Génération de précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:03 min • July 8th, 2025
Prenez des cellules souches embryonnaires de souris en suspension dans des milieux sans sérum contenant de petites molécules inhibitrices.
Ensemencez les cellules sur une plaque de culture non adhérente, leur permettant de proliférer et de s’agréger pour former des corps embryoïdes tridimensionnels ou EB.
De plus, les inhibiteurs bloquent les voies de signalisation non neuronales et induisent la différenciation des cellules souches embryonnaires vers un destin neural cortical.
Transférez les EB dans un tube, centrifugez et retirez le surnageant.
Remettre les EB en suspension dans une solution contenant un cocktail d’enzymes et de la DNase.
Les enzymes dissocient les EB en cellules uniques, tandis que la DNase dégrade l’ADN contaminant.
Ajouter un milieu sans sérum contenant des inhibiteurs pour arrêter l’activité enzymatique, puis centrifuger et éliminer les enzymes contenant le surnageant.
Remettre les cellules en suspension dans des milieux contenant de petites molécules inhibitrices et les transférer sur des plaques de culture recouvertes de facteurs d’adhésion.
Les cellules se fixent à la surface de la plaque revêtue.
Les inhibiteurs empêchent la mort cellulaire apoptotique et induisent la différenciation cellulaire en progéniteurs interneurones corticaux.
Commencez à cultiver les cellules sous forme de corps embryoïdes en ajoutant 75 000 cellules par millilitre dans des milieux KSRN2 dans les boîtes de culture de tissus non adhérents et incubez-les à 37 degrés Celsius. Sur DD1, préparez-vous à l’atterrissage cellulaire en enrobant les boîtes traitées par culture tissulaire de poly-L-lysine pendant au moins une heure ou toute la nuit à 37 degrés Celsius.
Sur DD2, aspirez la poly-L-lysine et enduisez les plaques de laminine pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Sur DD3, avant de commencer la dissociation de l’EB, aspirez la laminine et laissez les plaques sécher complètement dans un capuchon de culture tissulaire.
Ensuite, transférez les EB avec le milieu dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant trois à quatre minutes à 15 fois g ou jusqu’à ce que les EB aient été granulés. Aspirez le milieu et ajoutez 3 millilitres de solution de détachement cellulaire contenant de la DNase. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Agitez doucement le tube toutes les trois minutes pour aider à la dissociation de l’EB. Une fois que les EB ne sont plus visibles ou que 15 minutes se sont écoulées, ajoutez 6 millilitres de KSRN2 contenant de la DNase et centrifugez pendant cinq minutes à 200 fois g. Ensuite, mettez en plaque les cellules de KSRN2 contenant du LDN193189, du XAV939 et de l’inhibiteur de ROCK Y27632 à 4,5 à 5 x 104 cellules par centimètre carré.
Aperçu
Cette étude décrit une méthode permettant de différencier des cellules souches embryonnaires murines en progéniteurs de neurones interneurones corticaux à l'aide d'inhibiteurs de petites molécules. Le processus implique la formation de corps embryonnaires (EB) puis leur dissociation en cellules individuelles pour la culture.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Différenciation cellulaire
Contexte
- Les cellules souches embryonnaires murines peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Les inhibiteurs de petites molécules peuvent influencer les voies de signalisation durant la différenciation.
- Les interneurones corticaux jouent un rôle crucial dans la fonction cérébrale.
- Les corps embryonnaires offrent un environnement de culture tridimensionnel.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour générer des progéniteurs de cellules interneuronales corticales à partir de cellules souches embryonnaires.
- Étudier les effets des inhibiteurs de petites molécules sur la différenciation cellulaire.
- Optimiser les conditions de culture pour l'attachement et la croissance des cellules.
Méthodes utilisées
- Les cellules souches embryonnaires ont été cultivées dans un milieu sans sérum contenant des inhibiteurs.
- Les cellules ont été ensemencées dans des plaques non adhérentes pour former des corps embryonnaires (EB).
- Les corps embryonnaires (EB) ont été dissociés en cellules individuelles à l’aide d’un cocktail enzymatique et de DNase.
- Les cellules ont été mises en culture sur des plaques revêtues de facteurs d’adhésion pour induire leur différenciation.
Résultats principaux
- Formation réussie de corps embryonnaires à partir de cellules souches embryonnaires.
- Dissociation efficace des corps embryonnaires en cellules uniques viables.
- Différenciation des cellules en progéniteurs de cellules interneuronales corticales.
- Les inhibiteurs ont empêché la mort cellulaire et favorisé la différenciation.
Conclusions
- Le protocole génère efficacement des progéniteurs d'interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires.
- Les inhibiteurs de petites molécules sont essentiels pour favoriser la différenciation.
- Cette méthode peut être appliquée à l'étude du développement des neurones corticaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une production échelonnée de précurseurs de neurones interneuronaux corticaux à partir de cellules souches embryonnaires murines, offrant un système pertinent pour l'étude du dysfonctionnement des neurones inhibiteurs dans les troubles neuropsychiatriques. En utilisant des inhibiteurs spécifiques de petites molécules pour orienter la différenciation, cette approche facilite l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux cibles thérapeutiques impliquées dans la formation et le fonctionnement des circuits corticaux. Le protocole fournit un modèle cellulaire reproductible et quantitatif, adapté à la validation de cibles et au criblage phénotypique dans les phases précoces des pipelines de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées au développement et à la fonction des interneurones corticaux.
- Valeur opérationnelle : Fournit une source renouvelable de progéniteurs neuronaux pertinents pour des études d'engagement de cibles.
- Valeur prédictive : Permet une dé-risquisation biologique en modélisant la biologie humaine des interneurones corticaux dans un système contrôlé in vitro.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Génère des précurseurs standardisés d'interneurones corticaux adaptés aux tests de criblage de composés et de modulation de voies biologiques.
- Résultats quantitatifs : Permet de mesurer l'efficacité de la différenciation, l'expression des marqueurs et la maturation électrophysiologique en tant que variables dépendantes.
- Extensibilité : L'expansion basée sur les corps embryonnaires permet de produire un nombre suffisant de cellules pour des formats de criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Les précurseurs d'interneurones corticaux modélisent les troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques impliquant un dysfonctionnement GABAergique.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les modèles dérivés de cellules souches et la validation préclinique des cibles régulant la migration et l'intégration neuronales.
- Réduction des risques mécanistiques : Précise les effets spécifiques aux voies des petites molécules sur la détermination du destin neuronal et la maturation.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la validation de la cible grâce à la génération d'un type cellulaire neuronal défini avant l'identification du composé leader et les tests d'efficacité préclinique.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les gènes et les voies régulant la spécification et la survie des interneurones corticaux.
- Criblage : Produit des cellules différenciées présentant une expression constante de marqueurs, permettant des lectures fiables lors du criblage de composés et de la modulation de cibles.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative de l'efficacité de la différenciation, du rendement en progéniteurs et de la puissance des inhibiteurs, en tant que métriques clés pour la prise de décision.
- Recherche translationnelle : Soutient les décisions d'avancement en fournissant un système pertinent pour l'humain afin d'évaluer les effets des cibles sur le développement des neurones inhibiteurs.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole de différenciation défini peut être standardisé entre les équipes et adapté à d'autres sous-types neuronaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible grâce à une compréhension mécanistique des voies de différenciation des interneurones corticaux.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et l'extensibilité de la production de précurseurs neuronaux pour des campagnes de criblage répétées.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en réduisant l'incertitude biologique dans la validation des cibles en neuropsychiatrie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en fonction de leurs effets dans un système neuronal pertinent pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, en différenciation neuronale et en manipulation de petites molécules.
- Dépend de l'accès à des plaques de culture non adhérentes, à des réactifs de dissociation enzymatique et à des substrats revêtus d'adhésifs.
- Exige des concentrations normalisées d'inhibiteurs et un chronométrage précis entre les lots pour assurer une différenciation reproductible.
- L'adaptation aux cellules souches humaines ou à d'autres lignées neuronales peut nécessiter une optimisation des combinaisons d'inhibiteurs.
- Limitée par l'origine murine des cellules, ce qui peut exiger une validation dans des modèles humains pour garantir une pertinence translationnelle.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026