Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

L’objectif global de cette procédure est d’étudier le profil global de méthylation et d’identifier les régions riches en CpG méthylées de manière différentielle chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique à l’aide du séquençage de nouvelle génération. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que l’identification des gènes de signature potentiels spécifiques de la LLC, la pathogenèse de la maladie et le pronostic. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une couverture complète de la méthylation des CpG à l’échelle du génome de manière impartiale et indépendante de la PCR.

Pour commencer, utilisez un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce pour isoler l’ADN génomique du patient et des échantillons de cellules mononucléées normales du sang périphérique selon le protocole du fabricant. Après avoir quantifié l’ADN génomique comme décrit dans le protocole de texte, diluez 5 microgrammes d’ADN génomique de chaque échantillon, jusqu’à un total de 200 microlitres à l’aide d’un tampon TE, ce qui donne une concentration finale de 25 nanogrammes par microlitre. Ensuite, effectuez une sonication dans des tubes spécialement conçus, à l’aide d’un sonicateur, pour un total de 30 cycles de 30 secondes de marche et 30 secondes d’arrêt.

Tous les cinq cycles, faites tourner brièvement les tubes pour recueillir les échantillons jusqu’au fond. Vérifiez la plage de sonication pour tous les échantillons à l’aide de l’électrophorèse de l’ADN, comme décrit dans le protocole texte. Pour préparer les billes de streptavidine magnétiques, mettez-les d’abord en suspension dans le tube de crosse fourni par le kit.

Pipetez doucement les billes de haut en bas pour obtenir une suspension homogène. Pour chaque cinq microgrammes d’échantillon d’ADN fragmenté, placez 50 microlitres de billes dans des tubes de 1,5 millilitre séparés, propres et étiquetés. Ajoutez 50 microlitres de 1X tampon de lavage de billes pour atteindre un volume final de 100 microlitres.

Placez les tubes sur un support magnétique pendant une minute pour permettre à toutes les billes magnétiques de se concentrer sur la paroi intérieure du tube faisant face à l’aimant. Retirez le liquide sans toucher les billes, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Ensuite, retirez les tubes du support magnétique, ajoutez 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X et mélangez doucement les billes à l’aide d’une pipette.

Après avoir répété ces étapes au moins quatre fois pour tous les échantillons, remettez enfin les échantillons en suspension dans 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X. Conservez les échantillons sur de la glace. Pour lier la protéine MBD-biotine aux billes lavées, ajoutez d’abord 35 microlitres de protéines dans des tubes séparés et portez le volume total à 250 microlitres à l’aide d’un tampon de lavage de billes 1X.

Ajoutez 250 microlitres de protéines MBD diluées aux 250 microlitres de billes lavées et laissez-les tourner de bout en bout à température ambiante. Après avoir mélangé les billes dans les protéines pendant une heure, lavez les billes de streptavidine magnétique liées aux protéines en plaçant les tubes sur le support magnétique pendant une minute. Retirez le liquide sans toucher les billes à l’aide d’une pipette.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X et placez les tubes sur un mélangeur rotatif pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus avant de remettre en suspension les billes de biotine MBD lavées dans 200 microlitres de tampon de lavage de billes 1X, rendant les billes prêtes pour la capture d’ADN méthylé. Dans un tube propre de 1,5 millilitre sans DNase, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage de billes d’un millilitre et 180 microlitres d’ADN génomique fragmenté.

Portez le volume final à 500 microlitres en utilisant de l’eau sans DNase. Ajoutez 380 microlitres d’eau exempte de DNase aux 20 litres restants d’ADN génomique fragmenté. Congelez les échantillons pour les traiter plus tard et utilisez-les comme contrôles d’ADN d’entrée.

Placez les tubes contenant les billes de biotine MBD lavées sur un support magnétique pendant une minute et retirez le liquide sans déranger les billes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’ADN génomique fragmenté dilué dans un tampon de lavage de billes. Fermez hermétiquement tous les tubes avec un film de paraffine et laissez-les toute la nuit à 4 degrés Celsius sur un support de rotation de bout en bout à 8 à 10 rotations par minute.

Après la réaction de liaison de l’ADN et des billes MBD, placez les tubes sur le support magnétique pendant une minute pour concentrer toutes les billes sur la paroi interne du tube. Retirez le liquide surnageant à l’aide d’une pipette sans toucher les perles, et conservez cette fraction d’échantillon d’ADN non liée sur de la glace. Ajoutez ensuite 200 microlitres de tampon de lavage de billes 1X aux billes et placez les tubes sur le support rotatif pendant trois minutes à température ambiante.

Après avoir retiré le liquide à l’aide du support magnétique, répétez le lavage deux fois de plus pour éliminer l’ADN résiduel non lié. Après le lavage final, ajoutez 200 microlitres de tampon d’élution à haute teneur en sel fourni dans le kit pour éluer l’ADN. Ensuite, placez les tubes sur le support rotatif pendant 15 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, placez-les sur le support magnétique pendant une minute et à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d’élution à haute teneur en sel aux billes et répétez l’élution en tournant les tubes à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaires. Ajoutez le deuxième élu dans le même tube contenant les 200 microlitres du premier élu.

Pour précipiter l’ADN, ajoutez un microlitre de glycogène, 40 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires, pH 5,2 et 800 microlitres d’éthanol absolu glacé à 400 microlitres d’ADN élué. Ajoutez également les réactifs aux 400 microlitres d’échantillons de contrôle d’ADN d’entrée préalablement congelés. Mélangez bien les tubes en tourbillonnant avant de les incuber à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, centrifugez les tubes à 12 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Jetez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % et vortex les tubes.

Après avoir centrifugé à nouveau les tubes dans les mêmes conditions mais pendant 15 minutes, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette avec précaution. Ensuite, centrifugez les tubes à vitesse maximale pendant une minute à température ambiante et éliminez complètement l’éthanol résiduel à l’aide d’une pointe de pipette. Faites sécher le granulé à l’air libre pendant cinq minutes à température ambiante.

Enfin, ajoutez 10 microlitres d’eau exempte de DNase à la pastille d’ADN avant de procéder à la quantification de l’ADN méthylé, au séquençage de la MBD et à l’analyse comme décrit dans le protocole textuel. L’analyse a permis d’identifier plusieurs régions différentiellement hyper et hypométhylées enrichies dans les échantillons de LLC par rapport aux témoins normaux. Ces régions méthylées de manière différentielle ont été cartographiées à différentes classes de gènes codants et non codants pour des protéines.

Enfin, l’analyse des données a montré un chevauchement significatif entre les régions différentiellement méthylées associées à la LLC obtenues à partir de deux comparaisons différentes de témoins normaux. Ici, tous les sites CpG situés dans les régions cibles de deux gènes différentiellement méthylés ont été validés dans un grand nombre d’échantillons de LLC par pyroséquençage. La plage de sonication optimale requise pour cette méthode est illustrée ici.

Cette gamme d’ADN fragmenté est idéale et plus adaptée aux fins de séquençage de nouvelle génération. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est bien faite. Lors de cette procédure, les facteurs cruciaux qui affectent la récupération finale de l’ADN sont la qualité et la quantité d’ADN d’entrée utilisée et la portée de l’ADN fragmenté après sonication.

Nous avons décidé d’utiliser cette méthode parce qu’il s’agit de la première étude mondiale sur la méthylation de la LLC basée sur l’immunoprécipitation pour enrichir l’ADN méthylé couvrant toutes les régions méthylées du génome. Les implications de cette technique s’étendent au pronostic ou au traitement, car les gènes de signature différentiellement méthylés identifiés pourraient servir de biomarqueurs normaux globaux et de cibles épigénétiques pour le traitement. À la suite de cette procédure, l’ADN méthylé enrichi peut être utilisé pour d’autres applications en aval telles que l’hybridation ou la réalisation de microréseaux pour comparer facilement les métalomes entre deux échantillons ou entités pathologiques à l’aide d’un ensemble fixe de sites CpG présents sur les réseaux.

Enfin, il s’agit d’une technique rentable pour analyser un grand nombre d’échantillons de patients à la recherche de séquences méthylées dans l’ensemble du génome, y compris des séquences annotées couvrant des gènes codant pour des protéines ainsi que des séquences non annotées couvrant des éléments répétitifs et de longs ARN non codants.