Génération de précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Prenez des cellules souches embryonnaires de souris en suspension dans des milieux sans sérum contenant de petites molécules inhibitrices.

Ensemencez les cellules sur une plaque de culture non adhérente, leur permettant de proliférer et de s’agréger pour former des corps embryoïdes tridimensionnels ou EB.

De plus, les inhibiteurs bloquent les voies de signalisation non neuronales et induisent la différenciation des cellules souches embryonnaires vers un destin neural cortical.

Transférez les EB dans un tube, centrifugez et retirez le surnageant.

Remettre les EB en suspension dans une solution contenant un cocktail d’enzymes et de la DNase.

Les enzymes dissocient les EB en cellules uniques, tandis que la DNase dégrade l’ADN contaminant.

Ajouter un milieu sans sérum contenant des inhibiteurs pour arrêter l’activité enzymatique, puis centrifuger et éliminer les enzymes contenant le surnageant.

Remettre les cellules en suspension dans des milieux contenant de petites molécules inhibitrices et les transférer sur des plaques de culture recouvertes de facteurs d’adhésion.

Les cellules se fixent à la surface de la plaque revêtue.

Les inhibiteurs empêchent la mort cellulaire apoptotique et induisent la différenciation cellulaire en progéniteurs interneurones corticaux.

Commencez à cultiver les cellules sous forme de corps embryoïdes en ajoutant 75 000 cellules par millilitre dans des milieux KSRN2 dans les boîtes de culture de tissus non adhérents et incubez-les à 37 degrés Celsius. Sur DD1, préparez-vous à l’atterrissage cellulaire en enrobant les boîtes traitées par culture tissulaire de poly-L-lysine pendant au moins une heure ou toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Sur DD2, aspirez la poly-L-lysine et enduisez les plaques de laminine pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Sur DD3, avant de commencer la dissociation de l’EB, aspirez la laminine et laissez les plaques sécher complètement dans un capuchon de culture tissulaire.

Ensuite, transférez les EB avec le milieu dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant trois à quatre minutes à 15 fois g ou jusqu’à ce que les EB aient été granulés. Aspirez le milieu et ajoutez 3 millilitres de solution de détachement cellulaire contenant de la DNase. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Agitez doucement le tube toutes les trois minutes pour aider à la dissociation de l’EB. Une fois que les EB ne sont plus visibles ou que 15 minutes se sont écoulées, ajoutez 6 millilitres de KSRN2 contenant de la DNase et centrifugez pendant cinq minutes à 200 fois g. Ensuite, mettez en plaque les cellules de KSRN2 contenant du LDN193189, du XAV939 et de l’inhibiteur de ROCK Y27632 à 4,5 à 5 x 10⁴ cellules par centimètre carré.