Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

L'objectif général de cette procédure est de préparer des fibroblastes embryonnaires de souris adaptés à la culture de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites. Cette préparation consiste d'abord à séparer chaque embryon, puis à retirer la tête et les organes rouges. Ensuite, le tissu est finement haché et digéré.

Ensuite, les cellules sont ensemencées, de trois à quatre embryons par flacon, puis agrandies. Enfin, les mythes inactivés sont utilisés pour préparer le milieu conditionné. Finalement, l'ELSA est utilisée pour déterminer la concentration optimale d'actif dans un milieu conditionné permettant la croissance indifférenciée de cellules souches pluripotentes.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la procédure doit être standardisée afin de produire des fibroblastes embryonnaires de souris de haute qualité, qui permettront la croissance indifférenciée des cellules souches embryonnaires humaines ainsi que des cellules souches pluripotentes induites. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'isolement et la dissection de l'embryon sont des étapes difficiles à apprendre, la manipulation de l'embryon de souris nécessitant certaines compétences manuelles. La procédure sera démontrée par la Dr Justina Suk, postdoctorante dans mon laboratoire, ainsi que par l'étudiante diplômée Caterina Dres.

Après avoir sacrifié une souris gravide à 13 ou 14 jours post-cœum et disséqué les cornes utérines, rincez-les brièvement dans de l'éthanol à 70 % et placez-les dans un tube Falcon contenant du PBS, en respectant des conditions aseptiques sous une hotte de culture tissulaire. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri et séparez chaque embryon de son placenta et de sa poche embryonnaire. Retirez la tête et les organes rouges, lavez les fragments restants de l'embryon dans du PBS et placez-les dans une boîte de Pétri propre à l’aide d’un scalpel stérile.

Enfin, hacher finement le tissu jusqu'à ce qu'il devienne possible de le pipeter. Ensuite, ajouter un millilitre de trips à 0,05 % dans l'EDTA et 100 unités K par embryon de DNAsé I. Puis transférer le tissu dans un tube Falcon de 50 millilitres et l'incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Après chaque période de cinq minutes d'incubation, dissocier les cellules en pipettant soigneusement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Inactiver la trypsine en ajoutant un volume environ de meth.Medium fraîchement préparé. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à faible vitesse.

Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot dans du milieu méthylcellulose préchauffé. Préparez des flacons revêtus de gélatine à 0,2 % et incubez-les pendant au moins deux heures. À température ambiante, ensemencez les cellules provenant d’environ trois à quatre embryons dans chaque flacon revêtu de gélatine à 0,2 %. Les fibroblastes sont les seules cellules capables de s’attacher aux flacons revêtus de gélatine.

Après environ 24 heures, lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, congeler certaines cellules à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure, amplifier les cellules restantes jusqu’au passage trois ou passage quatre. Pour préparer les cellules nourricières à l’aide des passages trois et quatre, commencer par recouvrir des flacons T150 avec de la gélatine à 0,2 % et incuber à température ambiante pendant au moins deux heures.

Diluer la mitomycine C dans du PBS et filtrer à l’aide d’un filtre à seringue. Aspirer le milieu des maths et les laver avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ajouter 20 millilitres de milieu contenant 10 microgrammes par millilitre de mitomycine C sur les maths et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS et faites-les trypsiniser. Après l'incubation, resuspendez les cellules dans du milieu méth., puis centrifugez les cellules et resuspendez-les dans du milieu méth. chaud. Ensemencez les cellules à une densité de 56 000 cellules par centimètre carré dans des flacons T150 et incubez-les toute la nuit le jour suivant l'ensemencement des cellules méth.

Remplacez le milieu de culture par du milieu non conditionné pour HESC, supplémenté avec quatre nanogrammes par millilitre de FGF2, et incubez à 37 degrés Celsius. Vingt-quatre heures plus tard, récupérez le milieu conditionné à partir des flacons et remplacez-le par du milieu HESC frais. Conservez le milieu récupéré à moins 20 degrés Celsius.

Répétez la collecte pendant un total de six jours après la sixième collecte. Combinez tout le milieu et filtrez-le. Ensuite, stockez-le en aliquots de 50 millilitres à moins 80 degrés Celsius.

Pour mesurer l'activité dans un a, dans le milieu conditionné, porter tous les échantillons et réactifs à température ambiante. Diluer l'anticorps anti-activité dans un a dans du PBS contenant 1 % de BSA et ajouter 100 microlitres dans les puits d'une plaque microplaque. Incuber toute la nuit à température ambiante après 24 heures.

Lavez les puits trois fois avec du PBST. Ensuite, bloquez les puits pendant une heure à température ambiante. Pendant ce temps, préparez une courbe standard active, comprenant sept dilutions et un échantillon témoin, en utilisant une gamme de travail de 0,25 à 32 nanogrammes par millilitre.

Ajouter en double les étalons et les échantillons dans les puits et incuber deux heures à température ambiante. Laver les puits trois fois avec du PBST. Ensuite, ajouter un anticorps secondaire biotinylé et incuber deux heures à température ambiante.

Ensuite, lavez les puits trois fois avec du PBST et ajoutez de la streptavidine HRP. Après avoir mélangé et ajouté le substrat, recouvrez les parois pour les protéger de la lumière et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres de solution d'arrêt à chaque puits et mélangez délicatement.

Enfin, régler le lecteur de microplaques sur quatre 50 nanomètres avec correction de longueur d'onde à cinq 40 ou cinq 70 nanomètres, puis déterminer la densité optique de chaque puits indiqué. Voici la morphologie typique des hESC non différenciées, cultivées en présence de cellules nourricières, de milieu conditionné et de milieu défini. Dans ces exemples, les iPSC humaines sont cultivées en présence de cellules nourricières.

Ces images montrent la morphologie des mythes et des cellules nourricières inactivées utilisées pour préparer le milieu conditionné. En général, les cellules doivent être confluentes 24 heures après l'isolement et prêtes à être congelées ou agrandies. Toutefois, il peut parfois falloir deux à trois jours avant d'obtenir des cultures confluentes.

Le milieu conditionné doit être préparé à partir de cellules au quatrième passage et non au-delà. Cela est crucial car les cellules primaires ne peuvent être amplifiées que pendant quatre à cinq passages avant le début de la sénescence. La cytokine active dans un est considérée comme l'un des facteurs les plus critiques sécrétés par les cellules nourricières pour le soutien de la croissance indifférenciée des cellules pluripotentes.

La mesure du niveau d'activité dans un milieu conditionné, comme illustré ici, constitue un dosage quantitatif pratique permettant de surveiller la qualité des métastases. Une fois maîtrisée, l'isolement de fibroblastes embryonnaires de souris peut être réalisé en une à deux heures si la procédure est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'élever les animaux à l'avance et de préparer, puis d'autoclaver tous les instruments à l'avance.