Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de nouveaux médicaments qui modulent les canaux grk. Ceci est accompli en plaquant d’abord les cellules A TT 20 dans la plaque à 96 puits. La deuxième étape consiste à diluer les composés d’essai à l’aide du système de manipulation de plaques liquides Verset.

Ensuite, les composés d’essai dilués sont appliqués sur les cellules à l’aide du verset. La dernière étape consiste à insérer la plaque à 96 puits dans le lecteur de plaques fluorescentes à deux fluorescents Synergy, et à injecter les solutions de contrôle et de somatostatine dans les puits. En fin de compte, le lecteur de plaques fluorescentes est utilisé pour montrer les composés qui modifient le signal fluorescent induit par la somatostatine et modulent ainsi les canaux Grk.

L’avantage de cette procédure par rapport aux méthodes existantes telles que l’enregistrement par patch clamp, est qu’un grand nombre de composés peuvent être rapidement criblés pour déterminer s’ils modulent les canaux gerk. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la douleur, car les composés qui activent le canal Gerk, qui conduit à l’inhibition de la transmission nociceptive FI, peuvent être identifiés. Les plaques de 96 puits et le placage des cellules est Maribel Vasquez.

Un étudiant de mon laboratoire commence cette procédure en cultivant l’hypophyse A TT 20 cellules dans du DMEM complété par 10 % de sérum de cheval à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2. Maintenez la culture en sous-cultivant les cellules tous les cinq à sept jours en utilisant une procédure de normalisation standard. Ensuite, enduisez les puits du transparent noir.

Fond 96 puits avec 50 microlitres de poly L lysine. Laissez sécher les puits pendant 30 minutes dans l’incubateur. Retirez ensuite l’excès de plaque de lysine poly L les cellules de la plaque de 96 puits contenant 200 microlitres de milieu à la densité de 30 000 cellules par puits.

Après cela, stockez les cellules dans l’incubateur pendant trois à quatre jours. Utilisez une configuration d’aspiration pour aspirer lentement le milieu de culture de la monocouche cellulaire, puis lavez les cellules avec 200 microlitres de solution tampon normale. Par la suite, ajoutez 200 microlitres de solution tampon contenant le colorant sensible au potentiel membranaire à chacun.

Bien incuber les cellules pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Après 40 minutes, retirez les cellules A TT 20 de l’incubateur et laissez-les revenir à température ambiante, en aspirant l’ancien tampon. Appliquez ensuite une solution tampon fraîche contenant le MPD sur les cellules.

Ensuite, utilisez le système de manipulation des liquides pour appliquer diverses concentrations des composés d’essai et des solutions de contrôle sur les cellules. Dans la plaque à 96 puits, incubez les cellules pendant cinq minutes avec des composés d’essai aux mesures fluorescentes. Dans cette procédure, insérez la plaque à 96 puits dans un lecteur de plaques fluorescentes biotech synergy two.

Obtenez le signal de fond fluorescent à une longueur d’onde d’exsudation de 520 nanomètres et une longueur d’onde de mission de 560 nanomètres. Ensuite, appliquez les ligands G PCR R ou la solution de contrôle sur les puits pour activer les canaux GIR à l’aide du système à deux injecteurs Synergy. Ensuite, collectez les points de données à des intervalles de dix secondes sur une période d’échantillonnage 302e.

Aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Calculez le facteur Z afin de déterminer la fiabilité du dosage. Z.Des facteurs compris entre 0,5 et 1,0 indiquent que la qualité du test est excellente.

Les plaques dont le facteur Z est inférieur à 0,5 sont exclues. À partir de l’analyse, les composés qui modulent le signal fluorescent sont testés à nouveau en présence de deux millimolaires de chlorure de baryum ou de 500 nano molaires de térapine Q pour confirmer la spécificité du canal potassique du redresseur vers l’intérieur, illustrée ici est un signal fluorescent HLB 0 2 1 1 15 2 représentatif mesuré au fil du temps dans les cellules A TT 20 avec l’ajout de somatostatine ou de solution de contrôle. Le rapport de l’intensité fluorescente dans l’axe Y a été calculé en divisant le signal en présence de somatostatine ou de la solution de contrôle par le signal de base mesuré avant l’ajout de somatostatine ou de solution de contrôle.

On voit ici le traitement des cellules A TT 20 avec 500 nanomolaires. Terapin Q inhibe la diminution du signal fluorescent médiée par la somatostatine en liant deux canaux et en bloquant les canaux G. Et montré ici est le traitement des cellules A TT 20 avec 20 micromolaires de propafénone, qui inhibe également la diminution du signal fluorescent médiée par la somatostatine Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les médicaments qui modulent les canaux grk à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes.