Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

L’objectif général de ce film est de démontrer comment mesurer l’activité du réseau à partir de tranches de cerveau corticales en développement à l’aide d’un indicateur fluorescent sensible au calcium. Les tranches de cerveau DY sont fabriquées à partir du cortex entéral en développement d’une jeune souris. Les neurones et les astrocytes sont chargés de marqueurs dépendants du calcium.

Les changements dans la fluorescence des colorants dépendants du calcium reflètent des changements dans l’activité cellulaire. Les cellules non neuronales, y compris les astrocytes, les cellules microgliales et les cellules endothéliales, peuvent être colorées à l’aide de colorants marqueurs spécifiques. L’activité du réseau cortical est enregistrée à l’aide d’un time-lapse Les cellules d’imagerie multiphotoniques sont détectées au sein du réseau en créant une pile d’images 3D à travers la région d’intérêt.

Les changements de fluorescence cellulaire à travers plusieurs cellules peuvent ensuite être analysés pour lire l’activité du réseau cortical en développement. L’activité spontanée synchronisée du système nerveux est l’activité spontanée et synchronisée du réseau. Une activité synchronisée a été observée dans de nombreuses régions neuronales en développement différentes, y compris le cortex intact de la moelle épinière et les préparations de cultures neuronales dissociées pendant les périodes d’activité spontanée des neurones, dépolarisés au feu, des pics uniques ou des rafales de potentiels d’action activant de nombreux canaux de fer, y compris les canaux calciques voltage-dépendants conduisant à un afflux de calcium.

Une activité hautement synchronisée a été mesurée à partir de réseaux locaux à l’aide d’électrodes de terrain ou de réseaux multi-électrodes. Ceux-ci permettent des taux d’échantillonnage temporels élevés, mais donnent une résolution spatiale plus faible en raison de la lecture intégrée de l’activité cellulaire. La résolution de l’activité neuronale par cellule unique est possible en utilisant l’électrophysiologie par patch clamp de neurones uniques pour mesurer les taux de décharge.

Cependant, la capacité de mesure à partir d’un réseau est limitée au nombre de neurones patchés simultanément, et n’est généralement que d’un ou deux neurones. L’utilisation de colorants indicateurs fluorescents dépendants du calcium a permis de mesurer l’activité synchronisée à travers un réseau de cellules. Cette technique offre à la fois une haute résolution spatiale et un échantillonnage temporel suffisant pour enregistrer l’activité spontanée du réseau en développement.

Les indicateurs fluorescents sensibles au calcium, tels que l’ester URA 2:00 AM, contiennent des groupes d’acide carboxylique qui sont capables de se lier aux mines de calcium. Ces colorants fluorescents sont activés par des longueurs d’onde lumineuses spécifiques, soit à l’aide d’une microscopie à un photon ou à deux photons. Le nombre de photons émis par le colorant est modifié transitoirement lors de la liaison du calcium.

Ce changement du nombre de photons ou de la fluorescence est signalé comme le signal delta FF et correspond à un changement du niveau de calcium dans le neurone. La mesure des changements dans les indicateurs sensibles au calcium est une mesure utile de l’activité du réseau dans les cellules en développement. Bonjour, je m’appelle Rianna Morty et je m’appelle Julie Abbots.

Nous sommes du Département de neurophysiologie interprétative et de l’université d’Amsterdam. Nous avons utilisé l’imagerie calcique pour étudier l’activité fonctionnelle dans le développement des tissus du cortex de la souris à l’aide d’indicateurs sensibles au calcium à l’imagerie multifocale. L’objectif de ce court métrage est de démontrer comment ces méthodes peuvent être utilisées pour mesurer à la fois les modèles d’activité spontanée et évoquée dans les réseaux en développement dans le système nerveux.

Retirez rapidement le cerveau du crâne d’une jeune souris pour réduire les dommages aux circuits neuronaux. Disséquez le cerveau dans une solution de tranche glacée. La solution en tranches contient du chlorure de coline au lieu du sodium couramment utilisé dans A TSF pour les enregistrements neuronaux.

Dans ces expériences, nous fabriquons des coupes de cerveau dans le cortex entéral du cerveau de souris en développement. Placez un morceau de papier filtre sur une boîte pétro et mouillez-le avec quelques millilitres de A TSF. Transférez le cerveau sur le morceau de papier filtre.

Coupez les hémisphères en deux à l’aide d’une lame de rasoir à un seul tranchant. Séparez les deux hémisphères. Remettez-en un dans la solution de tranche glacée avec l’hémisphère restant.

Retirez le cervelet avec la lame de rasoir. Retournez un hémisphère sur sa ligne médiane et faites une coupe d’environ un millimètre à partir de la surface dorsale avec un léger angle de la lame vers l’extrémité rostrale. Retournez le cerveau.

Sa surface récemment coupée à l’aide d’un oiseau en coton et d’une spatule en métal. Transférez le cerveau dans le bloc de coupe en métal. Poussez doucement le cerveau de la spatule avec un oiseau de coton sur la surface collée.

Des coupes de cerveau de 300 micromètres sont coupées pour les jeunes tissus et la fréquence des lames est généralement plus lente que celle utilisée pour les tissus plus matures. Une fois coupées, transférez chaque tranche à l’aide d’une pipette en verre, les tranches sont transférées dans la chambre de maintien, qui contient du TSF A oxygéné à température ambiante. Le LCR A contient un rapport magnésium/calcium plus élevé que la solution de LCR A.

Utilisé pour l’enregistrement, les tranches sont laissées pendant une heure pour récupérer. Pour charger les cellules avec un indicateur dépendant du calcium ou un marqueur spécifique à la cellule, des tranches doivent être transférées dans une chambre pour la procédure de coloration. Bien qu’il existe des chambres commerciales, l’une d’entre elles peut facilement être assemblée à partir d’un équipement de laboratoire standard à très faible coût.

Pour fabriquer une chambre de coloration, vous aurez besoin de l’équipement de laboratoire de base suivant, de deux boîtes de Pétri en plastique, d’une seringue de 10 millilitres, d’une section de tube de silice, d’un insert de culture cellulaire avec une super colle à membrane semi-perméable, de trois petits connecteurs de tube et d’une aiguille à port fin. Prenez la grande boîte de Pétri et faites un petit trou avec une tige chauffante à travers la paroi latérale. Prenez la petite boîte de Pétri et faites un trou de diamètre similaire, suffisamment grand pour que le tube en silicone puisse passer à travers.

Passez une section de tube en silicone à travers le trou et formez une boucle à l’intérieur du petit plat. Utilisez de la super colle pour sceller l’extrémité ouverte du tube. Collez ensuite le reste du tube sur la paroi intérieure de la petite boîte de Pétri.

Placez la petite boîte de Pétri au centre de la grande et collez-la en place. Prenez l’extrémité restante du tube en silicone et passez-la à travers le petit trou pratiqué dans la paroi latérale de la boîte de Pétri. Prenez une aiguille fine et faites de petits trous dans le tube en silicone à l’intérieur de la boîte de Pétri.

Faites les trous à intervalles réguliers pour une fusion uniforme. Prenez bien une culture cellulaire avec une membrane semi-perméable à l’aide d’un scalpel chauffé. Coupez les premiers centimètres du puits pour laisser un plat peu profond pour contenir les tranches pendant l’incubation.

Placez le plat peu profond au centre du petit plat entouré du tube en silicone poreux. Faites un trou d’environ un demi-centimètre à un centimètre de diamètre dans le couvercle du grand plat. Prenez une seringue en plastique de 10 millilitres à l’aide d’un scalpel chauffé.

Faites une entaille inclinée pour retirer l’extrémité de la seringue. Appliquez de la super colle sur la surface coupée du tube de la seringue. Collez-le directement sur le trou du grand couvercle de la boîte de Pétri.

Fixez un connecteur de tubulure à l’extrémité de l’embout de la seringue. Placez le plat peu profond au centre de la petite boîte de Pétri en vous assurant que le tube de gaz poreux se trouve autour du plat. Ce tube est ensuite relié à une alimentation en gaz carbogen pour oxygéner les tranches.

Pendant l’incubation, replacez le couvercle du grand bole, qui est également relié directement à l’alimentation en gaz par l’embout de la seringue. Cela apportera une réserve de voiture et de gaz sur les tranches pendant l’incubation pour éviter le blanchiment du colorant. Toutes les procédures sont effectuées avec le moins de lumière possible, et le colorant et les tranches sont conservés dans l’obscurité.

Remplissez la chambre de coloration avec environ un millilitre et demi de A TSF à partir du porte-tranche. Placez la chambre d’interface à l’intérieur et remplissez-la d’un autre millilitre de A TSF. Il est important de maintenir un bon apport en oxygène pour garder les tissus en bonne santé et pour une bonne charge de la tranche.

La coloration se produit à environ 35 degrés C pour faciliter l’absorption du colorant dans les neurones pendant que la chambre de coloration se réchauffe. Préparez le colorant indicateur pour fira 2:00 AM Ester. Ajoutez neuf microlitres de DMSO avec un microlitre d’acide onique dans un flacon de 50 microgrammes.

DMSO et acide onique. Agissent comme des agents permanents pour permettre au colorant d’être absorbé à travers la membrane lipidique. Agitez le flacon pendant 15 minutes pour vous assurer que le colorant est complètement dissous.

Pour la coloration, transférez chaque tranche dans l’interface. Insérer dans la chambre de coloration. Tapotez le colorant directement sur la région d’intérêt au-dessus des tranches, fermez le couvercle de la chambre de coloration.

Laissez les tranches incubées à l’obscurité pendant 20 à 40 minutes selon l’âge du maus utilisé. Après l’incubation, transférez les tranches dans le porte-tranches pour éliminer tout excès de colorant restant. Les protocoles de coloration pour l’imagerie calcique peuvent également être adaptés aux tissus plus anciens.

Cela nécessite une étape supplémentaire de pré-incubation. Transférez les anciennes tranches dans un plat de pré-incubation peu profond rempli de trois millilitres d’un LCR et de huit microlitres de solution de crème quatre à 0,5 % Chauffer à 35 degrés C pendant trois minutes. Transférez ensuite les tranches dans l’interface, insérez-les dans la chambre de coloration et suivez les procédures normales de coloration.

Il est également possible de colorer ces coupes pour les cellules non neuronales, à savoir les astrocytes, les cellules microgliales et les cellules endothéliales. Le soufre rumine 1 0 1 peut être utilisé pour colorer les astrocytes pour le soufre domine. Faites une solution de 10 micromolaires pipez le colorant violet sur la région d’intérêt dans les tranches.

Laissez incuber pendant une période de 15 minutes. Transférez les tranches dans la chambre de maintien pour éliminer tout excès de colorant. Le conjugué FSE de la lectine de la tomate peut colorer les cellules microgliales et endothéliales.

Pour la lectine de tomate, préparez une solution de 20 microgrammes par millilitre. Tapotez le colorant sur la région d’intérêt des tranches. Laissez les tranches incuber pendant une période de 45 minutes.

Transférez ensuite les tranches une fois de plus dans la chambre de stockage. Lors de l’imagerie, les coupes doivent être stables au microscope. Habituellement, une harpe métallique est placée pour maintenir le tissu, mais elle peut déformer de manière inégale la surface de la tranche, ne donnant qu’un champ de vision limité pour l’imagerie à éviter.

Ces tranches sont collées à la chambre d’enregistrement à l’aide d’une solution de POLYÉTHALINE ou de PEI. Le PEI est un polymère utilisé pour améliorer la fixation des cellules à une surface pendant au moins une heure. Avant de placer les tranches dans les chambres d’enregistrement, remplissez ces chambres avec quelques millilitres de solution PEI pour couvrir le sol de la chambre.

Tout d’abord, rincez l’IPE de la chambre avec de l’eau distillée, puis une solution de LCR trans. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement et retirez l’excès de solution de LCR A. Positionnez la tranche au milieu de la chambre à l’aide d’un pinceau fin.

Retirez tout autre LCR à l’aide de petits morceaux de papier filtre absorbant. Prenez soin de vous assurer que la tranche n’a plus de LCR A sur ses bords. Enfin, tapotez doucement un demi-millilitre de LCR A sur la tranche sans la détacher de la chambre.

Placez les chambres dans un grand récipient d’interface oxygéné et laissez reposer une heure de plus dans l’obscurité. Les changements dans les colorants indicateurs sensibles au calcium peuvent être enregistrés avec la microscopie à un ou deux photons. Nous utilisons un laser saphir de titane couplé à un microscope Olympus pour permettre l’imagerie à deux photons dans nos réseaux neuronaux.

De plus, nous utilisons un système de lunette de coupe biotechnologique L Vision avec une caméra MATSU à marteau CCD EM pour des taux de balayage de cadre accrus. Placez la chambre de coupe sous le microscope avec un flux stable d’A-T-S-F-A-T-S-F oxygéné contenant 1,6 millimolaire de calcium et 1,5 millimolaire. Le magnésium est chauffé à environ 30 degrés C dans la configuration à l’aide d’une lumière blanche.

Localisez la région d’intérêt dans la tranche et concentrez-vous sur la surface. Éteignez les lumières et fermez la porte de l’armoire d’enregistrement. Pour réduire les niveaux de lumière de fond.

De nombreux progiciels commerciaux ou ouverts sont disponibles pour enregistrer et analyser des images. Dans notre laboratoire, nous utilisons un logiciel d’inspection pour l’acquisition de Lavis Biotech. Pour commencer l’imagerie, sélectionnez le mode de détection de la caméra CCD. Réglez la longueur d’onde pertinente pour votre indicateur.

Pour fira 2:00 AM Ester, nous réglons l’excitation à 820 nanomètres dans le logiciel de lunette de réglage. Sélectionnez le mode de balayage 64 B. Choisissez la taille de champ de vision et la résolution en pixels optimales pour la région qui vous intéresse.

Sélectionnez une fréquence d’images et une rotation des pixels appropriées si nécessaire pour l’échantillonnage de votre image. Ouvrez l’obturateur laser prêt pour l’imagerie continue. Utilisation du mode d’imagerie continu.

Ajustez le gain et l’intensité du laser et concentrez-vous sur le réseau neuronal que vous souhaitez imager. Arrêtez l’analyse. Sélectionnez les paramètres time-lapse pour la fréquence d’images et la durée de la séquence.

Après l’imagerie en accéléré, faites une pile Z d’images marquant 20 microns au-dessus et 20 microns en dessous par pas d’un micron. Cette pile Z est utilisée pour la détection des cellules pendant l’analyse. Exportez les fichiers enregistrés sous la forme d’une pile d’images TIFF.

Pour conclure, nous avons montré l’utilisation d’indicateurs calciques pour mesurer l’activité synchrone spontanée du réseau dans le cortex en développement. Vous trouverez plus de détails sur la méthodologie et les réactifs dans les fiches techniques qui accompagnent ce film pour vous permettre de mettre en place la technique dans votre propre laboratoire.