Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le profilage global de la méthylation et d'identifier les régions riches en CpG différentiellement méthylées chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique à l'aide du séquençage de nouvelle génération. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'épigénétique, telles que l'identification de gènes-signatures spécifiques du CLL impliqués dans la pathogenèse de la maladie et son pronostic. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre une couverture complète et exhaustive de la méthylation des CpG sur l'ensemble du génome, de manière impartiale et indépendante de la PCR.

Pour commencer, utilisez un kit d'extraction d'ADN disponible dans le commerce pour isoler l'ADN génomique à partir des échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique du patient et d'un sujet normal, conformément au protocole du fabricant. Après avoir quantifié l'ADN génomique comme décrit dans le protocole écrit, diluez 5 microgrammes d'ADN génomique provenant de chaque échantillon jusqu'à un volume total de 200 microlitres à l'aide de tampon TE, afin d'obtenir une concentration finale de 25 nanogrammes par microlitre. Ensuite, effectuez la sonication dans des tubes spécialement conçus, à l'aide d'un sonicateur, pendant un total de 30 cycles de 30 secondes d'activation suivies de 30 secondes de pause.

Après chaque série de cinq cycles, faire une courte centrifugation pour ramener les échantillons au fond des tubes. Vérifier l'étendue de la sonication pour tous les échantillons par électrophorèse de l'ADN, comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les billes magnétiques de streptavidine, les resuspendre d'abord à partir du tube stock fourni avec le kit.

Agiter doucement les billes de haut en bas afin d'obtenir une suspension homogène. Pour chaque cinq microgrammes d'échantillon d'ADN fragmenté, placer 50 microlitres des billes dans des tubes de 1,5 millilitre séparés, propres et étiquetés. Ajouter 50 microlitres de tampon de lavage de billes à 1X pour atteindre un volume final de 100 microlitres.

Placer les tubes sur un support magnétique pendant une minute afin que toutes les billes magnétiques s'accumulent sur la paroi interne du tube tournée vers l'aimant. Éliminer le liquide sans toucher les billes, à l'aide d'une pipette de 200 microlitres. Ensuite, retirer les tubes du support magnétique, ajouter 250 microlitres de tampon de lavage de billes à 1X et mélanger délicatement les billes avec une pipette.

Après avoir répété ces étapes au moins quatre fois pour tous les échantillons, resuspendre finalement les échantillons dans 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X. Garder les échantillons sur de la glace. Pour lier la protéine MBD-biotine aux billes lavées, ajouter d'abord 35 microlitres de protéine à des tubes séparés et porter le volume total à 250 microlitres à l'aide de tampon de lavage de billes 1X.

Ajouter 250 microlitres de protéine MBD diluée aux 250 microlitres de billes lavées et laisser tourner lentement bout à bout à température ambiante. Après un mélange des billes dans la protéine pendant une heure, laver les billes magnétiques streptavidine liées à la protéine en plaçant les tubes sur le support magnétique pendant une minute. Retirer le liquide sans toucher les billes à l’aide d’une pipette.

Ensuite, ajouter 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X et placer les tubes sur un mélangeur rotatif pendant cinq minutes à température ambiante. Répéter l'étape de lavage deux fois supplémentaires avant de re-suspendre les billes MBD-biotine lavées dans 200 microlitres de tampon de lavage de billes 1X, afin de préparer les billes pour la capture de l'ADN méthylé. Dans un tube propre de 1,5 millilitre exempt de DNase, ajouter 100 microlitres de tampon de lavage de billes par millilitre et 180 microlitres d'ADN génomique fragmenté.

Amener le volume final à 500 microlitres à l'aide d'eau sans DNase. Ajouter 380 microlitres d'eau sans DNase aux 20 litres restants d'ADN génomique fragmenté. Congeler les échantillons pour les traiter ultérieurement et les utiliser comme témoins d'ADN d'entrée.

Placez les tubes contenant les billes MBD-biotine lavées sur un support magnétique pendant une minute, puis retirez le liquide sans perturber les billes. Ajoutez ensuite 500 microlitres d'ADN génomique fragmenté dilué dans du tampon de lavage pour billes. Scellez hermétiquement tous les tubes avec un film de paraffine et laissez-les toute la nuit à 4 degrés Celsius sur un agitateur rotatif à rotation continue, à 8 à 10 rotations par minute.

Après la réaction de liaison de l'ADN aux billes MBD, placer les tubes sur le support magnétique pendant une minute afin de concentrer toutes les billes sur la paroi interne du tube. Retirer le liquide surnageant à l’aide d’une pipette sans toucher les billes, et conserver cette fraction d’échantillon d’ADN non lié sur de la glace. Ensuite, ajouter 200 microlitres de tampon de lavage des billes 1X aux billes et placer les tubes sur le support rotatif pendant trois minutes à température ambiante.

Après avoir éliminé le liquide à l’aide du support magnétique, répétez le lavage deux fois supplémentaires afin d’éliminer l’ADN non lié résiduel. Après le dernier lavage, ajoutez 200 microlitres de tampon de désorption à haute teneur en sels fourni dans le kit pour éluer l’ADN. Ensuite, placez les tubes sur le support rotatif pendant 15 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, placez-les sur le support magnétique pendant une minute et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d'élution à haute teneur en sel sur les billes, puis répétez l'élution en faisant tourner les tubes à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaires. Ajoutez le deuxième éluat au même tube contenant les 200 microlitres du premier éluat.

Pour précipiter l'ADN, ajouter un microlitre de glycogène, 40 microlitres d'acétate de sodium trois molaire, pH 5,2, et 800 microlitres d'éthanol absolu glacé à 400 microlitres d'ADN éluté. Ajouter également les réactifs aux échantillons témoins d'ADN d'entrée précédemment congelés de 400 microlitres. Mélanger soigneusement les tubes par vortexage avant de les incuber à moins 80 degrés Celsius pendant toute la nuit.

Le lendemain, centrifuger les tubes à 12 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Éliminer soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Ensuite, ajouter 500 microlitres d'éthanol à 70 % et mélanger les tubes au vortex.

Après une nouvelle centrifugation des tubes dans les mêmes conditions, mais pendant 15 minutes, éliminer le surnageant en utilisant soigneusement une pipette. Ensuite, centrifuger les tubes à vitesse maximale pendant une minute à température ambiante, puis éliminer complètement l'éthanol résiduel à l'aide d'une pointe de pipette. Laisser sécher le culot à l'air pendant cinq minutes à température ambiante.

Enfin, ajoutez 10 microlitres d'eau sans DNase au culot d'ADN avant de procéder à la quantification de l'ADN méthylé, au séquençage MBD et à l'analyse, comme décrit dans le protocole écrit. L'analyse a identifié plusieurs régions différentiellement hyper- et hypométhylées enrichies dans les échantillons de LMC par rapport aux témoins normaux. Ces régions différentiellement méthylées ont été cartographiées sur différentes classes de gènes codant des protéines et de gènes non codants.

Enfin, l'analyse des données a révélé un recouvrement significatif entre les régions différentiellement méthylées associées à la LLC, obtenues à partir de deux comparaisons différentes avec des échantillons témoins normaux. Ici, tous les sites CpG situés dans les régions cibles de deux gènes différentiellement méthylés ont été validés dans un grand nombre d'échantillons de LLC par pyroséquençage. La plage optimale de sonication requise pour cette méthode est illustrée ici.

Ce spectre d'ADN fragmenté est idéal et plus adapté aux fins de séquençage de nouvelle génération. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, les facteurs cruciaux qui influencent la récupération finale de l'ADN sont la qualité et la quantité d'ADN d'entrée utilisées, ainsi que le spectre de l'ADN fragmenté après sonication.

Nous avons choisi d'utiliser cette méthode car il s'agit de la première étude globale de méthylation de la LMC basée sur l'immunoprécipitation pour enrichir l'ADN méthylé couvrant toutes les régions méthylées à travers le génome. Les implications de cette technique s'étendent à la fois vers le pronostic et le traitement, car les gènes de signature différemment méthylés identifiés pourraient servir de biomarqueurs normaux globaux et de cibles épigénétiques pour la thérapie. Après cette procédure, l'ADN méthylé enrichi peut être utilisé pour d'autres applications en aval, telles que l'hybridation ou la réalisation de puces à ADN, permettant ainsi de comparer facilement les méthylomes entre deux échantillons ou entités pathologiques à l'aide d'un ensemble fixe de sites CpG présents sur les puces.

Enfin, il s'agit d'une technique rentable permettant d'analyser un grand nombre d'échantillons de patients pour détecter des séquences méthylées à travers le génome, y compris des séquences annotées couvrant les gènes codant pour des protéines ainsi que des séquences non annotées couvrant des éléments répétitifs et des ARN non codants longs.