在干细胞移植在体外模拟缺血/再灌注模型

将心脏来源的细胞置于细胞培养板上以模拟缺血。再灌注模型缺血是在无葡萄糖培养基中 150 分钟实现的，而氧气水平低于 0.5%这个缺血期导致大多数细胞缩小和咆哮。然后重新引入正常的培养基和氧气水平以模拟再灌注。

添加间充质干细胞并与受损细胞一起培养。共培养 24 小时后，用钙和以太坊同源二聚体对细胞进行染色 为了区分活细胞和死细胞，共聚焦显微镜，它清楚地显示两个细胞群及其相互作用 流式细胞术分析揭示了三个受损细胞簇，可以将其绘制在图表上并进行统计分析 干细胞移植。方案正在进入临床实践，获得更好的结果，使方案更加稳健，并为植入细胞寻找新的来源，这些都是最近研究的重点。

研究细胞疗法的有效性并非易事，需要新的工具来研究治疗过程中涉及的机制。我们设计了一个实验方案，以便观察缺血、灌注损伤和干细胞移植后的细胞连接甚至亚细胞机制。我们的设计标准，我们的全体外系统，但只存在宿主和供体细胞。

所以它与周围组织隔离开来。在受伤前、受伤中和受伤后连续测量细胞活力长达 24 小时。并清楚地识别两种细胞群，以便追踪移植细胞的命运。

为了达到这个目标，我们制定了氧气、葡萄糖剥夺（通常缩写为 OGD）的方案，然后是复氧期。我们选择的宿主细胞是 9 岁 C 两个细胞，通过已知的红色心脏成肌细胞系。OGD 后，通过将骨髓来源的间充质干细胞移植到培养物中来支持受损细胞。

这种设置使我们能够使用共聚焦森林和显微镜研究细胞间连接，并通过流式细胞术量化受损细胞的存活率。让我们开始工作，看看我们是怎么做的。从 H 9 C 2 细胞中取出培养基。

用 PBS 洗涤细胞两次，并用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 消化，放置培养皿 5 分钟。在 37 度培养箱中，用 DMEM 培养基抑制胰蛋白酶。以 1200 RPM 离心细胞 8 分钟。

去除超级 natin 后，将细胞重悬于 1 毫米 DM EM 培养物中，用 he 细胞仪对细胞进行培养基计数，使用 Triam 蓝染色 C 30， 000 H 9 C 每孔 2 个细胞。在 12 孔板中，将板放入 37 度二氧化碳培养箱中 24 小时。通过抽吸去除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。

添加 3 毫米无葡萄糖培养基。将板放入细胞孵育系统中。启动氮气以将氧气从培养系统中清除。

等到氧气水平达到 0.5%然后启动计时器，0.5%氧气意味着大约 3 毫米的汞部分张力使细胞承受 150 分钟的模拟缺血。在缺血期间，细胞从表面脱落，它们的膜开始咔嚓咔嚓。我们发现每个群体需要的时间长度略有不同，反对达到 60% 到 80% 的细胞图像。

这就是为什么我们建议从两个 R 孵化开始。如果还不够，请增加 OGD 的时间。在我们的例子中，9 岁 C 两个细胞通常需要 150 到 70 分钟的 OGD 在模拟缺血结束时。

从细胞中取出无葡萄糖培养基，将普通培养基移液至孔中。将 12 孔板置于 37 度二氧化碳培养箱中 30 分钟。这是再灌注期。

在模拟缺血期间，准备用于移植的拯救细胞。在 DMEM 培养物中以 1 比 200 的比例稀释荧光饮食、充满活力的 DID。培养基：从拯救细胞中吸出培养基，并从充满活力的 Brent Place 培养皿中加入 300 μL DMEM，在 37 度二氧化碳培养箱中放置 30 分钟。

灌注结束时 30 分钟后，以每孔 1000 个间充质干细胞再灌注至缺血后 H 9 C 两个心脏成肌细胞。初始步骤与 H 9 C、两次接种、用 PBS 胰蛋白酶洗涤两次并计数相同。将细胞共培养物放入 37 度二氧化碳培养箱中 24 小时。

24 小时后。从具有 ization 的孔中收获培养基和粘附细胞。收集培养基也非常重要，因为在 24 小时的孵育过程中，一些死细胞可能会从培养皿表面分离。

细胞悬浮在 500 微升活、死、死溶液、死溶液、5 个 NMO 钙和 400 个 NMO 以太坊同源二聚体的 PBS 中，以 5 倍/毫升 10 倍的剂量达到 4 个细胞的幂。在共培养的情况下，间充质干细胞通过相应的荧光细胞标记与 H 9 C 2 细胞区分开来。通过这种方式，可以检测细胞融合和细胞间接触位点。

死细胞的比率可以在四个独立的视野中进行评估，以盲法对每种培养物使用 10 倍物镜，从而获得可重复的细胞计数结果。将细胞转移至流式细胞仪管中。启动 cell Quest Pro 软件以设置流式细胞仪进行测量。

准备活细胞和死细胞的对照样品。在正常条件下以相同密度培养活细胞，并用钙染色。用 10 μmol 过氧化氢处理一小时后制备死细胞，用 Ethereum、同型二聚体染色，并以与调整仪器设置相同的方式收获，使活细胞为钙阳性，Ethereum 同型二聚体为阴性。

虽然死细胞是钙阴性的，而以太坊同型二聚体是阳性的，但这些群体的百分比可以用图表上的条形表示，并且可以对这些值进行统计分析。我们发现，添加健康干细胞会增加细胞群中存活细胞的比例。有趣的是，我们还观察到，受伤后保存的细胞可以从死亡的细胞中分离出来，也可以从仍然活着的细胞中分离出来。

我们认为这个群体值得进一步调查。看完这个视频，你应该对如何以标准化的方式进行体外干细胞移植的模拟缺血实验有了很好的了解。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。如果您有任何技术问题，请随时与我们联系。我们会在那里提供帮助。