Modèle murin d'MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

L'objectif général de cette procédure est de simuler un accident vasculaire cérébral ischémique chez la souris. Tout d'abord, l'artère carotide commune est ligaturée temporairement, tandis que l'artère carotide externe est ligaturée de manière permanente le plus distalement possible. Un autre point de suture temporaire, légèrement serré, est placé sur l'ACE au-dessus de la bifurcation.

La deuxième étape consiste à pincer l'artère carotide interne à l'aide de pinces à action inversée afin d'éviter tout saignement. Ensuite, sectionner l'ECA entre les ligatures permanente et temporaire. Puis, introduire le monofilament revêtu de silicone dans l'ECA.

Ensuite, l'ECA est inversée pour introduire le monofilament dans l'ICA jusqu'à ce qu'il atteigne la base de l'artère cérébrale moyenne. Une heure plus tard, le flux sanguin est rétabli par retrait du monofilament, ce qui imite la restauration du flux sanguin après la lyse d'un caillot thromboembolique chez l'humain. Enfin, le déficit neurologique, qui reflète la réussite de la T-M-C-A-O et la gravité de l'infarctus, peut être évalué juste après la reperfusion et à différents moments suivant la reperfusion.

Le logiciel Cyan de l'Institut National de la Santé (NIH) est utilisé pour calculer le volume d'infarctus sur des tranches cérébrales représentatives colorées au violet de crésyl. L'un des principaux avantages de l'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne par la technique du filament intraluminal est qu'elle imite l'accident vasculaire cérébral ischémique chez le patient, avec la restauration du flux sanguin, et le développement de cette procédure chez la souris offre la possibilité d'utiliser des outils génétiques marqués pour identifier le rôle d'une protéine cible. L'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne est réalisée sur des souris mâles C57BL/6 âgées de deux à trois mois et pesant entre 22 et 28 grammes.

Ce protocole a été approuvé par le Comité d'éthique en biosanté de l'IRCM afin d'améliorer la reproductibilité du volume d'infarctus. Nous utilisons un monofilament réutilisable de 12 millimètres de long, en silicone de six ohms, provenant de la société Doco Corporation. Deux heures avant la chirurgie.

Injecter une souris par voie intrapéritonéale de buprénorphine à une dose de 0,03 milligrammes par kilogramme. Pour commencer la procédure, anesthésier les souris avec 5 % d'isoflurane et maintenir l'anesthésie à 2,5 % d'isoflurane, utiliser un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris constante pendant la chirurgie, désinfecter la peau du flanc de la souris avec de l'éthanol à 70 % ou du Bétadine. Ensuite, pratiquer une incision médiane au niveau du cou et écarter les tissus mous sous un microscope stéréo.

Disséquez grossièrement le cou de la souris afin d'exposer la trachée. Ensuite, rétractez les muscles pour localiser l'artère carotide. Disséquez soigneusement l'artère carotide commune gauche des tissus environnants.

Placer une suture temporaire en soie de cinq ohms, coupée en segments de 20 millimètres, autour de l'artère. Prendre soin de ne pas endommager le nerf vague. Ensuite, séparer la bifurcation de l'artère carotide interne gauche ou ICA et de l'artère carotide externe commune ou ECA, puis placer une suture permanente autour de l'ECA le plus distalement possible.

Et un autre point de suture temporaire sur l'ECA au-dessus de la bifurcation. Ensuite, clipper l'artère carotide interne gauche à l'aide de pinces à action inversée afin d'éviter tout saignement. Là encore, veiller très attentivement à ne pas endommager le nerf vague.

Coupez un petit trou dans l'artère carotide externe (ECA) avant la bifurcation de l'ECA et de l'artère carotide interne (ICA), entre les points de suture permanents et temporaires placés précédemment. Ensuite, introduisez un fil de suture monofilament en silicone de 12 millimètres de six oh dans l'ECA, sectionnez complètement l'ECA, puis renversez le monofilament dans l'ICA. Serrez fermement la suture pour éviter tout saignement, puis retirez la pince à action inversée.

Ensuite, introduire le monofilament dans le cercle de Willis jusqu'à ce que celui-ci obstrue la base de l'artère cérébrale moyenne. Son insertion doit être d'environ neuf à dix millimètres au-delà de la bifurcation de l'artère carotide externe et de l'artère carotide commune. Généralement, le monofilament sera bloqué et ne pourra plus avancer.

Veillez à ne pas pénétrer l'artère tégo-palatine. Faites un nœud solide sur la CIA afin de fixer le filament en place. Fermez maintenant la peau à l'aide d'un système de fermeture de plaie par clips automatiques.

Injecter un millilitre de solution saline par voie sous-cutanée et placer les souris sous une lampe chauffante à infrarouge pendant la période post-occlusion, qui dure 60 minutes. Anesthésier les souris comme précédemment, puis retirer les pinces automatiques et légèrement desserrer la ligature sur l’artère carotide externe afin de permettre le retrait du monofilament et la reperfusion sanguine. Ensuite, ligaturer de façon définitive la ligature temporaire sur l’artère carotide externe pour éviter toute perte de sang.

Une heure après l'accident vasculaire cérébral, retirer le monofilament et le conserver pour une réutilisation ultérieure. Ensuite, retirer la suture temporaire sur l'artère carotide commune afin de permettre la recirculation sanguine. Fermer la plaie et par voie sous-cutanée.

Injecter un autre millilitre de solution saline dans les souris. Une fois que vous vous êtes assuré que l'animal a retrouvé sa mobilité, remettez-le dans sa cage et placez la moitié de la cage sur le tapis chauffant afin que les souris puissent choisir leur environnement. Douze heures après l'intervention chirurgicale, les souris reçoivent une autre dose de buprénorphine pour toutes les opérations témoins.

Toutes les procédures sont identiques, sauf que le fil monofilament n'est pas inséré après la chirurgie. Le déficit neurologique est évalué afin de confirmer la réussite de la T-M-C-A-O et de déterminer son score d'efficacité, en évaluant les déficits neurologiques des souris à 1, 24, 48 et 72 heures après la perfusion selon une échelle à six points comme suit : zéro égale normal, un égale léger, rotation avec ou sans recroquevillement inconstant lorsqu'on soulève l'animal par la queue. Plus de 50 % des tentatives de recroquevillement vers le côté controlatéral.

Deux correspond à un recourbement léger et constant dans plus de 50 % des tentatives de recourbement vers le côté controlatéral. Trois correspond à un recourbement constant, fort et immédiat. La souris maintient une position recourbée pendant plus d'une à deux secondes.

Avec son museau arrivant presque à sa queue. Quatre égale un enroulement sévère. Une progression menant à une perte du réflexe de marche ou d'écriture, cinq égale coma ou monticule.

Après perfusion avec une solution de PBS, congeler rapidement les cerveaux dans du pentane iso et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Remarque : les cerveaux de souris peuvent également être perfusés avec du paraformaldéhyde à 4 % selon les études d'immunohistochimie prévues. Ensuite, utiliser un cryostat pour découper des sections coronales du cerveau de 17 µm en utilisant 30 lames.

Placer une section sur trente sur la même lame. Ensuite, colorer les première et quinzième lames au violet de crésyl. Pour une estimation plus précise du volume de la lésion, utiliser un système d'analyse d'image tel que Scion Image du NIH afin d'évaluer le delimitation de la lésion, la zone d'infarctus qui apparaît en blanc dans les hémisphères cérébraux gauche et droit.

Répétez cette limitation D sur toutes les tranches cérébrales. Calculez le volume de l'infarctus en unités arbitraires et exprimez-le en pourcentage de la zone controlatérale non lésée pour chaque section. Conservez les autres lames à moins 80 degrés Celsius pour des études d'immunohistochimie.

L'évaluation du score neurologique confirme la réussite de la T-M-C-A-O chez mes sujets soumis à la procédure intraluminale. Comme on le voit ici, un enrouement marqué, fort et intermédiaire est observé, et la souris maintient une posture enroulée pendant plus d'une à deux secondes, son nez atteignant presque sa queue. Dans notre expérience, toutes les souris présentaient au moins un enrouement léger mais constant, ce qui correspond à un score neurologique de deux pendant toute la durée du test.

La coloration au violet de Kressel a été réalisée afin d'évaluer l'importance de l'infarctus cérébral. Après l'occlusion artérielle cérébrale moyenne transitoire (T-M-C-A-O) illustrée ici, une section coronaire représentative du cerveau de souris colorée au violet de crête après 72 heures de reperfusion est présentée. La zone d'infarctus, principalement le striatum, le cortex et les régions cérébrales adjacentes, qui sont indiquées, apparaît en blanc car elle n'est pas colorée par le violet de crête.

Le violet indiqué ici correspond au volume lésionnel, qui est la partie blanche de l'hémisphère droit exprimée en pourcentage de la zone non lésée homologue située dans l'hémisphère gauche. Le volume d'infarctus chez les souris mâles C57BL/6 après un accident vasculaire cérébral ischémique représente environ 70 % de l'hémisphère non lésé. Cette procédure assure une forte reproductibilité de la lésion.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire un accident ischémique transitoire chez la souris. En outre, l'approche par coloration au violet de crésyl permet de mesurer le volume d'infarctus cérébral et vous offre l'avantage considérable de disposer de nombreux échantillons pour tester des marqueurs pertinents par immunohistochimie. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.