la pipette suffisamment haut afin de pouvoir pipeter un œil entier. À l'aide de la pipette élargie, transférez un œil depuis la boîte de 35 millimètres vers la boîte de 60 millimètres sous un microscope stéréoscopique à fort grossissement. Utilisez une pince fine pour retirer tout tissu, comme les muscles extraoculaires et la graisse, situés à la surface de l'œil.Ensuite, retirez le nerf optique en le pincant à la base. Afin d'isoler la rétine, percez un petit trou dans la sclérotique au niveau du limbe ; la sclérotique et l'épithélium pigmentaire de la rétine apparaissent brillants par rapport au tissu rétinien, qui est gris mat. Insérez une branche de chaque paire de forceps dans l'orifice et déchirez délicatement la sclérotique et l'ÉPR.Veillez à laisser l'objectif en place. Utilisez la pipette élargie pour transférer la rétine disséquée dans la deuxième boîte de 35 millimètres contenant le milieu. Récupérez toutes les rétines et conservez-les dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.Jusqu'à l'électroporation, travailler sous hotte de culture tissulaire pour chaque ADN Eloqua à électroporer : remplir une boîte stérile de 35 millimètres avec du milieu de dissection et une deuxième boîte avec du milieu de culture. À l’aide d’une pipette P200, rincer les chambres de la boîte d’électroporation avec 1× PBS stérile, trois fois. Remplir les chambres avec les aliquots d’ADN de 60 microlitres et compléter les chambres inutilisées avec 60 microlitres de 1× PBS.Connectez les électrodes au plat d'électroporation et saisissez les paramètres appropriés sur l'appareil d'électroporation. Utilisez une pince fine pour saisir les rétines par le cristallin et transférez-les dans les chambres d'électroporation. Placez jusqu'à quatre rétines dans chaque chambre.Disposez les rétines de manière à ce que la lentille s'appuie contre la barre métallique fixée à l'électrode positive. Essuyez la pince entre chaque chambre afin d'éviter tout transfert d'ADN d'une chambre à l'autre. Une fois toutes les rétines alignées, appuyez sur démarrer pour l'électroporation.De petites bulles doivent se former sur la barre métallique fixée à l'électrode négative. Déconnectez les électrodes et éteignez l'électro à l'aide de pinces. Éloignez délicatement les rétines des parois de la chambre.Transférez les rétines des chambres vers les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de dissection. À l’aide d’une pipette stérile, transférez les rétines du milieu de dissection vers les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de culture. Étiquetez les puits d’une plaque de culture stérile à six puits et ajoutez trois millilitres de milieu de culture dans chaque puit.Utilisez des pinces stériles pour placer délicatement des filtres ronds Watman Nucleo à la surface du milieu dans chaque puits, le côté brillant des filtres étant orienté vers le haut. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, transférez un seul œil sur le filtre à l’aide d’une pipette de transfert stérile, le côté lentille vers le bas. Si l’œil se pose côté lentille vers le haut, réaspirer délicatement dans la pipette et recommencez.Placez au maximum quatre rétines dans chaque puits et maintenez-les dans des gouttelettes séparées. Une fois les rétines placées dans les puits, transférez la plaque de culture dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et laissez pousser pendant la durée souhaitée. Habituellement, huit jours sont suffisants ; ici, une électroporation réussie se traduit par une expression du construit d'ADN sur un quart à un tiers de la surface rétinienne.Les niveaux de fluorescence sont quantifiés en comparant des régions électroporées de manière uniforme exprimant le construit CRE à des régions situées en dehors de la rétine, puis en normalisant par rapport à l'expression contrôlée de la GFP. Les photorécepteurs en bâtonnets sont particulièrement efficacement transduits, comme indiqué. Voici les résultats d'une électroporation dans laquelle deux promoteurs spécifiques des bâtonnets dirigent l'expression de la GFP et du DS rouge dans la couche nucléaire externe.En superposant les deux profils d'expression avec la coloration au DPI, indiquée ici en bleu, l'expression spécifique aux photorécepteurs devient évidente. Aucune expression n'est observée ni dans la couche interne claire ni dans la couche des cellules ganglionnaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de disséquer, d'effectuer l'enregistrement électrophysiologique et de cultiver des explants rétiniens de souris afin de quantifier l'activité des éléments régulateurs des kystes rétiniens.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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