Quantifier l'activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

L’objectif global de cette procédure est d’électropurifier des implants rétiniens de souris avec des rapporteurs transcriptionnels fluorescents et de quantifier leurs niveaux d’expression. Ceci est accompli en isolant d’abord le tissu rétinien de souris néonatale par dissection. La deuxième étape de la procédure consiste à électro la rétine avec des constructions rapporteures d’ADN fluorescentes.

La troisième étape de la procédure consiste à cultiver les rétines électroporées sous forme d’implants pendant huit jours. La dernière étape de la procédure consiste à prélever l’explan rétinien et à quantifier les niveaux d’expression des rapporteurs fluorescents. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les niveaux d’expression relatifs de différentes constructions de promoteur rapporteur dans la rétine de souris en développement grâce à l’électroporation x explan, suivie d’une analyse quantitative des données.

Je m’appelle Joe Corbo et je suis membre du corps professoral du Département de pathologie et d’immunologie de la faculté de médecine de l’Université Washington à Saint-Louis. Et aujourd’hui, nous allons présenter un protocole vidéo démontrant la technique de l’électroporation par explan X dans les rétines de souris nouveau-nées dans le but de quantifier l’activité des éléments régulateurs CYS spécifiques aux photorécepteurs et la démonstration de ce protocole sera faite par une étudiante diplômée de mon laboratoire, Cindy Montana. Stérilisez d’abord la chambre d’électroporation et tous les instruments avec de l’éthanol à 70 % en vue du prélèvement oculaire.

Désinfectez les gants et la paillasse avec de l’éthanol et maintenez des conditions stériles tout au long de la procédure. Ensuite, dans une hotte de culture tissulaire, pipetez six millilitres de milieu de dissection dans une boîte de Pétri stérile de 60 millimètres, et trois millilitres de milieu dans deux boîtes stériles de 35 millimètres. De retour sur la paillasse, désinfectez la tête et le cou d’un bébé souris nouveau-né avec de l’éthanol à 70 %.

Après avoir rapidement décapité la tête à l’aide de ciseaux, transférez la tête dans une boîte stérile de 100 millimètres, coupez le cuir chevelu avec de petits ciseaux pour exposer les yeux sous un microscope de dissection. À l’aide d’une pince incurvée, retirez doucement l’œil de l’orbite, puis placez l’œil dans une boîte de 35 millimètres contenant une dissection. Douleur moyenne. Continuez à collecter les yeux de manière à ce qu’il y ait trois à quatre yeux par aliquote d’ADN à électroporer, en gardant les yeux et le milieu de dissection à température ambiante jusqu’à ce que vous ayez terminé.

Désinfectez à la fois une lame de rasoir et l’emballage d’une pipette de transfert en plastique stérile avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez la lame de rasoir pour couper la pointe de la pipette suffisamment haut pour qu’un œil entier puisse être pipeté. À l’aide de la pipette élargie, transférez un œil de la boîte de 35 millimètres à la boîte de 60 millimètres sous un microscope de dissection à haute puissance. Utilisez des pinces fines pour retirer tout tissu tel que les muscles extraoculaires et la graisse de la surface de l’œil.

Retirez ensuite le nerf optique en le pinçant à la base. Afin d’isoler la rétine, percez un petit trou dans la sclérotique au niveau du limbe, la sclérotique et l’épithélium pigmenté rétinien apparaissent brillants par rapport au tissu rétinien, qui est Matt Gray. Insérez une broche des deux paires de pinces dans le trou et déchirez doucement la sclérotique et l’EPR.

Assurez-vous de laisser l’objectif en place. À l’aide de la pipette élargie, déplacez la rétine disséquée dans la deuxième boîte de 35 millimètres contenant du milieu. Collectez toutes les rétines et stockez-les dans un incubateur de culture de tissus à 37 degrés Celsius.

Jusqu’à ce que l’électroporation fonctionne dans un capot de culture tissulaire pour chaque DNA Eloqua à électroporer, remplissez une boîte stérile de 35 millimètres avec un milieu de dissection et une deuxième boîte avec du milieu de culture. À l’aide d’une pipette P 200, laver les chambres de la boîte d’électroporation avec une XPB S3 stérile. Remplissez les chambres avec les aliquotes d’ADN de 60 microlitres et remplissez toutes les chambres inutilisées avec 60 microlitres d’un XPBS.

Connectez les électrodes à la parabole d’électroporation et entrez les paramètres appropriés sur l’électro. À l’aide d’une pince fine, saisissez les rétines par le cristallin et transférez-les dans les chambres d’électroporation. Placer jusqu’à quatre rétines dans chaque chambre.

Disposez les rétines de manière à ce que le cristallin s’appuie contre la barre métallique fixée à l’électrode positive. Essuyez la pince entre chaque chambre pour éviter le transfert d’ADN d’une chambre à l’autre. Une fois que toutes les rétines sont alignées, appuyez sur start sur l’électro.

De minuscules bulles doivent se former sur la barre métallique fixée à l’électrode négative. Débranchez les électrodes et éteignez l’électro à l’aide d’une pince. Éloignez doucement les rétines des parois de la chambre.

Transférez les rétines des chambres dans les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de dissection. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférez les rétines du milieu de dissection dans les boîtes de 35 millimètres contenant le milieu de culture. Étiquetez les puits d’une plaque de culture stérile à six puits et remplissez chaque puits avec trois millilitres de culture. Douleur moyenne.

À l’aide d’une pince stérile, faites flotter des filtres ronds Watman Nucleo au-dessus du milieu dans chaque puits, le côté brillant des filtres étant orienté vers le haut. À l’aide d’une lunette de dissection, transférez une seule rétine sur le filtre avec la lentille de pipette de transfert stérile vers le bas. Si la rétine atterrit côté lentille vers le haut, ramenez-la dans la pipette et réessayez.

Ne placez pas plus de quatre rétines dans chaque puits et conservez-les dans des gouttelettes séparées. Une fois que les rétines ont été placées dans les puits, déplacez la plaque de culture dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et cultivez-la pendant la durée souhaitée. Habituellement, huit jours sont observés ici, l’électroporation réussie entraîne l’expression de la construction de l’ADN sur un quart à un tiers de la surface rétinienne.

Les niveaux de fluorescence sont quantifiés en comparant des régions uniformément électroporées exprimant la construction CRE à des régions à l’extérieur de la rétine, puis en normalisant pour contrôler l’expression de la GFP. Les photorécepteurs en bâtonnets, en particulier, sont efficacement transduits. Voici les résultats d’une électroporation dans laquelle deux promoteurs spécifiques à des bâtonnets déterminent l’expression de la GFP et du rouge DS dans la couche nucléaire externe.

En superposant les deux modèles d’expression avec la coloration DPI montrée ici en bleu, l’expression spécifique du photorécepteur est apparente. Aucune expression n’est observée ni dans la couche interclaire ni dans la couche de cellules ganglionnaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de disséquer l’électro et la culture d’explants rétiniens de souris dans le but de quantifier l’activité des éléments régulateurs du kyste rétinien.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.