Name: Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Découvrez la conversion directe de fibroblastes humains en progéniteurs neuronaux induits pour la médecine régénérative. Cette méthode accélère la génération de cellules neuronales patient-spécifiques sans passer par l'étape pluripotente.

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Nous tenons à remercier tous les membres du Stem Cell et Regenerative Medicine Group de l&#39;Université de Würzburg pour des suggestions utiles et Martina Gebhardt ainsi que Heike Arthen pour un excellent support technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), le ministère allemand de l&#39;éducation et de la recherche BMBF (01 GN 0813), les recherches bavaroise induite Réseau des cellules souches pluripotentes &quot;forIPS» et la «Stiftung Sibylle Assmus ». Figure 1 a été produit en utilisant Servier Medical Art, disponible à partir de www.servier.com.

Les fibroblastes humains utilisés dans cette étude ont été obtenues à partir d&#39;une biopsie de poinçon de la peau après l&#39;obtention du consentement et de la clairance éthique informé par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université de Würzburg, Allemagne (rapport éthique no: 96/11 en date du 10.06.2011). 1. biopsie de <ol><li> Désinfectez la peau du patient. Anesthésier partie de la peau dont la biopsie sera prélevé (de préférence une zone exposée au soleil moins) à l&#39;aide de 0,5 à 1 ml de chlorhydrate de mépivacaïne intradermique et préparer biopsie de la peau en utilisant une biopsie 3mm poinçon stérile, rincer biopsie avec du DPBS + 1 pl / 1 ml gentamicine et retirer graisse. Rincer la biopsie deux fois avec DPBS + gentamicine, aspirer DPBS complètement et couvercle biopsie avec Dispase II (2,4 U / ml) et incuber 16 - 18 h à 4 ° C. </li><li> Aspirer Dispase complètement, se laver deux fois avec DPBS et enlever l&#39;épiderme avec des pincettes. Laver deux fois avec DPBS biopsie, ajouter 2 ml de collagénase de type 2 (500 U / ml CDU), le transfert en tube de 15 ml et ajouter CollagenaSE jusqu&#39;à 5 ml volume total. Incuber pendant 45 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Centrifugeuse 5 min à 180 xg et éliminer le surnageant après. Resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-FCS-gentamicine-médias (10% de FCS, 1 pl / ml de gentamicine) et centrifuger à nouveau pendant 5 min à 180 x g. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de DMEM-FCS-gentamicine-médias. Transfert à T25 adhérent ballon de culture de tissu et incuber à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Changer de support tous les 3 jours. </li><li> Après environ 2 semaines, lorsque les cellules sont confluentes dans les parties de la peau, des cellules divisées à l&#39;aide de trypsine / EDTA (0,05%): des cellules de lavage une fois avec du DPBS, incuber 5 minutes à 37 ° C, 5% CO 2 après addition de 2 ml de trypsine / EDTA (0,05%), ajouter 2 ml de DMEM-FCS-gentamicine médias, transfert à tube de 15 ml et centrifuger à 180 g pendant 5 min; jeter le surnageant du culot et remettre en suspension dans quantité appropriée de DMEM-FCS-gentamicine-médias. </li><li> Étendre les cellules en changeant le milieu tous les 3 rd jour et le clivage comme décrit ci-dessus lorsque les cellules sont confluentes; ajout de gentamicine peut être arrêté après le passage 2. </li><li> Avant d&#39;utiliser les cellules pour des expériences de conversion directe, assurez-vous d&#39;exclure toute contamination par des mycoplasmes par des dosages standard. </li><li> Lorsque les cellules ont été élargis, vous pouvez commencer directement la conversion ou congeler les cellules vers le bas en utilisant 10% de DMSO et 90% de FCS. Les cellules doivent être stockées dans -80 ° C pendant 2 jours, puis transférés dans de l&#39;azote liquide pour un stockage à long terme. </li><li> Pour la préparation de la conversion, laver les cellules une fois avec DPBS, aspirer DPBS et ajouter 2,5 ml de trypsine / EDTA (0,05%). Maintenir pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2. Appuyez ballon doucement pour détacher les cellules, remettre en suspension dans 2,5 ml de milieu de fibroblastes (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% de NEAA + 1% de pyruvate de sodium) et à transférer 15 ml tube. Centrifuger à 180 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de médias fibroblastes et pipette haut et en bas pour générer suspension cellulaire unique. &lt;/ Li&gt; <li> Comptez le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage Fuchs-Rosenthal- ou Neubauer-cellule et la plaque 3 x 10 4 cellules par puits d&#39;une plaque 24. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. L&#39;infection des fibroblastes humains avec Sendai virus et transdifférenciation REMARQUE: Pour assurer la sécurité, les étapes suivantes virus de manutention doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique et d&#39;une hotte à flux laminaire, et avec un équipement personnel approprié de sécurité, notamment un masque chirurgical, pour prévenir l&#39;exposition des muqueuses. <ol><li> Mettez cellules à 100 pi médias fibroblastes (Étape 1.9). Décongeler aliquotes de Oct4-, Klf4-, Sox2- et virus c-myc-Sendai et remettre chaque virus dans 1 ml de médias fibroblastes. Ajouter chaque virus avec un MOI de 3 à cellules (titre de virus varie d&#39;un lot à, mais une aliquote de chaque virus peut généralement être utilisé pour l&#39;infection de 10 puits d&#39;une plaque 24) et mélanger doucement. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;. </li><li> Après 24 heures aspirer le milieu et ajouter 500 ul de milieu de neuroinduction (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) et la culture à 39 ° C, 5% de CO 2 à partir de maintenant. Changer les médias tous les jours. </li><li> Au jour 6 après l&#39;infection préparer 6 puits des plaques de laminine-enduit: diluer la laminine à 1 pg / ml dans du DPBS, ajouter 1 ml de solution sur 6 ainsi des plaques et de garder à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Au jour 7 après l&#39;infection diviser les cellules en utilisant DPBS / EDTA: aspirer les médias et laver les cellules une fois avec DPBS, puis ajouter 500 ul de DPBS / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 500 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml et centrifuger à 180 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de milieu de neuroinduction, plaque sur 6 et plaques de laminine-couché et ajouter inhibiteur ROCK Y27632 dans un conce finalentration de 10 uM dans les cellules, la culture à 39 ° C, 5% CO 2. </li><li> Changer les médias tous les jours. </li><li> Au jour 14 après infection de la culture les cellules à 37 ° C, 5% CO 2. Neuroépithéliales colonies deviennent apparents autour du jour 17 après l&#39;infection par microscopie à contraste de phase. Ils doivent être suffisamment grand pour être ramassé autour du jour 20 après l&#39;infection. </li></ol> 3. Isolation des Colonies Putative INPC <ol><li> Un jour avant la cueillette, manteau un 48 bien-plaque avec la laminine: diluer la laminine à 1 pg / ml dans du DPBS, ajouter 300 pi de solution sur des plaques et de garder à 4 ° C pendant 24 heures. Un jour plus tard aspirer la laminine à partir de plaques et ajouter 200 ul de milieu de neuroinduction dans les puits. </li><li> Laver les 6 bien des plaques contenant les colonies à être ramassé une fois avec DPBS et ajouter 2 ml par puits de DPBS 6 bien-plaque. Choisissez les colonies mécaniquement: gratter autour des colonies à l&#39;aide d&#39;une aiguille fine pour se débarrasser des cellules environnantes; définir le 2001; l Pipetman sur 50 pi et ramasser les colonies en utilisant les embouts de pipette respectifs. </li><li> Transférer une colonie de chaque dans un puits d&#39;une 48 bien-plaque de la laminine-enduit et de générer une suspension cellulaire unique mécaniquement par aspiration et refoulement 10 fois. Ajouter inhibiteur de ROCK Y27632 dans une concentration finale de 10 uM dans les cellules. </li><li> Cultiver les cellules sur la plaque 48-puits à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 2 jours. Changer les médias tous les deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 80 - 90% de confluence (environ 3 - 4 jours.). </li></ol> 4. Expansion et Cryo-conservation de iNPCs <ol><li> Le repiquage et expansion de iNPCs <ol><li> Aspirer le milieu et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer le DPBS et ajouter 200 ul DPBS / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2, ajouter 200 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml, centrifuger à 180 g pendant 5 min . </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de neuroinduction médias (étape 2.2), plaque sur des plaques 12 puits revêtues de laminine et ajouter un inhibiteur de ROCK Y27632 dans une concentration finale de 10 uM dans les cellules, la culture à 37 ° C, 5% CO 2. Après que les cellules atteignent 80-90% de confluence, soit ils peuvent être congelés ou encore développés de la façon suivante. </li></ol></li><li> Gel des iNPCs <ol><li> Aspirer le milieu et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer le DPBS et ajoutez DPBS 300 pi / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2, ajouter 300 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml, centrifuger à 180 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de milieu de congélation NSC commerciale. Transfert suspension dans des flacons de gel et de mettre dans un récipient de congélation de cellules. Conserver à -80 ° C pendant 2 jours, puis transfert à l&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol></li></ol> 5. Différenciation des iNPCs <ol><li> Différenciation vers neuroneal lignée <ol><li> Culture de cellules sur des plaques revêtues de laminine, comme décrit ci-dessus. Changer de support de neuro-diff-support (DMEM / F-12, N2 1x, 1x B27, 300 ng / ml AMPc, 200 pM de vitamine C, de 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF) lorsque les cellules sont d&#39;environ 70% confluentes. Changer les médias chaque jour pendant trois semaines. Avez cellules non divisées lors de la différenciation. </li><li> Après trois semaines cellules devraient exprimer le marqueur TUJ1 neuronale. Pour gagner neurones plus matures et sous-types de neurones continuer différenciation jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol></li><li> Différenciation vers la lignée gliale <ol><li> Changer de support de support d&#39;induction des cellules gliales (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 uM de β-mercaptoéthanol, 100 uM d&#39;acides aminés non essentiels, 1,5 mM de L-glutamine, l&#39;insuline 5 ug / ml, 40 ng / ml de T3) comprenant 20 ng / ml d&#39;EGF pour induire une différenciation en cellules précurseurs gliales. Retirer la moitié des médias et le remplacer par un milieu frais chaque jour pendant environ 2 semaines. Pendant cette période, les cellules doivent être divisés1: 3 en présence d&#39;un inhibiteur de ROCK 10 uM Y27632 lorsque 100% de confluence est atteint. </li><li> Après 2 semaines différencier les cellules plus loin dans les astrocytes: lorsque les cellules sont des médias de changement presque confluentes aux médias des astrocytes disponible dans le commerce, changer de support tous les deux jours. Après environ 7 jours cellules commencent à exprimer des marqueurs d&#39;astrocytes (par exemple, GFAP). Si les cellules deviennent confluentes à 100% au cours du protocole de différenciation, les diviser en un rapport de 1: 2 en présence de l&#39;inhibiteur de ROCK 10 uM Y27632. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous montrons l&#39;isolement et la conversion directe de fibroblastes humains dans des cellules progénitrices neurales transgène libre-expansibles et leur descendance différenciée en fonction putative pour la thérapie de remplacement cellulaire ou à l&#39;application dans les analyses de dépistage de drogue. La conversion directe de la lignée de cellules somatiques dans NPC a été obtenue par expression forcée de transcription spécifique de la lignée des facteurs 26,33,34. Néanmoins, dans de nombreux cas...

En 2006 Yamanaka et ses collègues ont pu montrer pour la première fois la possibilité d&#39;une reprogrammation de cellules somatiques dans un état ​​pluripotent 1. Cette dédifférenciation a été obtenue par la surexpression de quatre facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc dans des fibroblastes murins. Les dits induits des cellules souches pluripotentes générés (CISP) montrent l&#39;équivalence fonctionnelle de cellules souches embryonnaires (CSE) et peuvent donc être différenciées en tous les types de l&#39;organisme adulte cellulaires. Un an plus tard, à la reprogrammation CSPi pourrait aussi être atteint pour les fibroblastes humains 2. Des expériences sur des modèles animaux démontrent que les cellules iPSC dérivés peuvent généralement être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, par exemple dans des maladies (le PD) de Parkinson 5.3. Cependant, plusieurs limites associées à l&#39;utilisation des CSPi représentent barrages routiers pour la pleine réalisation de leur potentiel thérapeutique. De tous, la reprogrammation de cellules d&#39;abord dans un état pluripotent et aprèscontrôle de la qualité est généralement un temps et processus inefficace rendement dans les procédures de culture cellulaire vastes et donc coûteuses. Deuxièmement, iPSCs doivent être re-différencié dans le type cellulaire souhaité d&#39;intérêt avant l&#39;application biomédicale et de la probabilité de cellules pluripotentes résiduels dans la population différenciée recèle un important potentiel tumorigène et affiche ainsi un risque élevé après la transplantation de cellules 6. En troisième lieu, le processus de reprogrammation est habituellement obtenue en induisant les facteurs de reprogrammation par infection rétrovirale ou lenti-. L&#39;intégration de ces virus dans le génome de l&#39;hôte pourrait conduire à la mutagenèse par insertion et / ou la réactivation incontrôlée des transgènes 7,8. Les systèmes non-intégration ont été développés pour fournir les facteurs de reprogrammation pour cibler les cellules, ce qui minimise le risque de mutagenèse insertionnelle et transgène réactivation. Des exemples de ces approches sans transgène sont la reprogrammation de cellules en utilisant non-intégrationAdeno virus Sendai ou 9,10, vecteurs à base d&#39;ADN 11 ou l&#39;application de méthodes exempts d&#39;ADN, comme la transfection de l&#39;ARNm synthétique 12 ou transduction de protéines recombinantes 13,14. Un autre procédé prometteur pour la dérivation de iPSC libre transgène est l&#39;utilisation de constructions de reprogrammation loxP lentiviral modifié et suppression ultérieure de transgènes en utilisant le système de recombinaison Cre-loxP ADN 15,16. Une approche plus simple pour générer des cellules neurales pour la thérapie de remplacement de la cellule représente la conversion directe des fibroblastes en neurones post-mitotiques 17-20. Vierbuchen et al. A rapporté que la surexpression de facteurs de transcription ASCL1, Brn2 Myt1l et des résultats dans la production de 20% des neurones à partir de 17 fibroblastes murins. En 2011, il a été montré que les trois mêmes facteurs de transcription, en combinaison avec la surexpression de NeuroD1 permettent transdifférenciation des fibroblastes humains en neurons 19. neurones humaines induite pourraient également être générés par la surexpression de Ascl1 et Ngn2 sous double SMAD- et GSK3β- inhibition 20. Notamment, la conversion directe des fibroblastes en neurones génère, une population de cellules post-mitotique non-prolifération qui ne permet pas d&#39;expansion et de biobanques. Récemment, la conversion directe des fibroblastes dans une population de cellules souches neurales / progénitrices prolifération a été signalé 21-26. Par souci de clarté, tous ces types cellulaires seront nommés en tant que cellules progénitrices neurales induites (de iNPCs) dans ce rapport. Han et al. Surexprimé Brn4, Sox2, c-Myc et Klf4 pour générer iNPCs. Comme leurs homologues de cellules souches neurales dérivées de cellules de tissus soit primaire ou pluripotentes ces iNPCs sont tripotential et pourraient être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes 21. Notre groupe a rapporté un protocole de conversion légèrement différente impliquant la surexpression de Sox2, Klf4Et c-Myc et induite Oct4-expression pour 5 jours seulement. Avec cette approche, nous pourrions générer proliférant de manière stable iNPCs de embryonnaires et adultes fibroblastes murins qui présentent silencieux complet des facteurs de la reprogrammation 22. Contrairement à iPSCs, iNPCs ne présentent pas de pouvoir tumorigène 27 après la transplantation. Nous avons utilisé des cellules converti avec succès dans un modèle animal de démyélinisation, rats déficients en myéline, ce qui démontre que iNPCs sont cliniquement utiles 22. Jusque-là, les PNJ ne pourraient être générés à partir de cellules souches pluripotentes ou tissu neural primaire 28-32. iNPCs sont des cellules de manière stable extensibles qui peuvent être cryoconservés et sont capables de se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. Beaucoup d&#39;efforts ont été faits pour adapter le protocole de conversion directe de la souris à des cellules humaines 23,26,33,34. En 2012, il a été publié que la surexpression du facteur de Sox2 unique dans des fibroblastes est suffisante pour générer murin et humain iNPCs <sjusqu&#39;à&gt; 33. Les auteurs ont rapporté génération de iNPCs droits de fibroblastes de prépuce fœtales et les caractérisent par coloration contre Sox2 et Nestin. Cependant, les cellules cibles utilisés pour la reprogrammation représentent un type de cellule très particulière qui ne sera pas disponible en pratique clinique et il n&#39;y avait pas la caractérisation fonctionnelle des cellules converties par la transplantation dans un modèle animal effectué. Une publication plus récente décrit la génération des progéniteurs neuronaux restreintes de fibroblastes foetaux humains par la surexpression de Sox2, c-Myc et soit Brn2 ou Brn4 34. Les lignées cellulaires générées ont montré une capacité d&#39;auto-renouvellement et peuvent se différencier en différents types de neurones terminaux. Cependant, l&#39;utilisation de fibroblastes foetaux est défavorable, étant donné que ces cellules sont d&#39;origine hétérogène et on ne peut pas exclure la présence de résidus, par exemple, les cellules souches de la crête neurale dans les préparations. En 2014, Zhu et al. Ont rapporté la conversion directe de l&#39;être humain adulte et néonatales fibroblastes en cellules progénitrices neurales tripotential par la surexpression de Sox2 avec Oct4 ou Oct4 seul et l&#39;addition de petites molécules à des milieux de culture cellulaire. Notamment, sur la base de leurs études Sox2 seule était insuffisante pour induire une conversion directe 26. Plus récemment, Lu et al. A rapporté que la surexpression de la Yamanaka facteurs Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc par virus Sendai pendant 24 heures et l&#39;inactivation ultérieure du virus par l&#39;augmentation des résultats de température dans la génération de neurones expansible tripotential 23 cellules précurseurs. En conclusion, bien que les protocoles de conversion publiés pour les cellules humaines ont jusqu&#39;ici en commun la surexpression d&#39;au moins un ou plusieurs des facteurs Yamanaka, souvent en temps opportun restreint, il n&#39;y a aucune indication claire des facteurs moléculaires minimales nécessaires à la conduite directe conversion en iNPCs. La surexpression de Oct4 opportun limité par des moyens génétiques, la transfection avec de l&#39;ARNm synthétique, ou cprotéines ell infiltrant avec une expression constitutive de Sox2, Klf-4, et c-Myc n&#39;a pas abouti à des lignées stables INPC humains encore. Ainsi, l&#39;application de virus Sendai à surexpriment tous les facteurs Yamanaka et en temps opportun de limiter leur activité par inactivation par la chaleur des virus 23 ainsi que les conditions d&#39;induction de médias optimisés 22,31 neuronal représente la stratégie préférée à ce jour. Plusieurs études démontrent la fonctionnalité cellulaire de NNC ou leurs homologues différenciées dans les différents modèles de maladies animales. Progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines ont été transplantées dans des modèles murins de la maladie de la sclérose en plaques neuroinflammatoire 35,36. L&#39;applicabilité de cellules progénitrices neurales CSEh dérivées dans l&#39;EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) -mice a été montré la première fois en 2008 35. Cellules précurseurs neurales multipotentes ont été injectés dans les ventricules du cerveau de la souris, et le résultat de la transplantationed dans la réduction des signes cliniques de l&#39;EAE. Kim et al. Généré précurseurs oligodendrogliales de CSEh et transplanté ceux intracérébroventriculairement dans EAE-souris. Bien que les greffes ne survivent pas plus de 10 jours, les souris ont montré une amélioration significative de la fonction et de la réduction des cellules immunitaires pro-inflammatoires dans la substance blanche 36 neurologique. la thérapie de cellules souches a également été appliquée pour le ciblage préclinique de la maladie de Parkinson que les PNJ peuvent être utilisés avec succès dans les modèles animaux respectifs. Pour cela, les cellules progénitrices ont été soit dérivées de tissu cérébral fœtal 37 différenciées à partir de cellules souches pluripotentes 38 à 40 ou de cellules souches mésenchymateuses 41 ont été utilisés. En 2012, nous avons montré que iNPCs de souris sont capables de produire une protéine protéolipidique, la principale composante de protéine de la myéline, après la transplantation dans le cerveau de rats (md) de la myéline déficient 22. Par cette expérience preuve-de-principe APPLICABIL thérapeutiquelité de iNPCs a d&#39;abord été prouvé et bientôt confirmé par une autre étude 32. Toutefois, le potentiel d&#39;utilisation thérapeutique de iNPCs humains reste à explorer. Ici, nous montrons un processus robuste et intégré de (i) la dérivation de cellules primaires humaines de patients adultes par biopsie de la peau, (ii) la conversion directe de fibroblastes humains dans un état progénitrices neurales et (iii) la capacité de iNPCs à se différencier en neurones et lignages gliales. L&#39;utilisation de ce protocole aidera à accélérer la génération de cellules humaines autologues pour des applications thérapeutiques.

<table><tbody><tr><td>Milieux astrocytaires</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie Punch</td><td>pfm medical</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>PAN&nbsp ;</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>hLIF</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67-anticorps</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps de nestine</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation NSC</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6-antibody</td><td>Covance</td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus : Kit de reprogrammation CytoTune Sendai</td><td>&nbsp ; LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumpyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Sox1</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Génération de cellules souches induites pluripotentes (CSPi) à partir de fibroblastes adultes de la peau et de la différenciation subséquente dans des cellules somatiques fournit des perspectives fascinantes pour la dérivation de greffes autologues qui contournent les barrières d&#39;histocompatibilité. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et la différenciation complète subséquente en lignées désirées reste un obstacle pour la traduction clinique de la technologie iPSC raison de l&#39;instabilité génomique potentiel et néoplasiques. Récemment, nous et d&#39;autres avons montré que les cellules somatiques peuvent non seulement être converties en CSPi mais aussi en différents types de cellules souches somatiques multipotentes en utilisant des facteurs définis, contournant ainsi la progression à travers l&#39;état pluripotent. En particulier, la conversion directe de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales induites (iNPCs) annonce la possibilité d&#39;une source cellulaire autologue roman pour diverses applications telles que le remplacement de la cellule, la modélisation des maladieset le dépistage de la drogue. Ici, nous décrivons l&#39;isolement des adultes fibroblastes primaires humains par biopsie de la peau et de leur conversion directe efficace en temps opportun iNPCs par l&#39;expression restreinte de Oct4, Sox2, Klf4, ainsi que c-Myc. Colonies neuroépithéliales Sox2 positifs apparaissent après 17 jours d&#39;induction et de lignes INPC peuvent être établies de manière efficace par l&#39;isolement et l&#39;expansion monoclonal. Réglage précis de la multiplicité de l&#39;infection virale et la supplémentation du facteur inhibiteur de la leucémie au cours de la phase d&#39;induction représentent des facteurs critiques pour atteindre des rendements de conversion de jusqu&#39;à 0,2%. Jusqu&#39;à présent, les lignes INPC spécifiques au patient pourraient être élargis pour plus de 12 passages et uniformément présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires de cellules souches / progénitrices neurales, comme l&#39;expression de la nestine et Sox2. Les lignes INPC peuvent être différenciées en neurones et les astrocytes comme jugé par coloration TUJ1 et contre GFAP, respectivement. En conclusion, nous rapportons un protocole robuste pour la dérivation et de direconversion de ct de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales stable extensibles qui pourraient fournir une source cellulaire pour des applications biomédicales telles que le remplacement des cellules neurales autologue et de la modélisation de la maladie.

Nous présentons ici la description d&#39;un processus intégré qui permet de générer des cellules induites neurales progénitrices (de iNPCs) à partir de fibroblastes humains qui ont été obtenus par une biopsie de poinçon de la peau en moins de 8 semaines (Figure 1). iNPCs Patient-specifc peuvent être davantage différenciées en lignées neuronales et gliales et abritent un énorme potentiel pour la thérapie de remplacement de la cellule et de la modélisation de la maladie. L&#39...

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

L'objectif général de cette procédure est de raccourcir l'approche classique des IPS de Yamanaka en générant directement des cellules progénitrices neuronales induites à partir d'une biopsie cutanée d'un patient, pour des applications thérapeutiques. Cela est réalisé en effectuant d'abord une biopsie punch sur le patient afin d'obtenir des cellules fibroblastes primaires pouvant être cultivées in vitro. La deuxième étape consiste à amplifier puis à infecter les fibroblastes cultivés avec des virus codant des facteurs de reprogrammation afin d'induire une transdifférenciation.Ensuite, les colonies de cellules progénitrices neurales induites ou INPC, supposément converties, doivent être soigneusement sélectionnées par validation visuelle, puis isolées par prélèvement manuel environ 20 jours après l'infection. La dernière étape consiste à obtenir un clone unique, à amplifier les CIP dans un milieu d'induction neuronal, et à réaliser une différenciation in vitro ciblée ; l'analyse par microscopie en immunofluorescence permet ensuite de démontrer que les CIP directement converties à partir des cellules du patient sont capables de se différencier en cellules neuronales ainsi qu'en cellules gliales, offrant ainsi une source pratiquement inépuisable pour des applications biomédicales. L'avantage de cette technique de conversion directe par rapport aux méthodes existantes, telles que l'obtention de cellules souches pluripotentes induites à la Yamanaka suivie de leur différenciation ultérieure, est double.La conversion de DI en cellules souches neurales induites multipotentes, que nous appelons cellules INS, est non seulement nettement plus rapide, mais aussi plus sûre. Ainsi, la procédure de transdifférenciation rendra beaucoup plus accessible la production de cellules spécifiques à chaque patient pour des applications thérapeutiques, tout en présentant un risque nettement plus faible de formation de tumeurs par rapport aux cellules IPS. Ce faisant, nous sommes désormais en mesure de lever deux obstacles majeurs dans le domaine actuel de la médecine régénérative.Il s'agit de la sécurité et de l'efficacité cliniques. Pour commencer la biopsie par poinçonnage, désinfecter la peau du patient, puis anesthésier la peau au niveau où la biopsie sera prélevée à l’aide de 0,5 à un millilitre de chlorhydrate de mépivacaïne en injection intracutanée. Prélever la biopsie cutanée à l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de trois millimètres.Lavez la biopsie avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) ou du DPBS contenant un microlitre par millilitre de gentamicine. Retirez le tissu adipeux de la biopsie à l’aide d’un scalpel et de forceps. Rincez ensuite la biopsie deux fois supplémentaires avec le tampon, puis aspirez-le complètement.Couvrez la biopsie avec du dis paste two et incubez de 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, aspirez complètement le dis paste two avant de laver la biopsie deux fois avec du DPBS. Retirez l'épiderme à l’aide de pinces, puis lavez la biopsie deux fois supplémentaires avec du DPBS.Ensuite, ajoutez deux millilitres de collagénase de type deux et transférez dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez de la collagénase jusqu'à un volume total de cinq millilitres. Incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius.Centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à 180 fois G et éliminer le surnageant par la suite. Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu DMEM contenant du sérum de veau fœtal et de la gentamicine, puis centrifuger à nouveau pendant cinq minutes à 180 fois G. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 1,5 millilitre du même milieu. Transférer ensuite l'échantillon dans un flacon de culture tissulaire T 25 adhérent et incuber à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % CO2, en renouvelant le milieu tous les trois jours après environ deux semaines.Une fois les cellules confluentes autour des fragments de peau, fractionnez les cellules à l’aide de la trypsine-EDTA comme décrit dans le protocole écrit. Poursuivez l’expansion des cellules en renouvelant le milieu tous les trois jours et en les fractionnant lorsque les cellules sont confluentes. Après avoir exclu une contamination par les mycoplasmes à l’aide de tests standards, préparez les cellules pour l’expérience de conversion directe en lavant les cellules une fois avec du DPBS, puis aspirez le DPBS et ajoutez 2,5 millilitres de trypsine-EDTA. Après une incubation des cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, 5 % CO2, tapez doucement sur le flacon pour détacher les cellules.Resuspendre les cellules dans 2,5 millilitres de milieu pour fibroblastes et transférer dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 180 × g pendant cinq minutes et aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu pour fibroblastes et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour obtenir une suspension monocellulaire.Compter le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage avant la mise en place. 30 000 cellules par puits. Dans une plaque de 24 puits, incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 %CO2. Les manipulations impliquant le virus doivent être effectuées dans une cabine de sécurité biologique en portant des équipements de protection individuelle appropriés, notamment un masque chirurgical afin de prévenir toute exposition muqueuse.Pour réaliser l'infection, remplacez d'abord le milieu cellulaire existant par 100 microlitres de milieu pour fibroblastes. Ensuite, resuspendez les aliquots décongelés de virus T quatre, KLF quatre, SOX deux et cmix sendi dans un millilitre de milieu pour fibroblastes. Ajoutez chaque virus aux cellules selon une MOI de trois et mélangez délicatement. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Après 24 heures, aspirez le milieu et ajoutez 500 microlitres de milieu d'induction neuronale. Entretenez les cellules à 39 degrés Celsius, 5 % CO2 à partir de maintenant, en changeant le milieu tous les deux jours. Au jour six suivant l'infection, préparez des plaques de six puits revêtues de laminine.Ajoutez un millilitre de laminine à une concentration de un microgramme par millilitre dans du DPBS sur des plaques de six puits et maintenez les plaques à quatre degrés Celsius pendant 24 heures, au jour sept après l'infection. Détachez les cellules en utilisant du DPBS-EDTA comme décrit dans le protocole écrit. Ajoutez 500 microlitres de DMEM/F12 et transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres. Puis centrifugez l'échantillon à 180 ×g pendant cinq minutes.Aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans 1,5 millilitre de milieu d'induction neuronal. Plaquez les cellules dans des plaques de six puits revêtues de laminine et ajoutez l'inhibiteur de la kinase RO à une concentration finale de 10 micromolaire. Incubez les cellules à 39 degrés Celsius, 5 % CO2, en renouvelant le milieu tous les deux jours à partir du jour 14. Après l'infection, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 ; les colonies d'épithélium neuronal deviennent visibles vers le jour 17 après l'infection, comme observé par microscopie en contraste de phase.Ils doivent être suffisamment grands pour être sélectionnés vers le jour 20 après l'infection, un jour avant la sélection, dans une plaque 48 puits recouverte de laminine comme décrit dans le protocole du texte. Un jour plus tard, aspirez la laminine des plaques et ajoutez 200 microlitres de milieu d'induction neuronale dans les puits. Lavez une fois les plaques 6 puits contenant les colonies à sélectionner avec du DPBS avant d'ajouter deux millilitres de milieu d'induction neuronale.Par puits d'une plaque à six puits, prélevez mécaniquement les cellules en raclant autour des colonies à l'aide d'une aiguille fine afin d'éliminer les cellules environnantes, puis récupérez les colonies à l'aide de pointes de pipette. Utilisez une pipette de 200 microlitres réglée sur 50 microlitres. Transférez chaque colonie dans un puits d'une plaque à 48 puits revêtue de laminoïde et générez une suspension monocellulaire par agitation mécanique en aspirant et expulsant dix fois.Ajouter l'inhibiteur de la kinase R à une concentration finale de 10 micromolaire dans les cellules. Cultiver les cellules dans la plaque de 48 puits à 37 degrés Celsius, 5 %CO2 pendant deux jours. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %.Voir le protocole en texte pour l'expansion et la cryoconservation des CIP destinées à une différenciation vers une culture de lignée neuronale. Les cellules sur des plaques revêtues de laminate. Comme précédemment, changer le milieu pour le milieu de différenciation neuro quand les cellules atteignent environ 70 % de confluence, puis continuer à renouveler le milieu tous les deux jours pendant trois semaines.Ne pas diviser les cellules pendant la différenciation après trois semaines ; les cellules doivent exprimer le marqueur neuronal TUJ1 pour obtenir des neurones plus matures et des sous-types neuronaux. Poursuivre la différenciation jusqu'à trois mois pour la différenciation des cellules progénitrices induites (IPC), spécifiquement vers une lignée gliale. Changer le milieu pour un milieu d'induction gliale, contenant 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique, afin d'induire la différenciation en cellules progénitrices gliales.Retirer la moitié du milieu et le remplacer par du milieu frais tous les deux jours pendant environ deux semaines. Pendant cette période, les cellules doivent être divisées par trois en présence d’un inhibiteur de la kinase R à 10 micromolaire lorsque la confluence à 100 % est atteinte après deux semaines. Différencier davantage les cellules en astrocytes en changeant le milieu pour un milieu d’astrocytes disponible dans le commerce lorsque les cellules sont presque confluentes, et en continuant à renouveler le milieu tous les deux jours ; environ sept jours plus tard, les cellules commencent à exprimer des marqueurs d’astrocytes.Si les cellules atteignent une confluence de 100 % pendant le protocole de différenciation, les diviser selon un rapport de un à deux. En présence d'un inhibiteur de la kinase RO à 10 micromolaire, l'infection des fibroblastes par les virus T 4K LF four, SOX two et cmix sendi, suivie d'une culture en conditions de milieu neuro-inductif, entraîne un changement de morphologie des fibroblastes et l'apparition subséquente de colonies. Dix-sept jours après l'infection, les lignées cellulaires monoclonales obtenues peuvent être amplifiées et présentent une coloration positive pour des marqueurs de cellules souches neurales tels que SOX two, SOX one, nestin et PAC six, ainsi que pour le marqueur de prolifération KI 67, tandis qu'elles n'expriment pas le marqueur associé à la pluripotence T four.De plus, en ajoutant des facteurs de croissance neuronaux au milieu de culture cellulaire, les cellules souches neurales peuvent être différenciées en neurones par l'application d'une différenciation en astrocytes. Les lignées de cellules souches neurales induites peuvent également être différenciées en lignées gliales, comme en témoignent l'analyse des changements morphologiques typiques et la coloration dirigée contre la GFAP. Par cette conversion directe, nous générons des cellules souches neurales induites multipotentes à partir de fibroblastes de patients en trois à quatre semaines.Ces cellules pourraient être utilisées pour de nombreuses applications biomédicales. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie, au diagnostic et à la modélisation de troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, ainsi que d'autres affections neurologiques.

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