Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

L’objectif global de cette procédure est de raccourcir l’approche IPS classique de Yamanaka en générant directement des cellules progénitrices neurales induites à partir de la biopsie cutanée d’un patient à des fins thérapeutiques. Pour ce faire, il effectue d’abord une biopsie à l’emporte-pièce du patient afin d’obtenir des cellules fibroblastiques primaires qui peuvent être cultivées in vitro. La deuxième étape consiste à développer et à infecter ensuite des fibroblastes cultivés avec des virus qui codent pour des facteurs de reprogrammation afin d’induire une transdifférenciation.

Ensuite, la cellule progénitrice neurale induite ou les colonies INPC doivent être soigneusement sélectionnées par validation visuelle, puis isolées par prélèvement manuel environ 20 jours après l’infection. La dernière étape consiste à monocloner, à étendre les IPC dans le milieu de neuro-induction, finalement ciblé la différenciation in vitro ainsi que l’immunofluorescence La microscopie est utilisée pour montrer que les patients possèdent des IP directement convertis sont capables de se différencier en cellules neuronales et gliales, ce qui en fait une source pratiquement illimitée pour les applications biomédicales. L’avantage de cette technique de conversion directe par rapport aux méthodes existantes telles que la dérivation de type Yamanaka de cellules souches bleues puissantes induites et leur différenciation ultérieure est double.

La conversion de l’ID en cellules souches neurologiques induites multipotentes, que nous appelons cellules INS, est non seulement beaucoup plus rapide, mais aussi plus sûre. Ainsi, la procédure de transdifférenciation rendra beaucoup plus réalisable la production de cellules spécifiques au patient pour des applications thérapeutiques et la récolte d’un risque considérablement plus faible de formation de tumeurs par rapport aux cellules IPS. Grâce à cela, nous sommes maintenant en mesure de démanteler deux obstacles majeurs de la médecine régionale de nos jours.

C’est la sécurité et l’efficacité cliniques. Pour commencer la biopsie à l’emporte-pièce, désinfectez la peau du patient, anesthésiez la peau où la biopsie sera prélevée avec 0,5 à un millilitre de chlorhydrate de mépivacaïne intra cutanée. Faites la biopsie cutanée à l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de trois millimètres.

Rincez la biopsie avec une solution saline tamponnée au phosphate ou DPBS de dobe echo plus un microlitre par millilitre de gentamycine. Retirez la graisse de la biopsie à l’aide d’un scalpel et d’une pince. Rincez ensuite la biopsie deux fois de plus avec le tampon avant de l’aspirer complètement.

Couvrir la biopsie avec du dis deux et incuber pendant 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, aspirez complètement la pâte dys avant de laver la biopsie deux fois avec DPBS. Retirez l’épiderme à l’aide d’une pince à épiler, puis lavez la biopsie deux fois de plus avec du DPBS.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de collagénase de type deux et transférez dans un tube de 15 millilitres dans le tube. Ajoutez de la collagénase jusqu’à cinq millilitres. Volume total incubé pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius.

Centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 180 fois G et jetez ensuite la caisse. Remettez le granule en suspension dans 10 millilitres de gentamicine sérum fœtal DMEM avant de centrifuger à nouveau pendant cinq minutes à 180 fois G.Jetez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 1,5 millilitres du même milieu. Transférez ensuite l’échantillon dans un flacon de culture tissulaire adhérent T 25 et incubez à 37 degrés Celsius 5 % CO2, en changeant le milieu tous les trois jours après environ deux semaines.

Une fois que les cellules sont confluentes autour des parties de la peau, divisez les cellules à l’aide de trypsine EDTA comme décrit dans le protocole textuel. Élargissez davantage les cellules en changeant de milieu tous les trois jours et en les divisant lorsque les cellules sont confluentes. Après avoir exclu la contamination par les mycoplasmes par des tests standard, préparez les cellules pour l’expérience de conversion directe en lavant les cellules une fois avec du DPPS, puis aspirez le DPBS et ajoutez 2,5 millilitres de trypsine EDTA Après avoir incubé les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, 5 % CO2, tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules.

Remettez les cellules en suspension dans 2,5 millilitres de fibroblaste et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 180 fois G pendant cinq minutes et aspirez le snat. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de fibroblaste et pipetez de haut en bas pour générer une suspension de cellule unique.

Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules avant le placage. 30 000 cellules par puits. Dans une plaque à 24 puits, incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 La manipulation du virus doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique avec un équipement de sécurité individuelle approprié, y compris un masque chirurgical pour éviter l’exposition des muqueuses.

Pour effectuer l’infection en premier, remplacez le milieu cellulaire existant par 100 microlitres de milieu de fibroblaste. Ensuite, réanimez les aliquotes décongelées de T quatre, KLF quatre, SOX deux et cmix sendi virus dans un millilitre de milieu fibroblastique. Ajouter chaque virus dans un MOI de trois aux cellules et mélanger doucement incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 après 24 heures, aspirer le milieu et ajouter 500 microlitres de culture de milieu de neuro-induction, les cellules à 39 degrés Celsius, 5 % de CO2 à partir de maintenant, en changeant de milieu tous les deux jours le sixième jour après l’infection, Préparez des plaques à six puits enduites de laminine.

Ajoutez un millilitre d’un microgramme par millilitre de laminine dans du DPBS sur des plaques à six puits et maintenez les plaques à quatre degrés Celsius pendant 24 heures le septième jour après l’infection, divisez les cellules à l’aide de D-P-B-S-E-D-T-A comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez 500 microlitres de D-M-E-M-F 12 et transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 180 fois G pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 1,5 millilitre de milieu de neuro-induction en plaque les cellules sur des plaques à six puits recouvertes de stratifié et ajoutez l’inhibiteur de kinase RO à une concentration finale de 10 cultures micromolaires. Les cellules à 39 degrés Celsius, 5 % de CO2, changeant de milieu tous les deux jours à partir du 14e jour. Après la culture de l’infection, les cellules à 37 degrés Celsius 5 % CO2 Les colonies neuroépithéliales deviennent apparentes vers le 17e jour après l’infection, comme le montre la microscopie à contraste de phase.

Ils doivent être assez grands pour être cueillis vers le 20e jour après l’infection, un jour avant de cueillir le pelage 1 48. Plaque de puits avec laminine comme décrit dans le protocole de texte un jour plus tard, aspirez le stratifié des plaques et ajoutez 200 microlitres de milieu de neuro-induction dans les puits. Lavez une fois avec du DPBS les six plaques de puits contenant les colonies à cueillir avant d’ajouter deux millilitres de neuro-induction.

Moyen par puits d’une plaque à six puits : choisissez mécaniquement les cellules en grattant autour des colonies à l’aide d’une aiguille fine pour vous débarrasser des cellules environnantes et en cueillant les colonies à l’aide de pointes de pipette. Monté sur une pipette de 200 microlitres posée sur 50 microlitres. Transférez chaque colonie dans un puits d’une plaque de 48 puits recouverte d’un stratifié et générez mécaniquement une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas 10 fois.

Ajouter l’inhibiteur de la kinase R à une concentration finale de 10 micromolaires dans les cellules. Faites pousser les cellules sur la plaque à 48 puits à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 pendant deux jours. Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 à 90 % de fluidité.

Voir le protocole de texte pour l’expansion et la cryo-conservation des IPC pour la différenciation des IPC vers une culture de lignée neuronale. Les cellules sur des plaques revêtues de stratifié. Comme précédemment, changez le milieu en milieu neuro difficile lorsque les cellules sont confluentes à environ 70 % et continuez à changer le milieu tous les deux jours pendant trois semaines.

Ne divisez pas les cellules lors de la différenciation après trois semaines, les cellules doivent exprimer le marqueur neuronal TUJ one pour obtenir des neurones plus matures et des sous-types neuronaux. Poursuivre la différenciation jusqu’à trois mois pour la différenciation des CPI, en particulier vers une lignée gliale. Changez le milieu en milieu d’induction gliale, y compris 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique pour induire la différenciation en cellules précurseurs gliales.

Retirez la moitié du milieu et remplacez-la par un milieu frais tous les deux jours pendant environ deux semaines. Au cours de cette période, les cellules doivent être divisées une à trois en présence de 10 inhibiteurs micromolaires de la kinase R lorsque la fluidité de 100 % est atteinte après deux semaines. Différenciez davantage les cellules en astrocytes en changeant le milieu en milieu astrocytaire disponible dans le commerce lorsque les cellules sont presque confluentes, et en continuant à changer le milieu tous les deux jours, environ sept jours plus tard, les cellules commencent à exprimer des marqueurs astrocytaires.

Si les cellules deviennent confluentes à 100 % pendant le protocole de différenciation, divisez-les dans un rapport de un à deux. En présence de 10 micromolaires inhibiteurs de la kinase RO, l’infection des fibroblastes par les virus T 4K, LF quatre, SOX deux et cmix sendi et la culture dans des conditions de milieu neuro inductif ont entraîné un changement de morphologie des fibroblastes et l’émergence ultérieure de colonies. 17 jours après la génération de l’infection, les lignées cellulaires monoclonales peuvent être élargies et colorées positives pour les marqueurs de cellules souches neurales tels que SOX deux, SOX un neston et PAC six, ainsi que pour le marqueur de prolifération KI 67, alors qu’elles n’expriment pas le marqueur de pluripotence associé T quatre.

De plus, en ajoutant des facteurs de croissance neuronale au milieu de culture cellulaire, les cellules progénitrices neurales peuvent être différenciées en neurones en appliquant une différenciation astrocytaire. Les lignées cellulaires neurales progénitrices induites par protocole peuvent également être différenciées en lignées gliales, comme en juger par l’analyse des changements morphologiques typiques et la coloration contre le GFAP. Par cette conversion directe, nous générons des cellules neuroprogénitrices induites multipotentes à partir de fibroblastes de patients en trois à quatre semaines.

Ces cellules pourraient être utilisées pour de nombreuses applications biomédicales. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie, au diagnostic et à la modélisation des troubles neurodégénératifs comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson, ainsi que d’autres affections neurologiques.