Name: Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez un test de complémentation structurale pour surveiller les interactions GPCR-β-arrestine en temps réel dans les cellules vivantes. Cette méthode polyvalente accélère la découverte de médicaments de première classe avec moins d'effets secondaires.

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Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Programme de recherche (NRF- 2015M3A9E7029172) de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification future.

1. Stratégie de conception d'apprêt
<ol><li>Concevoir des amorces pour introduire des gènes d'intérêt dans pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.</li>
	<li>Sélectionnez au moins l'un de ces trois sites comme l'une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires au clonage directionnel en raison de la présence d'un codon d'arrêt dans le cadre qui divise le site multicloing comme le montre la figure 111.</li>
	<li>Incorporez la séquence de nucléotide dans les amorces, comme le montre le tableau 1, pour coder les résidus de liaison indiqués en rouge dans le tableau 211.</li>
	<li>Pour les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce de 5 euros contient un codon ATG et une puissante séquence de consensus Kozak (GCCACC).</li>
	<li>Pour les vecteurs pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce 3 contient un codon d'arrêt. REMARQUE: Chaque vecteur contient le promoteur HSV-TK pour minimiser l'association non spécifique et réduire les artefacts expérimentaux, aussi chaque vecteur a une cassette d'expression pour la résistance à l'ampicilline dans les bactéries.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>Configurez et exécutez des réactions PCR pour amplifier l'ADN d'insertion du gène d'intérêt à l'aide des amorces conçues à partir de l'étape 1. Il est important d'utiliser une polymérase d'ADN haute fidélité pour minimiser les mutations.</li>
	<li>Utilisez exactement l'ordre suivant pour préparer 50 L de réaction PCR. Ajouter 35,5 l d'eau distillée, 5 l de 10x tampon de polymérase, 5 l de mélange dNTP (2,5 ml chacun), 1 l de modèle de plasmide (200 ng/L), 1,25 l d'amorces avant et inversées (10 M) et 1 l de polymérase haute fidélité (5 U/L).</li>
	<li>À l'aide d'un thermocycleur, configurez le programme d'amplification de l'ADN suivant.<ol>
<li>Dénaturer à 95 oC pendant 5 min.</li>
		<li>Répéter 25 fois le cycle thermique suivant : 95 oC pour 30 s, 60 oC pour 1 min, 72 oC pour 2 min par 1 kbp à amplifier.</li>
		<li>Exécuter une extension finale à 72 oC pendant 10 min.</li>
		<li>Maintenez les échantillons à 4 oC dans le thermocycleur. REMARQUE : Il est fortement recommandé d'utiliser une polymérase haute fidélité afin de minimiser les mutations ponctuelles, en particulier celles qui se produisent lors de l'amplification de longues séquences. À mesure que l'amplicon s'allonge, le degré de précision dans la réplication de l'ADN diminue. Pour la réaction PCR, choisissez la température d'annealing basée sur la température de fusion de la région où les oligos s'hybrident directement avec le modèle d'ADN et non avec toute la séquence de l'amorce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification du produit PCR<ol>
<li>Isolez le produit PCR du reste de la réaction PCR à l'aide d'un kit d'un fabricant de préférence12. Le produit PCR est maintenant prêt pour la digestion de restriction.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Digestion de l'ADN
<ol><li>Pour la digestion du produit PCR préparer 50 L de réaction de digestion comme suit.<ol>
<li>À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 12 l d'eau distillée.</li>
		<li>Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.</li>
		<li>À partir de l'étape 2.4 ajouter 30 L de produit PCR</li>
		<li>Enfin, ajoutez 1,5 L de chaque enzyme de restriction.</li>
		<li>Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour le plasmide receveur, la digestion prépare 50 L de réaction de digestion comme suit :<ol>
<li>À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 23 l d'eau distillée.</li>
		<li>Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.</li>
		<li>Ajouter 15 l'un de plasmide receveur (200 ng/L).</li>
		<li>Ajouter 1,5 L de chaque enzyme de restriction.</li>
		<li>Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit. REMARQUE : Il est important d'utiliser 3 g de plasmide receveur afin d'obtenir suffisamment de matériel après la purification du gel d'agarose d'ADN. Il est également pertinent de laisser les digestions d'ADN pendant la nuit en utilisant les deux enzymes pour obtenir une efficacité de clonage élevée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Purification et clonage de gel d'agarose d'ADN
<ol><li>Préparer un gel d'agarose de 1% pour faire fonctionner le plasmide d'ADN digéré et les inserts et procéder à couper les bandes correspondantes. Une fois que les bandes correspondantes de vecteur et d'insertion ont été purifiées12, déterminez la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre.</li>
	<li>Effectuer la ligature d'ADN pour fusionner l'insert au plasmide du destinataire.</li>
	<li>Préparer des réactions de ligature d'environ 100 ng d'ADN total, y compris 50 ng de vecteur plasmide.</li>
	<li>Configurer le rapport plasmi-insertion du destinataire d'environ 1:3; il peut être calculé à l'aide d'une calculatrice à insertion vectorielle13.</li>
	<li>Mettre en place des contrôles négatifs en parallèle. Par exemple, une ligature de l'ADN plasmide du destinataire sans aucun encart fournira des informations sur la quantité de fond du plasmide receveur non digéré ou auto-ligating est présent.</li>
</ol>5. Transformation des clones
<ol><li>Placez un tube de cellules compétentes DH5MD du congélateur à -80 oC et transférez-le immédiatement sur la glace pendant 20 min.</li>
	<li>Après ce temps, prendre 55 l de cellules compétentes DH5 et ajouter 4 'L de réaction de ligature et mélanger en faisant glisser le tube et stocker sur la glace pendant 45 min.</li>
	<li>Placez le tube dans un bain d'eau préalablement réchauffé à 42 oC pour exactement 48 s et reprenez immédiatement les tubes sur la glace pendant 3 minutes de plus.</li>
	<li>Ajouter 600 ll de l'eau-de-vie luria Broth (LB) préalablement réchauffée à 37,5 oC et couver en secouant pendant 1 heure à 200 tr/min.</li>
	<li>Transférer 200 l dans une plaque d'agar contenant de l'ampicilline 100 g/mL et répartir délicatement sur la surface avec le liquide est principalement absorbé.</li>
	<li>Incuber les plaques toute la nuit pour voir les colonies le lendemain matin. Le plasmide receveur sur la plaque d'insertion devrait avoir beaucoup plus de colonies que la plaque de plasmide seule.</li>
</ol>6. Isolement du plasmide fini
<ol><li>Choisissez 3 à 10 colonies bactériennes individuelles et transférez-les dans 1 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline (100 g/mL) et incubez pendant 6 h.</li>
	<li>Prendre 200 ll de suspension bactérienne et transférer à 5 ml de milieu LB contenant la même concentration d'ampicilline que dans l'étape 6.1 et couver toute la nuit à 37,5 oC en secouant à 200 tr/min.</li>
	<li>À l'aide d'un kit d'ADN miniprep, effectuer des purifications d'ADN miniprep en utilisant 5 ml de LB cultivé pendant la nuit suivant les instructions du fabricant14.</li>
	<li>Pour identifier les ligatures réussies, configurez les réactions PCR de la même manière que dans la section 2 en utilisant l'ADN obtenu à partir de l'étape 6.3 comme modèle avec les mêmes amorces que dans la section 2 lors de la première PCR. Les clones positifs produiront des produits PCR avec la taille correspondante.</li>
	<li>Après la purification d'ADN de grande préparation des clones positifs, mener une digestion diagnostique de restriction de 500 ng de l'ADN purifié avec les enzymes employées pendant l'étape de clonage et exécuter les produits digérés sur un gel d'agarose de 1%. Il devrait y avoir deux bandes : l'une de la taille du vecteur et l'autre de la taille du nouvel insert.</li>
	<li>Vérifier la séquence de construction en séquençant à l'aide des amorces suivantes: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtgcctcgaac-3' et inversé 5'-gcattttttcactgcattctagtt-3'. REMARQUE : Lorsque l'ADN est reproduit à l'aide de PCR, il y a toujours la possibilité d'erreurs pendant l'amplification même lors de l'utilisation d'une polymérase haute fidélité, il est donc très important de séquencer les constructions finales.</li>
</ol>7. Transfection et expression protéique
<ol><li>Dans une plaque de puits blanche 96 enduite de poly-L-lysine, effectuer l'ensemencement cellulaire un jour avant la transfection à 2,5 x 104 cellules par puits en utilisant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline G et 100 g/ mL streptomycine.</li>
	<li>Utilisez uniquement les 60 puits intérieurs pour minimiser le potentiel de gradients thermiques à travers la plaque et les effets de bord de l'évaporation. Ajouter 200 l'eau distillée stérile aux 36 puits extérieurs et 150 l dans les espaces entre les puits et incuber pendant la nuit à 37,5 oC et 5 % du CO2.</li>
	<li>Le lendemain matin effectuer la transfection en utilisant 100 ng d'ADN total (50 ng chaque construction).</li>
	<li>Configurez quatre combinaisons de plasmides différentes (récepteur : 'arrestin' ) selon la figure 2b.</li>
	<li>Pour chaque combinaison de plasmides, utilisez 20 l de support essentiel minimum modifié d'Eagle tamponné avec HEPES en utilisant 0,3 L de réactif de transfection lipidique par puits.</li>
	<li>Ajouter 20 l de mélange réagent-ADN de transfection lipidique à chaque puits et mélanger la plaque en cercles pendant 10 s.</li>
	<li>Changer de milieu frais après 6 heures d'incubationà 37,5 oC et 5 % de CO 2.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 24 h à 37,5 oC et 5 % de CO2.</li>
</ol>8. Surveillance des interactions récepteur--arrestin1/2 dans les cellules HEK293
<ol><li>Aspirez le milieu et ajoutez 100 l de tampon satisme modifié de eagle's Minimum Essential Media avec HEPES à chaque puits et laissez la plaque se stabiliser à RT pendant 10 min.</li>
	<li>Préparer le substrat de furimazine en combinant 1 volume de substrat 100x avec 19 volumes de LCS Dilution Buffer (une dilution 20 fois)11, créant un stock 5x à mélanger avec le milieu de culture cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 25 l de 5x furimazine à chaque puits et mélanger délicatement en cercles pendant 10 s.</li>
	<li>Mesurer la luminescence pendant 10 min pour la stabilisation du signal à RT. REMARQUE : En utilisant ce signal de base pour normaliser la réponse de chaque puits, il aidera à réduire la variabilité causée par les différences dans le nombre de cellules plaquées par puits, aussi des différences dans l'efficacité de la transfection, etc. Une fois calculé, la moyenne de la réponse normalisée des puits de repli pour un traitement médicamenteux donné.</li>
	<li>Préparer la solution ligand 13.5x dans le support essentiel minimum d'Eagle modifié tamponné avec HEPES.</li>
	<li>Pour les expériences à température ambiante avec 10 l de 13,5x ligand s'ajoutent, ajoutez les composés à l'aide d'injecteurs ou d'une pipette multicanal et mélangez la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min).</li>
	<li>Pour les expériences à 37,5 oC avec 10 L d'ajout de ligand 13,5x, utilisez des injecteurs pour distribuer des composés et mélanger en utilisant le shaker orbital de l'instrument. En cas de non-utilisation d'injecteurs, retirer la plaque du luminomètre, ajouter les ligands et mélanger la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min). REMARQUE : Utilisez des injecteurs et un shaker dans l'instrument de détection pour minimiser les fluctuations de température associées à l'enlèvement de la plaque du luminomètre. Les luminomètres standard de banc peuvent être employés pour cet analyse. Utilisez un temps d'intégration de 0,25 à 2 s.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

En utilisant la méthode présentée ici, les interactions entre n'importe quel GPCR et '-arrestin1'2 peuvent être surveillées dans des systèmes de vie en temps réel en utilisant cet analyse de complémentation structurale GPCR---arrestin. À cet égard, nous avons pu observer un recrutement différentiel entre les deux isoformes de l'arrêt-arrêt par le GLP-1r (UN GPCR prototypique de classe B), nous avons également observé une dissociation du complexe récepteur--arrestin quelques minutes après avoir atteint le maximum signal l...

Les GPCR représentent la cible de près de 35 % des médicaments actuels sur le marché1,2 et une compréhension claire de leur pharmacologie est cruciale dans le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques3. L'un des aspects clés de la découverte de médicaments par le GPCR, en particulier pendant le développement d'agonistes biaisés, est la caractérisation de nouveaux ligands vers les interactions récepteur-arrestin4 et les interactions de l'arrestine avec d'autres protéines cytosoliques telles que comme clathrine5.
Il a été documenté que la signalisation dépendante de l'arrêt-arrêt joue un rôle clé dans les troubles neurologiques tels que le trouble bipolaire, la dépression majeure, et la schizophrénie6 et aussi des effets secondaires graves dans certains médicaments tels que la morphine7.
Les méthodes actuelles utilisées pour surveiller ces interactions ne représentent généralement pas les niveaux endogènes réels des protéines à l'étude, dans certains cas, ils montrent un signal faible, photoblanchiment et en fonction de la GPCR, il pourrait être techniquement difficile de mettre en place8. Ce nouvel exemple de complémentarité structurelle utilise des vecteurs de promoteur à faible expression afin d'imiter les niveaux physiologiques endogènes et fournit une sensibilité élevée par rapport aux méthodes actuelles9. En utilisant cette approche, il a été possible de caractériser facilement le récepteur Galanin--arrestin1/2 et aussi les interactions de la clathrine10. Cette méthodologie peut être largement utilisée à n'importe quel GPCR d'intérêt particulier où les '-arrestins jouent une fonction physiologique clé ou leur signalisation est pertinente dans certaines maladies.

<table><tbody><tr><td>Antibiotiques pénicilline streptomycine</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td>Pénicilline/Streptomycine</td></tr><tr><td>Incubateur bactérien</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>(Air-Jacket),</td></tr><tr><td>Base Milieu de culture cellulaire</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Milieu de transfection de culture cellulaire</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Milieu</td></tr> <tr>de culture cellulaire Optimem 1X<td>Incubateur CO2</td><td></td><td>NUAIRE NU5720</td><td>Incubateur CO2 à chaleur directe</td></tr><tr><td>Bain d’eau numérique</td><td>Lab Tech</td><td>LWB-122D</td><td>Bain d’eau numérique tech de laboratoire</td></tr><tr><td>ADN Lecture d’épreuve de polymérase</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td> PfU Kit de purification d’ADN <td>polymérase</td></tr><tr><td></td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Kit de purification Mini</td></tr><tr><td>ADN Taq Polymérase</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq ADN polymérase</td></tr><tr><td>Restriction enzymatique BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Tampon de restriction enzymatique</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X</td></tr><tr><td>Restriction enzymatique EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Restriction enzymatique NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>Restriction enzymatique XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco Canada</td><td>12483020</td><td>Gel de sérum de bovin fœtal</td></tr><tr><td>/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligase ELPIS</td><td>Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 Microscope Olympus</td></tr><tr><td>réactif de transfection lipidique</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Lecteurs de microplaques multimodes</td></tr><tr><td>Système NanoBiT</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Système de démarrage</td></tr><tr><td>Substrat nanoluciférase Promega</td><td></td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Système de dosage de cellules vivantes</td></tr><tr><td>PCR Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Master cycler Nexus SX1</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Solution de poly-L-lysine</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trysin EDTA 10X</td></tr><tr><td>Culture de globules blancs 96 plaques de puits</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Plaque de dosage 96 plaques de puits</td></tr></tbody></table>

surveillance des interactions gpcr-md-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Les interactions entre les récepteurs couplés à la protéine G (GpCR) et les arrestins sont des processus vitaux ayant des implications physiologiques de grande importance. À l'heure actuelle, la caractérisation de nouveaux médicaments en vue de leurs interactions avec les arrestins et autres protéines cytosoliques est extrêmement précieuse dans le domaine de la découverte de médicaments par GPCR, en particulier lors de l'étude de l'agonisme biaisé du GPCR. Ici, nous montrons l'application d'un nouveau test de complémentarité structurelle pour surveiller avec précision les interactions récepteur-arrestin dans les systèmes vivants en temps réel. Cette méthode est simple, précise et peut être facilement étendue à n'importe quel GPCR d'intérêt et a également l'avantage qu'elle surmonte les interactions non spécifiques en raison de la présence d'un promoteur de faible expression présent dans chaque système vectoriel. Cet analyse de complémentarité structurelle fournit des caractéristiques clés qui permettent une surveillance précise et précise des interactions récepteur-arrestin, ce qui le rend approprié dans l'étude de l'agonisme biaisé de tout système GPCR ainsi que GPCR c-terminus 'phosphorylation codes écrits par différents GPCR-kinases (GRKs) et des modifications post-traductionnelle des arrestins qui stabilisent ou déstabilisent le complexe récepteur---arrestin.

Utilisant la procédure présentée ici, les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes de '-arrestin ont été surveillées. Des constructions de récepteurs de peptides (GLP-1r) ont été faites à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction d'enzymes NheI et EcoRI et clonées dans les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT] alors que dans le cas de l'arrêt ins, deux vecteurs supplémentaires ont été pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilisant les sites de restriction enzymatiques Bg...

Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Ce protocole a un impact élevé dans le domaine de la découverte et du développement de médicaments, en particulier dans le développement de nouveaux médicaments de première classe avec un minimum d’effets secondaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à n’importe quel système GPCR, et utilisée pour obtenir des informations précises sur la pharmacologie des récepteurs dans les systèmes vivants en temps réel. Les implications de cette technique sont étroitement liées aux nouvelles thérapies particulièrement où les bêta-arrestins sont pertinents.Il s’agit notamment des récepteurs opiacés dans la douleur et les récepteurs dopaminergiques dans la schizophrénie. Cette méthode peut être utile dans de nombreux domaines de recherche scientifique médicale, de la neurologie à la maladie cardiopulmonaire. La démonstration pcr de notre méthode est importante, car elle permet une présentation détaillée des étapes critiques du protocole, ce qui ne serait pas possible avec la publication conventionnelle.Commencez par concevoir des amorces pour introduire des gènes d’intérêt pour les vecteurs pBiT. En raison du codon d’arrêt inframe qui divise le site de clonage multi, sélectionnez au moins un des trois sites comme l’une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires pour le clonage directionnel. Se référer au manuscrit pour les séquences de nucléotides pour coder les résidus linker et les incorporer dans les amorces.Pour le pBiT1.1-C et pBiT2.1-C assurez-vous que l’amorce avant contient un codon ATG et une séquence de consensus Kozak puissant. Pour le pBiT1.1-N et pBiT2.1-N assurez-vous que l’amorce inverse contient un codon stop. Utilisez les amorces conçues pour amplifier l’ADN d’insertion du gène d’intérêt.Combinez les reagents PCR selon les instructions manuscrites, en vous assurant d’utiliser une polymése d’ADN haute fidélité pour minimiser les mutations. Programmez le thermocycleur et démarrez la réaction. Après avoir terminé la PCR, digérer le produit dans une réaction de digestion de 50 microlitres.Dans un tube de 1,5 millilitre, combiner 12 microlitres d’eau distillée, cinq microlitres du tampon de digestion de restriction approprié de 10X, et 30 microlitres du produit PCR. Ajouter ensuite 1,5 microlitres de chaque enzyme de restriction. Vortex le mélange de réaction.Et incuber toute la nuit à 37,5 degrés Celsius. Préparer une deuxième réaction pour digérer le plasmide receveur. Dans un tube de 1,5 millilitre, combiner 23 microlitres d’eau, cinq microlitres du tampon de digestion de restriction approprié de 10X, 15 microlitres du plasmide destinataire, et 1,5 microlitres de chaque enzyme de restriction.Mélanger brièvement le tube. Et incuber toute la nuit à 37,5 degrés Celsius. Le lendemain du clonage et de la transformation, choisissez trois à dix colonies bactériennes individuelles et transférez-les à un millilitre de LB moyen avec ampicilline.Incuber les cellules pendant six heures. Et puis transférer 200 microlitres de suspension bactérienne à cinq millilitres de milieu LB frais avec de l’ampicilline. Incuber la culture à 37,5 degrés Celsius avec des secousses à 200 rpm pendant la nuit.Le lendemain, isolez le plasmide avec une mini-trousse de purification de l’ADN de préparation. Filtrez le plasmide purifié pour une ligature réussie avec PCR. Un jour avant la transfection, ensemencer les cellules d’une plaque de 96 puits recouverte de poly-L-lysine à l’aide du milieu modifié eagle de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités par millilitre de pénicilline G, et 100 microlitres par millilitre de streptomicine.N’ajoutez que des cellules aux 60 puits intérieurs pour minimiser le potentiel de gradients thermiques à travers la plaque et les effets de bord de l’évaporation. Ajouter 200 microlitres d’eau distillée stérile aux 36 puits extérieurs et 150 microlitres dans les espaces entre les puits. Puis incuber la plaque pendant la nuit à 37,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, effectuez une transfection à l’aide d’un total de 100 nanogrammes d’ADN. Mettre en place quatre combinaisons de plasmides différentes selon les instructions manuscrites. Utilisation de 20 microlitres du média essentiel minimum d’Eagle modifié tamponné avec HEPES, et de 0,3 microlitres de réaccente de transfection lipidique par puits.Ajouter 20 microlitres de réaccente de transfection lipidique et de mélange d’ADN à chaque puits, et mélanger la plaque en cercles pendant 10 secondes. Incuber la plaque à 37,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Rafraîchissez le milieu.Et incuber encore 24 heures. Après l’incubation, aspirer le milieu et ajouter 100 microlitres de support essentiel minimum d’Eagle modifié tamponné avec HEPES à chaque puits. Laisser la plaque se stabiliser à température ambiante pendant 10 minutes.Pendant ce temps, préparer le substrat de furimazine en combinant un volume du substrat 100X avec 19 volumes de tampon de dilution LCS, créant un stock 5X à mélanger avec le milieu de culture cellulaire. Lorsque les cellules sont prêtes, ajouter 25 microlitres du bouillon à chaque puits, et mélanger délicatement la plaque pendant 10 secondes. Ensuite, mesurez la luminescence pendant 10 minutes à température ambiante pour la stabilisation du signal.Pour des expériences avec l’addition de ligand, préparez la solution ligand de 13.5X dans le média essentiel minimum modifié d’Eagle tamponné avec HEPES, et ajoutez 10 microlitres par puits utilisant une pipette multicanal. Mélangez ensuite la plaque à la main ou à l’aide d’un shaker orbital. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes bêta-arrestin.Quatre combinaisons plasmides différentes ont été examinées, et celle avec le signal luminescent le plus élevé a été choisie pour d’autres expériences. Les valeurs EC50 pour chaque isoforme bêta-arrestine ont été déterminées à l’aide de courbes dose-réponse, qui ont été obtenues à partir de la réponse maximale de chaque concentration à partir d’études cinétiques. Il est essentiel d’accorder une attention particulière lors de la conception des amorces PCR.Le développement des bonnes constructions est essentiel au succès de ces analyses. En suivant cette méthodologie, vous serez en mesure de surveiller les interactions récepteur-bêta-arrestine, ainsi que les interactions des récepteurs avec d’autres protéines cytosoliques. Cette méthodologie aidera à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la pharmacologie GPCR en étudiant comment les interactions GPCR-beta-arrestin peuvent être modulées par des modifications de la structure ligand.

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L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.

Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

Des méthodes simples pour détecter l’activation sélective des protéines G par les récepteurs couplés aux protéines G restent un défi majeur dans la signalisation cellulaire. Ici, des biocapteurs de transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) ont été développés en attachant par paires un RCPG à des peptides de protéine G pour sonder les changements de conformation à des concentrations contrôlées dans des cellules vivantes.

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

Le test cellulaire décrit est conçu pour l’identification des récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4)-interaction des agents qui inhibent ou stimulent, soit compétitif ou façon allostérique,le Ca 2 + intracellulaire initiée par activation CXCR4.

Un test pour identifier les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G, antagonistes et MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES cinétiques basés sur la Fluorescence Ca2 + mobilisation

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Étant donné que les RPGC sont des cibles médicamenteuses attrayantes, le dépistage du ligand GPCR est donc indispensable pour l’identification des composés de plomb et pour les études de désorphanisation. À l’égard de ces efforts, nous décrivons PRESTO-Tango, une plate-forme de ressources open-source utilisée pour le profilage simultané du recrutement transitoire d’un PGS2 à environ 300 GPCR à l’aide d’un essai de journaliste basé sur TEV.

Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

S1P exerce ses divers effets physiologiques à travers la sous-famille des récepteurs S1P (S1PR). Ici, un pipeline est décrit pour expliquer les structures et la fonction des S1PR.

Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ  dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ

Ce protocole décrit l’utilisation de biocapteurs basés sur BRET pour la mesure en temps réel de l’activation de la protéine G dans les cellules vivantes HEK293 lors de la stimulation du ligand du récepteur couplé à la protéine G. Ici, le récepteur β2-adrénergique et le récepteur cannabinoïde de type 1 servent d’exemples pour démontrer l’efficacité des capteurs pour plusieurs sous-types de protéines G et pour divers RCPG.

Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes

Découvrez un test de complémentation structurale pour surveiller les interactions GPCR-β-arrestine en temps réel dans les cellules vivantes. Cette méthode polyvalente accélère la découverte de médicaments de première classe avec moins d'effets secondaires.

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Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

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