Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

L’objectif global de cette procédure est de préparer des fibroblastes embryonnaires de souris adaptés à la culture de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites. Ceci est accompli en séparant d’abord chaque embryon et en retirant la tête et les organes rouges. Ensuite, le tissu est enfin haché et digéré.

Ensuite, les cellules sont mises en plaques, trois à quatre embryons par flacon et développées. Enfin, les mythes inactivés sont utilisés pour préparer le milieu conditionné. En fin de compte, e LSA est utilisé pour montrer la concentration optimale d’actifs dans un milieu conditionné favorisant la croissance indifférenciée des cellules souches pluripotentes.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la procédure doit être normalisée afin de produire des fibroblastes de souris Embry de haute qualité, ce qui permettra la croissance indifférenciée à la fois de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’isolement et la dissection des étapes de l’embryon sont difficiles à apprendre car la manipulation de l’embryon de souris nécessite certaines compétences manuelles. La Dre Justina Suk, qui est postdoctorante dans mon laboratoire, et également une étudiante diplômée, Caterina Dres, feront la démonstration de la procédure.

Après avoir sacrifié une souris enceinte à 13 ou 14 jours, post-coum et disséqué les cornes utérines, rincez-les brièvement avec de l’éthanol à 70 % et placez-les dans un tube Falcon contenant du PBS en utilisant des conditions aseptiques sous une hotte de culture tissulaire. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri et séparez chaque embryon de son placenta et de son sac embryonnaire. Retirez la tête et les organes rouges, lavez les morceaux restants d’embryon et de PBS et placez-les dans une boîte de Pétri propre à l’aide d’une lame de rasoir stérile.

Enfin, hachez le tissu jusqu’à ce qu’il devienne possible de pipeter. Ensuite, ajoutez un millilitre de 0,05 % de voyages dans EDTA et 100 unités K par embryon d’ADN. Transférez ensuite le tissu dans un tube Falcon de 50 millilitres et incubez-le pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Après chaque cinq minutes d’incubation, dissociez les cellules en pipetant soigneusement de haut en bas. Inactivez la trypsine en ajoutant environ un volume de méthamphétamine fraîchement préparée. Douleur moyenne. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à basse vitesse.

Retirez délicatement le supinate et remettez la pastille en suspension dans un milieu de méthamphétamine chaud, préparez des flacons enrobés de gélatine à 0,2 % et incubez pendant au moins deux heures. À température ambiante, placez les cellules d’environ trois à quatre embryons dans chaque fiole enrobée de gélatine à 0,2 %. Les fibroblastes sont les seules cellules qui ont la capacité de se fixer aux flacons enrobés de gélatine.

Après environ 24 heures, lorsque les cellules atteignent 80 à 90 % de fluidité, congelez certaines cellules à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation future, développez les cellules restantes à P trois ou P quatre. Pour préparer les cellules nourricières à l’aide des mathématiques P trois P quatre, commencez par enrober T un 50 flacons de gélatine à 0,2 % et incubez à température ambiante pendant au moins deux heures.

Diluez la mitomycine C dans du PBS et filtrez à travers un filtre à seringue. Aspirez le milieu de la méthamphétamine et lavez-les avec du PBS sans calcium ni magnésium. Placez 20 millilitres de milieu contenant 10 microgrammes par millilitre de mitomycine C sur le calcul et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS et essayez-les. Après l’incubation, suspendez les cellules dans du milieu de méthamphétamine, puis faites tourner les cellules vers le bas et mettez-les en suspension dans de la méthamphétamine chaude. Douleur moyenne. Plaquez les cellules à une densité de 56 000 cellules par centimètre carré dans 50 flacons et incubez-les pendant la nuit le lendemain de l’emballage des cellules de méthamphétamine.

Remplacez le milieu de culture par un milieu non conditionné HESC, complété par quatre nanogrammes par millilitre frais, deux FGF et un incubateur à 37 degrés Celsius. 24 heures plus tard, prélevez le milieu conditionné dans les flacons et remplacez-le par un milieu HESC frais. Conservez le milieu collecté à moins 20 degrés Celsius.

Répétez le prélèvement pendant un total de six jours après le sixième prélèvement. Combinez tout le support et filtrez-le. Ensuite, stockez-le dans des aliquotes de 50 millilitres à moins 80 degrés Celsius.

Pour mesurer l’actif dans un, dans un milieu conditionné, amener tous les échantillons et réactifs à température ambiante. Diluez l’actif dans un anticorps dans du PBS avec 1 %BSA et ajoutez 100 microlitres dans les puits d’une microplaque. Incuber toute la nuit à température ambiante après 24 heures.

Lavez les puits trois fois avec PBST. Bloquez ensuite les puits pendant une heure à température ambiante. Pendant ce temps, préparez une courbe standard active, comprenant sept dilutions et un échantillon à blanc en utilisant une plage de travail de 0,25 à 32 nanogrammes par millilitre.

Ajoutez des copies des étalons et des échantillons dans les puits et incubez pendant deux heures à température ambiante. Lavez les puits trois fois avec PBST. Ensuite, ajoutez un anticorps secondaire biotinylé et incubez pendant deux heures à température ambiante.

Ensuite, lavez les puits trois fois avec du PBST et ajoutez de la streptavidine HRP. Après avoir mélangé et ajouté le substrat, enveloppez les parois pour les protéger de la lumière et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits et mélangez délicatement.

Enfin, réglez le lecteur de microplaques sur quatre 50 nanomètres avec une correction de longueur d’onde à cinq 40 ou cinq 70 nanomètres, et déterminez la densité optique pour chaque puits illustré. Voici la morphologie typique des cellules souches hématopoïétiques indifférenciées, cultivées en présence de cellules nourricières, conditionnées, moyennes et définies. Dans ces exemples, les CSP HI sont cultivées en présence de cellules nourricières.

Ces images montrent la morphologie des mythes et des cellules nourricières inactivées utilisées pour préparer le milieu conditionné. En général, les cellules doivent être confluentes 24 heures après l’isolement et prêtes à être congelées ou élargies. Cependant, il peut parfois s’écouler deux à trois jours avant d’obtenir des cultures confluentes.

Le milieu conditionné doit être préparé à partir des cellules du passage quatre et non plus tard. Ceci est crucial car les cellules primaires ne peuvent être développées que pendant quatre à cinq passages avant le début de la sénescence. La cytokine active dans a est considérée comme l’un des facteurs les plus critiques sécrétés par les cellules nourricières pour le soutien de la croissance indifférenciée des cellules pluripotentes.

La mesure du niveau d’activité dans un milieu conditionné, comme indiqué ici, est un test quantitatif pratique pour surveiller la qualité des métas. Une fois maîtrisé, l’isolement du fibroblaste embryonnaire de souris peut être effectué en une à deux heures s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’élever les animaux à l’avance et de préparer et d’autoclaver tous les instruments à l’avance.