Name: Analyse approfondie de la méthylation dADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Découvrez une méthode de séquençage MBD optimisée pour analyser la méthylation de l'ADN dans la leucémie lymphocytaire chronique. Cette approche offre une couverture génomique complète des sites CpG méthylés sans biais ni PCR.

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Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la Société suédoise du cancer, la Fondation Knut et Alice Wallenberg (KAW) et FoU VästraGötalandsregionen.

L&#39;approbation éthique pour la collecte des échantillons CLL est de 2007-05-21, avec le numéro d&#39;enregistrement suivant: EPN Gbg dnr 239/07. Tous les patients CLL ont été diagnostiqués selon les critères récemment révisés 8 , et les échantillons ont été recueillis au moment du diagnostic. Les patients de l&#39;étude ont été inclus dans différents départements d&#39;hématologie dans la partie ouest de la Suède après avoir obtenu un consentement écrit. Seuls les échantillons de cellules mononucléaires de sang périphérique CLL (PBMC) avec un pourcentage tumoral de cellules leucémiques ≥ 70% ont été sélectionnés dans cette étude. 1. Préparations <ol><li> Isoler les PBMC pour les extractions d&#39;ADN de CLL et des échantillons de sang périphériques normaux et sains en utilisant un kit d&#39;isolement commercial (voir la table des matériaux ), conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Autoclave de tubes de 1,5 mL. Décongeler tous les réactifs dans le kit de liaison à l&#39;ADN méthylé (voir la table des matériaux ). &lt;/ Li&gt; <li> Utilisez de l&#39;eau exempte de DNase pour préparer 10 ml d&#39;un tampon de lavage de tampon 1x à partir du tampon de lavage 5x fourni par le kit pour laver les perles et diluer la protéine MBD fournie par le kit. </li><li> Obtenez ou préparez les éléments suivants à l&#39;avance: 3 M d&#39;acétate de sodium, éthanol absolu et 70% d&#39;éthanol pour la précipitation de l&#39;ADN ( Tableau des matériaux ). </li></ol> 2. Extraction d&#39;ADN génomique et sonication <ol><li> Utiliser un kit d&#39;extraction d&#39;ADN disponible dans le commerce ( Tableau des matériaux ) pour isoler l&#39;ADN génomique des échantillons PBMC patients et normaux selon le protocole du fabricant. Quantifier l&#39;ADN génomique à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à 260 nm. NOTE: La capacité de la colonne d&#39;extraction d&#39;ADN est de 5 à 6 millions de cellules, maximum; Par conséquent, il est important d&#39;utiliser plus d&#39;une colonne pour les échantillons avec plus de 5 millions de cellules. Eluer l&#39;ADN deux fois en volume égal à 100 μL de tampon 10 mM Tris EDTA (TE). La protéine MBD-biotine utilisée dans le méthylLe kit mineur pour le séquençage MBD ne se liera pas à l&#39;ADN monocaténaire. Ainsi, il est très important de garder l&#39;ADN élué soit congelé, soit à 4 ° C pour préserver sa nature double brin. </li><li> Diluer 5 μg d&#39;ADN génomique de chaque échantillon à un total de 200 μL en utilisant un tampon TE (pH 8), en donnant une concentration finale de 25 ng / μL. </li><li> Effectuez une sonication dans des tubes spécialement conçus à l&#39;aide d&#39;un sonicateur ( Table des matériaux ) pour un total de 30 cycles (30 s sur et 30 s par cycle, après 5 cycles, tournez brièvement les tubes pour collecter les échantillons en bas). NOTE: Cela produira un ADN fragmenté compris entre 150 pb et 300 pb, ce qui est optimal pour ce protocole. </li><li> Vérifiez la plage de sonication pour tous les échantillons avant de passer à l&#39;étape suivante du séquençage de MBD en exécutant 1 μL des échantillons d&#39;ADN fragmentés et une échelle de taille d&#39;ADN sur un gel d&#39;agarose 2% pré-légué dans le commerce en utilisant un équipement d&#39;imagerie par électrophorèse d&#39;ADN. Visualiser tIl utilise un transilluminateur UV standard. </li></ol> 3. Préparation des perles avant la liaison avec la protéine MBD-biotine <ol><li> Remettre en suspension les billes magnétiques de streptavidine du tube stock fourni par le kit, en pipingant doucement vers le haut et vers le bas pour obtenir une suspension homogène. Ne pas tourbillonner les perles ou les laisser sécher. </li><li> Placez 50 μL de perles (pour chaque 5 μg d&#39;échantillon d&#39;ADN fragmenté) dans des tubes séparés, propres et étiquetés de 1,5 mL. Ajouter 50 μL de 1x tampon de lavage de talons pour atteindre le volume final de 100 μL. REMARQUE: Lors de l&#39;utilisation de petites bandes de réaction à la chaîne de polymérase de 0,5 mL (PCR) pour le lavage des billes, on utilise environ 150-200 μL de tampon de lavage par tube, comme mentionné dans le protocole du kit. Cependant, dans le cas de tubes de 1,5 mL, ajouter au moins 250 μL à 300 μL de tampon de lavage par tube pour le lavage des talons. </li><li> Placez les tubes sur un support magnétique pendant une minute pour permettre à toutes les perles magnétiques de se concentrer sur la paroi interne du tubeFace à l&#39;aimant. Retirez le liquide, sans toucher les perles, en utilisant une pipette de 200 μL. </li><li> Retirez les tubes du support magnétique, ajoutez 250 μL de tampon de tampon 1x et mélangez doucement les billes avec une pipette. </li><li> Répétez les étapes 3.3 et 3.4 au moins 4-5 fois pour tous les échantillons et résulez finalement dans 250 μL de tampon de lavage de talons 1x. Gardez-les sur la glace. </li></ol> 4. Relier la protéine MBD-biotine aux perles lavées <ol><li> Ajouter 35 μL de protéine MBD (7 μL pour 1 μg d&#39;échantillon d&#39;ADN) pour séparer les tubes et porter le volume total jusqu&#39;à 250 μL en utilisant un tampon de lavage de béton 1x. </li><li> Ajouter 250 μL de protéine MBD diluée aux 250 μL de perles lavées et les laisser sur une rotation de bout en bout à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Après avoir mélangé les perles et les protéines pendant 1 h, lavez la biotine de protéine MBD liée avec des billes magnétiques de streptavidine. <ol><li> Placez les tubes sur le support magnétique pendant 1 min et retirez tIl liquide sans toucher les perles à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ajouter 250 μL de tampon de tampon 1x et placer les tubes sur un mélangeur rotatif pendant 5 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;étape 4.3.1 deux fois de plus et résulez finalement les billes de biotine MBD lavées dans 200 μL de tampon de lavage de béton 1x, ce qui rend les billes prêtes pour la capture d&#39;ADN méthylé. REMARQUE: le lavage 2-3 fois de cette manière supprime toutes les billes de protéines MBD non liées au fond et améliore la liaison efficace des billes couplées à la protéine MBD avec de l&#39;ADN génomique fragmenté. </li></ol> 5. Relier des billes MBD-biotine avec de l&#39;ADN génomique fragmenté <ol><li> Dans un tube propre de 1,5 mL sans DNase, ajouter 100 μL de tampon de lavage de perles 5x et 180 μL de l&#39;ADN génomique fragmenté (étape 2.3). Apportez le volume final à 500 μL en utilisant de l&#39;eau exempte de DNase. </li><li> Ajouter 380 μL d&#39;eau exempte de DNase aux 20 μL restants de l&#39;ADN génomique fragmenté et les congeler. Utilisez ces échantillons comme DN d&#39;entréeA les contrôle et précipite plus tard avec les échantillons d&#39;ADN méthylé élué final (voir étape 7.1). </li><li> Placer les tubes contenant des billes MBD-biotine lavées (étape 4.4) sur un support magnétique pendant 1 min et retirer le liquide sans perturber les perles. Ajouter 500 μl d&#39;ADN génomique fragmenté dilué dans un tampon de lavage de bourrelets. </li><li> Sceller tous les tubes avec un film de paraffine et les laisser pendant une nuit à 4 ° C sur un support de rotation de bout en bout à 8-10 tr / min. NOTE: La réaction de liaison à l&#39;ADN et à la biotine-perle peut être effectuée pendant 1 h à température ambiante, mais la laisser à 4 ° C pendant la nuit peut améliorer la récupération de l&#39;ADN méthylique final. </li></ol> 6. Suppression de l&#39;ADN non consolidé et élution de l&#39;ADN méthylé des perles <ol><li> Après la réaction de liaison DNA et MBD-bead, placez les tubes sur le support magnétique pendant 1 min pour concentrer toutes les perles sur la paroi interne du tube. </li><li> Retirer le liquide surnageant avec une pipette sans toucherLes perles et sauver cette fraction d&#39;échantillon d&#39;ADN non liée sur la glace. </li><li> Ajouter 200 μL de 1x tampon de lavage de perles aux perles et placer les tubes sur le support rotatif pendant 3 min à température ambiante. Placez les tubes sur le support magnétique et enlevez le liquide. Répétez le lavage deux fois encore pour éliminer l&#39;ADN résiduel non lié. </li><li> Après le lavage final, ajouter 200 μl de tampon d&#39;élution à haute teneur en sel (2 000 mM de NaCl), fourni dans le kit pour éluer l&#39;ADN. </li><li> Placez les tubes sur le support rotatif pendant 15 min à température ambiante. Placez-les sur le support magnétique pendant 1 min et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube nouveau et propre de 1,5 mL. </li><li> Ajouter 200 μl de tampon d&#39;élution à haute teneur en sel et répéter l&#39;élution en faisant tourner les tubes à température ambiante pendant 15 min. Ajouter le second eluage au même tube contenant les 200 μL du premier élu. NOTE: Les 400 uL finaux d&#39;ADN élue total sont maintenant prêts pour la précipitation à l&#39;éthanol pour extraire le purifiéL&#39;ADN convient pour le séquençage de la prochaine génération. </li></ol> 7. Précipitation d&#39;éthanol et l&#39;enrichissement de l&#39;ADN méthylé <ol><li> Ajouter 1 μl de glycogène (20 μg / μL, inclus dans le kit); 40 μl d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2; Et 800 μl d&#39;éthanol absolu glacé à 400 μl d&#39;ADN élue et également aux 400 μl d&#39;échantillons d&#39;ADN d&#39;entrée préparés à l&#39;étape 5.2. </li><li> Mélangez bien les tubes en faisant tourbillonner et les incuber à -80 ° C pendant la nuit. </li><li> Centrifuger les tubes à 12 000 xg (vitesse maximale) et 4 ° C. Jeter soigneusement le surnageant, sans perturber la pastille, ajouter 500 μL d&#39;éthanol à 70% et tourbillonner les tubes. </li><li> Centrifuger à nouveau à la vitesse maximale pendant 15 min à 4 ° C et retirer le surnageant en utilisant soigneusement une pipette. Faire refroidir les tubes à la vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante et enlever complètement l&#39;éthanol résiduel à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette. </li><li> Sécher à l&#39;air la pastille pendant 5 min à température ambianteRature. Ajouter 10 μL d&#39;eau exempte de DNase à la pastille d&#39;ADN. Procéder à la quantification de l&#39;ADN méthylé (étape 7.6), séquençage MBD (étape 7.7) et analyse (sections 8 et 9). </li><li> Quantifier les échantillons d&#39;ADN méthylés récupérés finalisés à l&#39;aide d&#39;un kit de quantification fluorimétrique disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux ), selon les instructions du fabricant. </li><li> Note: En utilisant ce protocole, 30 à 50 ng d&#39;ADN final ont été récupérés de chaque échantillon. Les échantillons d&#39;ADN sont prêts à envoyer sur de la glace sèche pour la construction de la bibliothèque en aval et le séquençage MBD à haut débit </li><li> Effectuer la construction de la bibliothèque d&#39;ADN et le séquençage MBD à haut débit en utilisant une plate-forme commerciale ( Table des matériaux ), comme décrit dans la référence 9 . REMARQUE: pour le contrôle de qualité initial de l&#39;ADN méthylique final, effectuer des préparations de bibliothèque en utilisant un séquençage par paire de 50 pb pour tous les échantillons. Traiter les données brutes pour le contrôle de qualité après séquençage, unS élaboré à la étape 8.1, et le traiter en utilisant les approches bioinformatiques et les méthodes statistiques, comme décrit ci-dessous (étapes 8.2-9.6). </li></ol> 8. Méthode d&#39;analyse de la bioinformatique 1: identification des régions différenciées méthylées associées au CLL (cllDMR) <ol><li> Nettoyez les lectures de 49 pb obtenues (format FASTQ) pour les adaptateurs utilisant des outils de contrôle de qualité disponibles, tels que Trimmomatic 10 ou Cutadapt. Vérifiez la qualité des lectures taillées à l&#39;aide de la boîte à outils FastQC: Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptateurs.fasta: 2: 30: 10 </li><li> Alignez les fichiers FASTQ nettoyés avec un générateur de courtes lectures Bowtie contre un génome de référence 11 . Spécifiez les paramètres ci-dessous: <ol><li> Autoriser jusqu&#39;à deux désadaptations (paramètre Bowtie: -v 2). </li><li> Limiter les rapports aux six meilleurs alignements par lecture (paramètre Bowtie: -m 6) pour contrôlerPour les lectures multi-mappage. Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq&gt; SAMPLE.sam REMARQUE: Convertissez les fichiers SAM générés pour les échantillons individuels après l&#39;alignement en BAM à l&#39;aide de SAMtools. Vue samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam </li></ol></li><li> Utilisez l&#39;analyse par modèle de ChIP-Seq (MACS) sur les échantillons alignés (BAM) pour prédire les régions enrichies / méthylées des sous-groupes CLL 12 . REMARQUE: Comparaison I: utilisez l&#39;échantillon d&#39;entrée comme groupe témoin et les échantillons de patients normal et CLL comme groupes de traitement. Cette étape consiste à collecter tous les pics négatifs (pics élevés en entrée / arrière-plan). Comparaison II: Utiliser le groupe d&#39;échantillons normal comme groupe témoin et le groupe d&#39;échantillons de patients CLL comme groupe de traitement. Les pics positifs obtenus sont des régions hyper-méthylées CLL, et les pics négatifs sont des régions hypométhylées de CLL sur des régions méthylées normales ou différentielles (DMR). Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs </li><li> Supprimer les pics de fond de Comparaison I des régions différenciées méthylées (DMR) à l&#39;aide de BEDtools 13 . Bedtools soustraient -a &lt;CLL_enriched_regions&gt; -b &lt;Input_enriched_regions&gt; </li><li> Prévoyez le pourcentage d&#39;éléments répétés (SINE-Alu, LINE, etc. ) enrichis en DMR. <ol><li> Utilisez fastacmd pour extraire la séquence FASTA de DMR par les coordonnées chromosomiques du génome de référence HG19. Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosome -L Start, End -l 50000&gt; DMRs.fasta </li><li> Utilisez l&#39;outil de ligne de commande RepeatMasker pour prédire le pourcentage d&#39;éléments répétés présents dans la séquence FASTA des DMR. RepeatMasker -gc -gccalc -s -species humain -html DMRs.fasta </li></ol></li><li> Annotez les DMR prévus en utilisant Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; avec l&#39;Ensembl disponible [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] annotation de transcription (codage de protéines et transcriptions non codantes). AnnotatePeaks.pl DMRs.bed &lt;GENOME&gt; -gtf &lt;Ensembl ou Gencode GTF&gt; REMARQUE: cela fournit des informations sur la répartition des pics sur différentes régions génériques ( c.-à-d., Promoteur, exon, intron, UTR 3 &#39;et UTR 5&#39;) et régions intergéniques. Les transcrits ou les gènes associés aux DMR sont appelés gènes méthylés différentiellement (DMG). </li><li> Utilisez l&#39;outil d&#39;enrichissement avec la base de données fonctionnelle actualisée ou actuelle pour trouver des fonctions enrichies par les DMG CLL (seuls les gènes codant pour les protéines) 14 . REMARQUE: Le regroupement des ensembles de gènes basé sur l&#39;annotation fonctionnelle (GeneSCF) 14 est un outil en temps réel pour l&#39;analyse d&#39;enrichissement fonctionnel qui utilise la KEGG mise à jour et Gene Ontology comme base de données de référence. </li></ol> 9. Méthode d&#39;analyse de bioinformatique 2: identification de CLL-associée significativement DiffDe manière générale des régions méthylées (clD sigDMR) <ol><li> Suivez les étapes 8.1-8.5 de la méthode I (section 8) et utilisez l&#39;analyse d&#39;enrichissement différentiel basé sur le compte de lecture en utilisant les outils disponibles, tel qu&#39;élaboré aux étapes 9.2 à 9.6, pour ajouter un autre niveau de statistiques au pipeline d&#39;analyse. </li><li> Quantifier le nombre de lectures mappées sur les pics individuels ou DMR dans les échantillons de patients normal et CLL en utilisant &quot;featureCounts&quot; du paquet &quot;Subread&quot; 15 . Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam REMARQUE: Un filtre de qualité de cartographie peut être introduit pour éviter de quantifier les lectures de mauvaise qualité ( p. Ex., -Q 30). Pour cette étape, préparez les fichiers SAF pour les DMR obtenus. Pour plus d&#39;informations sur le format de fichier SAF, utilisez ce lien http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. </li><li> Utilisez une table RAW read-count contenant le nombre de lectures pour les pics individuels dans Normal anD groupes d&#39;échantillons de patients CLL dans edgeR comme entrée 16 . REMARQUE: Comparez les groupes d&#39;échantillons de patients normaux versus CLL pour trouver des sigDMR. Pour une analyse d&#39;enrichissement différentiel, suivez le guide de edgeR pour obtenir des instructions détaillées détaillées (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). </li><li> Filtrer les sigDMR à l&#39;aide du taux de découverte fausse (FDR) et du changement de pli de registre prédit par edgeR 16 . </li><li> Annotez les sigDMR prévus à l&#39;aide d&#39;Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; avec l&#39;annotation de transcription Ensembl ou Gencode disponible (transcriptions codant pour les protéines et non codantes). AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &lt;Ensembl ou Gencode GTF&gt; -CpG REMARQUE: cela fournit des informations sur la répartition des pics sur différentes régions génériques ( c.-à-d., Promoteur, exon, intron, UTR 3 &#39;et UTR 5&#39;) et régions intergéniques. Transcriptions ou gènes associés à siLes gDMR sont appelés sigDMGs. </li><li> Utilisez un outil d&#39;enrichissement avec la base de données fonctionnelle actualisée ou actuelle pour trouver des fonctions enrichies par les sigDMG CLL (seuls les gènes codant pour les protéines) 14 . NOTE: GeneSCF, l&#39;un des outils en temps réel pour l&#39;analyse de l&#39;enrichissement fonctionnel, utilise KEGG et Gene Ontology comme bases de données de référence. </li></ol>

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<li>Kopparapu, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-26A1+in+chronic+lymphocytic+leukemia+and+mantle+cell+lymphoma%3A+Impact+on+EZH2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression.</a> Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).</li>
<li>Robinson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+affinity-based+genome-wide+DNA+methylation+data%3A+effects+of+CpG+density%2C+amplification+bias%2C+and+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation.</a> Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

MBD-seq est une technique rentable, basée sur l&#39;immunoprécipitation qui peut être utilisée pour étudier les modèles de méthylation avec une couverture complète du génome. Les deux MeDIP seq (immunoprécipitation de l&#39;ADN méthylé suivi du séquençage) et MBD-seq entraînent l&#39;enrichissement de l&#39;ADN méthylé riche en CpG. Cependant, MBD-seq montre plus d&#39;affinité envers la liaison à des régions riches en CpG par rapport à MeDIP seq 19 . À l&#39;aide d&#39;un kit d&#39;enrichissemen...

L&#39;utilisation de techniques de séquençage de la prochaine génération pour analyser les profils globaux de méthylation de l&#39;ADN a été de plus en plus populaire au cours des dernières années. Des essais de méthylation à l&#39;échelle du génome, y compris les méthodes à base de microarray et de microarray, ont été développés sur la base de ce qui suit: la conversion de bisulfite d&#39;ADN génomique, les digestion enzymes de restriction sensibles à la méthylation et l&#39;immunoprécipitation d&#39;ADN méthylé en utilisant des anticorps spécifiques de méthyle CpG . La méthylation d&#39;ADN aberrante est l&#39;une des caractéristiques de la leucémie et des lymphomes, y compris la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Plus tôt, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont caractérisé les profils de méthylation de l&#39;ADN de différents sous-groupes de pronostic de CLL et des contrôles de cellules B normaux et sains utilisant la conversion de bisulfite d&#39;ADN génomique, suivis de méthodes à base de micro-ensembles ou de séquençage génomique complet 1 , 2 , 3 , &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4. La conversion de bisulfite d&#39;ADN génomique conduit à la désamination des cytosines non modifiées à l&#39;uracile, laissant les cytosines méthylées modifiées dans le génome. Une fois converti, l&#39;état de méthylation de l&#39;ADN peut être déterminé par amplification et séquençage par PCR en utilisant différentes méthodes quantitatives ou qualitatives, telles que le séquençage de bisulfites à base de micro-ensembles ou de génome entier (WGBS). Bien que les méthodes basées sur la conversion du bisulfite présentent de nombreux avantages et sont largement utilisées dans différents types de cancer pour analyser les niveaux de méthylation de l&#39;ADN, il existe quelques inconvénients associés à cette technique. Le séquençage WGBS permet une résolution par paire unique avec des quantités inférieures d&#39;ADN et est l&#39;option la mieux adaptée pour analyser un grand nombre d&#39;échantillons. Cependant, cette méthode ne parvient pas à différencier les modifications entre les niveaux 5 mC et 5 hmC dans le génome 5 , 6 . En outre, les méthodes basées sur les microarray n&#39;offrent pas complète cExcès de génome. Dans une étude récente de notre laboratoire 7 , les méthodes basées sur l&#39;immunoprécipitation, plutôt que la conversion des bisulfites, ont été utilisées pour identifier des régions hautement riches en CpG, différentiellement méthylées à l&#39;échelle mondiale chez des patients CLL et des témoins sains normaux. Le séquençage de prochaine génération (MBD-seq) du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD), l&#39;enrichissement de l&#39;ADN fragmenté double brin dépend du degré de méthylation du CpG. Ce procédé peut surmonter les inconvénients du procédé de conversion du bisulfite et peut également fournir une couverture de la méthylisation du CpG à l&#39;échelle du génome de manière indépendante et indépendante de la PCR. De plus, contrairement aux méthodes de microarray basées sur la conversion au bisulfite, MBD-seq peut être utilisé pour analyser l&#39;état de méthylation des éléments répétitifs, tels que les longs éléments nucléaires entremêlés (LINE), les éléments nucléaires intermédiaires courts (SINE), les répétitions terminales longues (LTRS) Etc. Cependant, par rapport aux méthodes de conversion des bisulfites,Un protocole MBD-seq nécessite une quantité relativement importante d&#39;ADN d&#39;entrée. En outre, la qualité des lectures séquentielles et les données dépendent de la spécificité, de l&#39;affinité et de la qualité des anticorps utilisés. L&#39;étude actuelle explique un protocole MBD-seq détaillé pour enrichir l&#39;ADN méthylé pour le séquençage de la prochaine génération. Il utilise un kit commercial d&#39;enrichissement en liaison d&#39;ADN méthylé (répertorié dans la table Matériaux ), ainsi qu&#39;un pipeline informatique pour visualiser et interpréter les données de séquençage de la méthylation afin d&#39;identifier les régions hyper-hypométhylées spécifiques de CLL par rapport aux témoins sains normaux. Fondamentalement, cette méthode utilise la capacité de la MBD de l&#39;interaction de la protéine MBD2 humaine avec les CpG méthylées pour extraire l&#39;ADN enrichi en CpG méthylées, ce qui est suivi du séquençage à haut débit de l&#39;ADN méthylé.

<table><tbody><tr><td>Dneasy Kit sang et tissus</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep solution</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor appareil de sonication standard</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubes bioruptor TPX 1.5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acétate de sodium</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase safe imager combo kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2 % Gels d’agarose</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Kit d’enrichissement d’ADN méthylé</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Tube Shaker/Rotators</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanool</td><td>Toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse free water</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Précipitant d’ADN (acétate de sodium 3M)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Safe seal Tubes eppendorf 1,5 mL Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0,5 mL tubes</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme Illumina Hiseq2000 Illumina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&nbsp ; Bain</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloc de chaleur</td><td>Rotation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de tube</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse approfondie de la méthylation d&#39;adn en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-cpg dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Le rôle des ARN non codants longs (lncRNAs) dans le cancer est à l&#39;avant-garde en raison de l&#39;intérêt croissant pour la compréhension de leurs fonctions mécanistes pendant le développement et la progression du cancer. Malgré cela, la régulation épigénétique globale des ARNnc et des séquences répétitives dans le cancer n&#39;a pas été bien étudiée, en particulier dans la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Cette étude se concentre sur une approche unique: la capture à base d&#39;immunoprécipitation de fragments d&#39;ADN méthylés à double brin en utilisant des protéines de liaison au méthyl-liaison (MBD), suivi du séquençage de la prochaine génération (MBD-seq). Des échantillons de patients CLL appartenant à deux sous-groupes pronostiques (5 échantillons mutés IGVH + 5 échantillons non mutés IGVH) ont été utilisés dans cette étude. L&#39;analyse a révélé 5 800 hyperméthylés et 12 570 gènes méthylés différentiellement spécifiques de CLL hypométhylés (cllDMGs) par rapport aux témoins sains normaux. Il est important de noter que ces résultats ont identifié plusieurs ARNc linéaires différenciés par CLL, différentiellement méthylés.Des éléments pétitionnels et des gènes codant pour des protéines ayant une valeur pronostique potentielle. Ce travail décrit un protocole détaillé pour un pipeline MBD-seq et bioinformatique développé pour l&#39;analyse complète des profils globaux de méthylation dans des régions riches en CpG utilisant des échantillons de patients CLL. Enfin, un gène codant pour la protéine et un ARNmc ont été validés en utilisant le pyrosequencing, qui est une méthode hautement quantitative pour analyser les niveaux de méthylisation du CpG afin de corroborer davantage les résultats du protocole MBD-seq.

MBD-seq a récemment été réalisé sur des patients atteints de CLL et des témoins adaptés, normaux et sains pour identifier les gènes différentiellement hyper-hypométhylés spécifiques de CLL 7 . Le pipeline expérimental et bioinformatique utilisé pour analyser les données générées à partir de CLL et des échantillons sains normaux sont présentés à la figure 1A et 1B . Ces analyses ont identifié plusieurs régions méthylée...

Ce travail décrit un protocole de séquençage optimisé du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD) et une canalisation de calcul pour identifier des régions riches en CpG différentiellement méthylées chez les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (CLL).

Analyse approfondie de la méthylation d&#39;ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le profilage global de la méthylation et d'identifier les régions riches en CpG différentiellement méthylées chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique à l'aide du séquençage de nouvelle génération. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'épigénétique, telles que l'identification de gènes-signatures spécifiques du CLL impliqués dans la pathogenèse de la maladie et son pronostic. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre une couverture complète et exhaustive de la méthylation des CpG sur l'ensemble du génome, de manière impartiale et indépendante de la PCR.Pour commencer, utilisez un kit d'extraction d'ADN disponible dans le commerce pour isoler l'ADN génomique à partir des échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique du patient et d'un sujet normal, conformément au protocole du fabricant. Après avoir quantifié l'ADN génomique comme décrit dans le protocole écrit, diluez 5 microgrammes d'ADN génomique provenant de chaque échantillon jusqu'à un volume total de 200 microlitres à l'aide de tampon TE, afin d'obtenir une concentration finale de 25 nanogrammes par microlitre. Ensuite, effectuez la sonication dans des tubes spécialement conçus, à l'aide d'un sonicateur, pendant un total de 30 cycles de 30 secondes d'activation suivies de 30 secondes de pause.Après chaque série de cinq cycles, faire une courte centrifugation pour ramener les échantillons au fond des tubes. Vérifier l'étendue de la sonication pour tous les échantillons par électrophorèse de l'ADN, comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les billes magnétiques de streptavidine, les resuspendre d'abord à partir du tube stock fourni avec le kit.Agiter doucement les billes de haut en bas afin d'obtenir une suspension homogène. Pour chaque cinq microgrammes d'échantillon d'ADN fragmenté, placer 50 microlitres des billes dans des tubes de 1,5 millilitre séparés, propres et étiquetés. Ajouter 50 microlitres de tampon de lavage de billes à 1X pour atteindre un volume final de 100 microlitres.Placer les tubes sur un support magnétique pendant une minute afin que toutes les billes magnétiques s'accumulent sur la paroi interne du tube tournée vers l'aimant. Éliminer le liquide sans toucher les billes, à l'aide d'une pipette de 200 microlitres. Ensuite, retirer les tubes du support magnétique, ajouter 250 microlitres de tampon de lavage de billes à 1X et mélanger délicatement les billes avec une pipette.Après avoir répété ces étapes au moins quatre fois pour tous les échantillons, resuspendre finalement les échantillons dans 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X. Garder les échantillons sur de la glace. Pour lier la protéine MBD-biotine aux billes lavées, ajouter d'abord 35 microlitres de protéine à des tubes séparés et porter le volume total à 250 microlitres à l'aide de tampon de lavage de billes 1X.Ajouter 250 microlitres de protéine MBD diluée aux 250 microlitres de billes lavées et laisser tourner lentement bout à bout à température ambiante. Après un mélange des billes dans la protéine pendant une heure, laver les billes magnétiques streptavidine liées à la protéine en plaçant les tubes sur le support magnétique pendant une minute. Retirer le liquide sans toucher les billes à l’aide d’une pipette.Ensuite, ajouter 250 microlitres de tampon de lavage de billes 1X et placer les tubes sur un mélangeur rotatif pendant cinq minutes à température ambiante. Répéter l'étape de lavage deux fois supplémentaires avant de re-suspendre les billes MBD-biotine lavées dans 200 microlitres de tampon de lavage de billes 1X, afin de préparer les billes pour la capture de l'ADN méthylé. Dans un tube propre de 1,5 millilitre exempt de DNase, ajouter 100 microlitres de tampon de lavage de billes par millilitre et 180 microlitres d'ADN génomique fragmenté.Amener le volume final à 500 microlitres à l'aide d'eau sans DNase. Ajouter 380 microlitres d'eau sans DNase aux 20 litres restants d'ADN génomique fragmenté. Congeler les échantillons pour les traiter ultérieurement et les utiliser comme témoins d'ADN d'entrée.Placez les tubes contenant les billes MBD-biotine lavées sur un support magnétique pendant une minute, puis retirez le liquide sans perturber les billes. Ajoutez ensuite 500 microlitres d'ADN génomique fragmenté dilué dans du tampon de lavage pour billes. Scellez hermétiquement tous les tubes avec un film de paraffine et laissez-les toute la nuit à 4 degrés Celsius sur un agitateur rotatif à rotation continue, à 8 à 10 rotations par minute.Après la réaction de liaison de l'ADN aux billes MBD, placer les tubes sur le support magnétique pendant une minute afin de concentrer toutes les billes sur la paroi interne du tube. Retirer le liquide surnageant à l’aide d’une pipette sans toucher les billes, et conserver cette fraction d’échantillon d’ADN non lié sur de la glace. Ensuite, ajouter 200 microlitres de tampon de lavage des billes 1X aux billes et placer les tubes sur le support rotatif pendant trois minutes à température ambiante.Après avoir éliminé le liquide à l’aide du support magnétique, répétez le lavage deux fois supplémentaires afin d’éliminer l’ADN non lié résiduel. Après le dernier lavage, ajoutez 200 microlitres de tampon de désorption à haute teneur en sels fourni dans le kit pour éluer l’ADN. Ensuite, placez les tubes sur le support rotatif pendant 15 minutes à température ambiante.Après l'incubation, placez-les sur le support magnétique pendant une minute et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d'élution à haute teneur en sel sur les billes, puis répétez l'élution en faisant tourner les tubes à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaires. Ajoutez le deuxième éluat au même tube contenant les 200 microlitres du premier éluat.Pour précipiter l'ADN, ajouter un microlitre de glycogène, 40 microlitres d'acétate de sodium trois molaire, pH 5,2, et 800 microlitres d'éthanol absolu glacé à 400 microlitres d'ADN éluté. Ajouter également les réactifs aux échantillons témoins d'ADN d'entrée précédemment congelés de 400 microlitres. Mélanger soigneusement les tubes par vortexage avant de les incuber à moins 80 degrés Celsius pendant toute la nuit.Le lendemain, centrifuger les tubes à 12 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Éliminer soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Ensuite, ajouter 500 microlitres d'éthanol à 70 % et mélanger les tubes au vortex.Après une nouvelle centrifugation des tubes dans les mêmes conditions, mais pendant 15 minutes, éliminer le surnageant en utilisant soigneusement une pipette. Ensuite, centrifuger les tubes à vitesse maximale pendant une minute à température ambiante, puis éliminer complètement l'éthanol résiduel à l'aide d'une pointe de pipette. Laisser sécher le culot à l'air pendant cinq minutes à température ambiante.Enfin, ajoutez 10 microlitres d'eau sans DNase au culot d'ADN avant de procéder à la quantification de l'ADN méthylé, au séquençage MBD et à l'analyse, comme décrit dans le protocole écrit. L'analyse a identifié plusieurs régions différentiellement hyper- et hypométhylées enrichies dans les échantillons de LMC par rapport aux témoins normaux. Ces régions différentiellement méthylées ont été cartographiées sur différentes classes de gènes codant des protéines et de gènes non codants.Enfin, l'analyse des données a révélé un recouvrement significatif entre les régions différentiellement méthylées associées à la LLC, obtenues à partir de deux comparaisons différentes avec des échantillons témoins normaux. Ici, tous les sites CpG situés dans les régions cibles de deux gènes différentiellement méthylés ont été validés dans un grand nombre d'échantillons de LLC par pyroséquençage. La plage optimale de sonication requise pour cette méthode est illustrée ici.Ce spectre d'ADN fragmenté est idéal et plus adapté aux fins de séquençage de nouvelle génération. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, les facteurs cruciaux qui influencent la récupération finale de l'ADN sont la qualité et la quantité d'ADN d'entrée utilisées, ainsi que le spectre de l'ADN fragmenté après sonication.Nous avons choisi d'utiliser cette méthode car il s'agit de la première étude globale de méthylation de la LMC basée sur l'immunoprécipitation pour enrichir l'ADN méthylé couvrant toutes les régions méthylées à travers le génome. Les implications de cette technique s'étendent à la fois vers le pronostic et le traitement, car les gènes de signature différemment méthylés identifiés pourraient servir de biomarqueurs normaux globaux et de cibles épigénétiques pour la thérapie. Après cette procédure, l'ADN méthylé enrichi peut être utilisé pour d'autres applications en aval, telles que l'hybridation ou la réalisation de puces à ADN, permettant ainsi de comparer facilement les méthylomes entre deux échantillons ou entités pathologiques à l'aide d'un ensemble fixe de sites CpG présents sur les puces.Enfin, il s'agit d'une technique rentable permettant d'analyser un grand nombre d'échantillons de patients pour détecter des séquences méthylées à travers le génome, y compris des séquences annotées couvrant les gènes codant pour des protéines ainsi que des séquences non annotées couvrant des éléments répétitifs et des ARN non codants longs.

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Genetics

Génétique

L'étalon-or pour l'analyse de la méthylation de l'ADN est le séquençage génomique de l'ADN au bisulfite convertis. Cette méthode tire parti de la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à 5-méthylcytosine (5-MeC) au bisulfite désamination dans des conditions acides. Cytosines non méthylées peuvent être distingués des cytosines méthylées après amplification par PCR de l'ADN génomique cible.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Cette vidéo présente la technique d’amplification en chaîne par polymérase multiplex pour la quantification simultanée de régions d’ADN méthylées dans différentes populations de globules blancs en tant que biomarqueur précoce pour le diagnostic clinique et le pronostic.

Réaction en chaîne par polymérase multiplex pour détecter la méthylation de l’ADN dans les leucocytes

Le séquençage au bisulfite amélioré est une méthode de préparation de banques de séquençage pour l’analyse de la méthylation de l’ADN basée sur la digestion enzymatique de restriction combinée à la conversion de la cytosine au bisulfite. Ce protocole nécessite 50 ng de matériel de départ et fournit des données de résolution de paires de bases dans des régions génomiques riches en GC.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

Décrit ici est l'utilisation d'une méthode d'amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L'ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.

Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

Ici, nous décrivons une procédure pour l’analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans les cancers gastro-intestinaux. La procédure est pertinente pour les études qui étudient les relations entre les modèles de méthylation des gènes et les facteurs contribuant à la carcinogenèse dans les cancers gastro-intestinaux.

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Analyse approfondie de la méthylation dADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

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