Name: Modèle murin dMCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez le modèle d'occlusion cérébrale intraluminale chez la souris pour étudier l'accident vasculaire cérébral ischémique. Cette méthode permet d'évaluer les déficits neurologiques et le volume de l'infarctus par coloration au violet de crésyl.

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Cette étude a été financée par une subvention d&#39;équipe des IRSC CTP # 82946, une subvention des IRSC # 102741 MOP, ainsi que d&#39;une chaise # 216684 Canada et la Fondation Strauss. ER a été soutenue par une bourse de recherche du cœur du Canada et la Fondation des maladies.

Occlusion transitoire Artère cérébrale moyenne (MCAO) 1. Procédure chirurgie (Figure 1) Occlusion transitoire de l&#39;artère cérébrale moyenne (tMCAO) est réalisée sur 2 - à 3 mois mâle C57BL / 6 souris (22-28g). Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux de bioéthique de l&#39;IRCM comité. Outils chirurgicaux sont stérilisés par autoclavage (121 ° C à 15 psi pendant 60 minutes). Entre chaque animal, ils ont été stérilisés à l&#39;aide de la chaude stérilisateur à billes (15 sec). Table d&#39;opération et d&#39;autres équipements sont désinfectés à l&#39;aide d&#39;éthanol à 70%. Deux heures avant la chirurgie, les souris ont été analgesized avec la buprénorphine (0,03 mg / kg BWIP). Figure 1A. <ol><li> Profondément anesthésier les souris avec l&#39;isoflurane 5%, puis de maintenir l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane 2,5%. Température corporelle des souris est maintenue constante au cours de la chirurgie avec un coussin chauffant. </li><li> Désinfecter la fourrure et skdans l&#39;éthanol à 70% ou Betadine. Depuis rasage produit fragment communiqué cheveux, microabrasions et l&#39;inflammation qui peut avoir une incidence sur la physiopathologie course, nous n&#39;avons pas raser la fourrure de la souris. </li><li> Faire une incision médiane du cou et tirez doucement en dehors des tissus mous. </li><li> Sous un microscope stéréo (Stemi 2000, Zeiss), une dissection est réalisée afin d&#39;exposer la trachée et de rétracter les muscles pour localiser l&#39;artère carotide. </li><li> L&#39;artère carotide commune gauche (CCA) est soigneusement disséquée des tissus environnants et le CCA est temporairement fermé par une suture temporaire (1) en utilisant une suture de soie 5-0 coupé en 20 segments mm. Un grand soin doit être exercé pour ne pas nuire au nerf vagal. </li><li> Séparer la bifurcation de l&#39;artère carotide interne gauche commune (ICA) et externe artère carotide commune (CEA). Suture permanent (2) est placé autour de l&#39;ECA, comme distalement que possible, et un autre fil de suture temporaire légèrement serré (3) est placé sur le CEA distale de l&#39;bifurcation. </li><li> Fixez le gauche ICA (4) à l&#39;aide d&#39;une pincette inverse d&#39;action pour éviter les saignements. Un grand soin doit être exercé pour ne pas nuire au nerf vagal. </li><li> Découpez un petit trou dans la CEA (5) entre permanents (2) et temporaires (3) points de suture. </li></ol> Figure 1B. <ol start="9"><li> Introduire un 12 mm de long 6-0 siliconé (environ 9-10mm est revêtue de silicium) suture monofilament (Doccol Corporation) dans le CEA (6), couper complètement le CEA distale de la suture permanente et inverser le dispositif d&#39;occlusion dans la LSA . La suture est étroitement lié autour du monofilament pour prévenir les saignements et les pinces inverse d&#39;action sont supprimés. </li><li> L&#39;obturateur est introduit pour obturer l&#39;origine de la MCA dans le cercle de Willis. Arrêter son insertion autour de 9-10 mm au-delà de la bifurcation de la CEA et de l&#39;ACC. L&#39;obturateur est bloqué et ne peut plus bouger. Il faut prendre soin de ne pas pénétrer dans l&#39;artère ptérygopalatine. La suture (3) sur le CEA est tightly liée à fixer le monofilament en position. </li><li> Fermer la peau avec un système de fermeture Autoclip plaie. </li><li> Injecter 1 ml de solution saline sous-cutanée et placez la souris sous une lampe à infrarouge de chauffage pendant toute la période post-occlusion (60 min). </li></ol> 2. Restauration du Moyen débit sanguin cérébral Artère Avant reanesthesia, le neuroscore peut être vérifiée pour évaluer le succès de la chirurgie. <ol><li> Anesthésier les souris comme décrit précédemment et enlever les autoclips. </li><li> Ouvrir légèrement la suture (3) sur la CEA pour permettre le retrait monofilament et la reperfusion sanguine. </li><li> Permanente attacher le fil de suture temporaire sur le CEA pour éviter la perte de sang. Le monofilament est conservé pour être réutilisé. </li><li> Retirez la suture temporaire (1) sur le CCA pour permettre la recirculation du sang. </li><li> Fermer la plaie. Les souris doivent recevoir une autre solution saline sous-cutanée de 1 ml. </li><li> Placez la souris sous la lampe chauffante infrarouge pendant 1 heure. Après avoir vérifié que l&#39;animal ne reprenne la mobilité, la souris est ramené à sa cage et à gauche sous le coussin chauffant et serviettes pour 72 heures. Notez que seule la moitié de la cage est placée sur le coussin chauffant pour permettre souris pour choisir leur environnement. Parce que la perte de poids post-opératoire est généralement observé, de la nourriture en purée est placé dans une boîte de Pétri pour l&#39;encourager à manger. Douze heures après la chirurgie, les souris ont reçu une dose de buprénorphine (0,03 mg / kg BWIP). </li></ol> 3. Opération Sham Pour les opérations fictives, toutes les procédures sont identiques, sauf que l&#39;obturateur n&#39;est pas insérée. 4. Neuroscore Les déficits neurologiques permettre l&#39;évaluation de la réussite de tMCAO juste après la reperfusion et plus tard l&#39;estimation du degré de gravité de la blessure. Les déficits neurologiques sont marqués comme précédemment décrit 5 &lt;/ Sup&gt; et effectuée à 1, 24, 48 et 72 heures après la reperfusion. Un élargissement échelle de six points est utilisé: <ul><li> 0: normal. </li><li> 1: légère encerclant le comportement avec ou sans rotation incompatibles quand ramassé par la queue, &lt;50% des tentatives pour faire pivoter vers le côté controlatéral. </li><li> 2: légère cohérente encerclant,&gt; 50% des tentatives pour faire pivoter vers le côté controlatéral. </li><li> 3: conforme forte et immédiate encerclant, la souris occupe une position de rotation pour plus de 1-2 secondes, avec son nez presque atteint sa queue. </li><li> 4: rotation sévère progresse en barrique, la perte de la marche ou réflexe de redressement. </li><li> 5: comateux ou moribond. </li></ul> 5. La coloration crésyl violet (figure 2) Après perfusion solution de PBS, les cerveaux sont rapidement congelés dans l&#39;isopentane et conservés à -80 °C. cerveaux de souris peut également être perfusés avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) selon les études immunohistochimiques prévues. Cryostat les coupes coronales de coupes de cerveau (17 um) sont effectuées. Une partie de chaque 30 est collecté sur la même lame pour avoir une blessure cérébrale représentant. Pour la quantification du volume, 2 lames sont colorées par coloration au violet de crésyl et un système d&#39;analyse d&#39;image (Scion Corporation, Frederick, MD) a été utilisé pour évaluer la lésion. Le volume préjudice a été calculé en unités arbitraires (pixels), et exprimée en pourcentage de l&#39;controlatéral non lésé zone pour chaque section. Autres diapositives sont conservées à -80 ° C pour les études d&#39;immunohistochimie. Alternativement, PFA-fixe cerveau peut être coupé à 30-50 um en utilisant vibratome et le volume de l&#39;infarctus mesurée tel que recommandé par Han et al. (2009) 6.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li>
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<li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li>
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<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas de conflits d&#39;intérêts à déclarer. Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Zeiss, Inc

Différents modèles d&#39;AVC ont été développés pour simuler les conséquences d&#39;AVC chez les patients. Le choix du modèle de course dépend de la question biologique. Le modèle intraluminale MCAO imite l&#39;un des types les plus communs de l&#39;AVC ischémique chez les patients et est moins invasive et plus cohérent que le modèle de Tamura 4,7. C&#39;est un modèle très intéressant pour les analyses de la mort neuroprotection, neurorepair et cellulaire. Le succès du modèle intraluminale dépend de nombreux facteurs tels que le sexe des animaux, l&#39;âge et le poids, la température, l&#39;anesthésie et le moment de la chirurgie, qui doivent être contrôlés. Les propriétés physiques de l&#39;obturateur (diamètre de pointe, la longueur, la forme et la fexibilité) sont essentielles à la cohérence de la MCAO 4. Ici, nous utilisons le long de 12 mm 6-0 monofilament revêtu de silicium sur 9-10 mm de Doccol Corporation. Le grand avantage de ce monofilament est de réduire les hémorragies sous-arachnoïdiennes et parce que sa longueur couvrait tout l&#39;ICAlongueur, le débit sanguin résiduel qui provient des artères communicantes antérieure et postérieure du cercle de Willis et PPA, est empêchée et la variabilité des baisses des volumes d&#39;infarctus (15% de la variabilité dans nos mains) 8. Le fil de suture de la DPA diminue également la variabilité du volume d&#39;infarctus 9. L&#39;étendue de la lésion cérébrale qui suit tMCAO peut être évaluée de différentes façons. Les déficits neurologiques peuvent être mesurés comme précédemment mentionné. Cependant, il est difficile d&#39;avoir une mesure efficace de cette façon. L&#39;étendue de l&#39;infarctus est généralement effectuée par coloration TTC. Plus récemment, des techniques de résonance magnétique sont également utilisés, une technologie particulièrement intéressante pour les traitements neuroprotecteurs. Pour comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents impliqués dans la course comme neurorepair, la mort cellulaire ou la prolifération cellulaire, l&#39;étude de différents marqueurs par immunohistochimie est essentiel et très instructif. Ainsi, notre protocol de préparations section du cerveau a le grand avantage de permettre à ces analyses, et réduit le nombre de souris utilisées. En outre, Tureyen et al. 10 ont signalé qu&#39;il existe une bonne corrélation entre les taches violet de crésyl et TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Description</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscope stéréoscopique</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibre-Light Illuminator à haute intensité</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdSystème d&#39;anesthésie&gt; pour l&#39;isoflurane</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L&#39;isoflurane</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdCouverture chauffante&gt;</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lampe de chauffage infrarouge</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra fine pince à épiler, style 5</td&gt;<td&gt; Sciences microscopie électronique</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ciseaux Vannas 3 Bord de coupe mm, droite</td&gt;<td&gt; Sciences microscopie électronique</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Style de LA-1 et MPF-1 Toutes les lames lisses</td&gt;<td&gt; Sciences microscopie électronique</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pincettes action négative, le style KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Sciences microscopie électronique</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissection Ciseaux 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip Kit de démarrage</td&gt;<td&gt; Harvard appareil</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclip plaies Syst clôture., 9mm de long, 100/pqt</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 suture</td&gt;<td&gt; Harvard appareil</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Suture monofilament matériau PDS II violet, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm de long 6-0 suture monofilament siliconé</td&gt;<td&gt; Doccol Corporation</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14 à 823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aiguilles 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; Souris</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

modèle murin d&#39;mcao intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

L&#39;AVC est la troisième cause de mortalité et la première cause d&#39;invalidité dans le monde. Ischémiques comptes course pour environ 80% de tous les AVC. Cependant, le thrombolytique activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est le seul traitement de l&#39;AVC ischémique aigu qui existe. Cela conduit les chercheurs à développer plusieurs modèles d&#39;AVC ischémiques dans une grande variété d&#39;espèces. Deux grands types de modèles de rongeurs ont été développés: des modèles d&#39;ischémie cérébrale globale ou une ischémie cérébrale focale. Pour simuler un accident ischémique cérébral chez les patients chez lesquels environ 80% thromboses ou embolique se produire sur le territoire de l&#39;artère cérébrale moyenne (ACM), l&#39;occlusion intraluminale de l&#39;artère cérébrale moyenne (MCAO) modèle est tout à fait pertinent pour les études de temps. Ce modèle a été développé chez le rat par Koizumi et al., En 1986 1. En raison de la facilité de manipulation génétique chez la souris, ces modèles ont été développés dans ce 2-3 espèces. contenu &quot;&gt; Ici, nous présentons le MCA transitoire occlusion procédure C57/BL6 souris. études antérieures ont rapporté que les propriétés physiques de l&#39;occlusion tels que diamètre de la pointe, la longueur, la forme et la flexibilité sont essentiels pour la reproductibilité du volume de l&#39;infarctus 4. Ici, un monofilaments de silicium commerciaux revêtus (Doccol Corporation) ont été utilisés. Un autre grand avantage est que ce monofilament réduit le risque d&#39;induire des hémorragies sous-arachnoïdiennes. Utilisation du stéréomicroscope Zeiss Stemi 2000, le silicium monofilament revêtu a été introduit dans l&#39;artère carotide interne (ACI) via une réduction de l&#39;artère carotide externe (CEA) jusqu&#39;à ce que le monofilament obture la base de la MCA. flux sanguin a été restaurée 1 heure plus tard par l&#39;élimination du monofilament pour imiter la restauration du flux sanguin après lyse d&#39;un caillot dans thromboembolique humains. L&#39;étendue de l&#39;infarctus cérébral peut être évalué par une première partition neurologiques et par la mesure du volume de l&#39;infarctus.Souris ischémiques ont ainsi été analysés pour leur score neurologique à différents post-reperfusion fois. Pour évaluer le volume de l&#39;infarctus, coloration avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) était habituellement réalisée. Ici, nous avons utilisé une coloration violet de crésyl, car il offre la possibilité de tester de nombreux marqueurs essentiels par immunohistochimie. Dans cette vidéo, nous présentons la procédure MCAO; scores neurologiques et l&#39;évaluation du volume de l&#39;infarctus par coloration au violet de crésyl.

L&#39;évaluation neuroscore confirme le succès de tMCAO post-AVC et détermine l&#39;efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Dans nos mains, toutes les souris soumises à la procédure intraluminale présenté au moins une légère curling cohérente (neuroscore 2) et les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu&#39;à 72 heures. La plupart des souris présentent une légère curling cohérente (neuroscore 2). Souris présentant absence de curling sont exclus de l&#39;étude. Cependant, l&#39;évaluation neuroscore ne nous permet pas de faire la distinction entre les souris avec un hippocampe blessés et ceux qui ont un hippocampe intact. Aucune mortalité n&#39;a été observée au cours de la chirurgie d&#39;un jour, ce qui suggère que les hémorragies sous-arachnoïdiennes n&#39;a pas eu lieu. Lorsque hémorragie sous-arachnoïdienne est identifié dans une souris, celle-ci est systématiquement exclus de l&#39;analyse. L&#39;utilisation du silicium revêtu de monofilament de Doccol Corporation, qui est plus lisse que préparés à la maison monofilaments, augmente le succès detMCAO et réduit les hémorragies sous-arachnoïdiennes. Mortalité entre 24 h et 72 h est de 14% dans ce modèle, comme c&#39;est généralement rapportés pour 60 min d&#39;occlusion. La mortalité observée est probablement due à un volume de l&#39;infarctus important dans cette souche de souris. Une forte reproductibilité lésion a également été observée (écart-type est de 15%), ce qui est très intéressant pour étudier les molécules neuroprotectrices où leur effet (s) peuvent être dissimulés par la variabilité du modèle. Pour évaluer l&#39;étendue des lésions cérébrales à la suite tMCAO, nous avons opté d&#39;utiliser une coloration violet de crésyl (figure 2) plutôt que TTC afin d&#39;avoir une grande quantité de matériel à tester des marqueurs pertinents 6. L&#39;étendue de la lésion est relativement uniforme. Cependant, nous avons remarqué que chez certaines souris, l&#39;hippocampe a été blessé (environ 30% des souris). Il est intéressant de noter que la coloration crésyl violet peut être appliqué jusqu&#39;à 1 semaine plus tard. Dans la littérature, le pourcentage d&#39;infarctus cérébral varie d&#39;unétudier à l&#39;autre. Il dépend du choix de la souche de souris, l&#39;anesthésie, l&#39;épaisseur des coupes de cerveau, le monofilament utilisé, ou la coloration utilisée 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figure 1. Schéma de l&#39;occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne avec siliconé monofilament intraluminale. Un schéma. Simplifié de cerveau de souris et les artères cérébrales montrant sutures successives et le clip de préparer l&#39;introduction de siliconé monofilament. B. La position du monofilament à travers le cercle de Willis est représenté. Le monofilament est introduit dans ICA via la CEA pour occlure la base du MCA ACA, artère cérébrale antérieure;. BA, basilaire artère; CCA, l&#39;artère carotide commune; C. Willis, cercle de Willis; CEA, carotide externe artery, ICA, artère carotide interne; MCA, l&#39;artère cérébrale moyenne, ACP, l&#39;artère communicante postérieure; APP, artère ptérygopalatine. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Représentant des coupes coronales de cerveau de souris colorées au violet de crésyl après 72 heures post-reperfusion. Zone de l&#39;infarctus (principalement le striatum, le cortex et les zones adjacentes du cerveau) apparaît en blanc (non colorées par crésyl violet). Le volume des blessures (partie blanche, l&#39;hémisphère droit) a été délimitée et exprimée en pourcentage de l&#39;controlatéral non lésé zone (hémisphère gauche).

Le modèle de milieu intraluminal occlusion cérébrale chez la souris est présentée ici. L&#39;étendue de l&#39;infarctus cérébral est évaluée par un score neurologique et coloration au violet de crésyl, une alternative à la coloration TTC, offrant le grand avantage de tester en parallèle de nombreux marqueurs d&#39;intérêt.

Modèle murin d&#39;MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

L'accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la troisième cause de mortalité et la principale cause d'invalidité dans le monde. L'AVC ischémique représente environ 80 % de l'ensemble des AVC. ...

L'objectif général de cette procédure est de simuler un accident vasculaire cérébral ischémique chez la souris. Tout d'abord, l'artère carotide commune est ligaturée temporairement, tandis que l'artère carotide externe est ligaturée de manière permanente le plus distalement possible. Un autre point de suture temporaire, légèrement serré, est placé sur l'ACE au-dessus de la bifurcation.La deuxième étape consiste à pincer l'artère carotide interne à l'aide de pinces à action inversée afin d'éviter tout saignement. Ensuite, sectionner l'ECA entre les ligatures permanente et temporaire. Puis, introduire le monofilament revêtu de silicone dans l'ECA.Ensuite, l'ECA est inversée pour introduire le monofilament dans l'ICA jusqu'à ce qu'il atteigne la base de l'artère cérébrale moyenne. Une heure plus tard, le flux sanguin est rétabli par retrait du monofilament, ce qui imite la restauration du flux sanguin après la lyse d'un caillot thromboembolique chez l'humain. Enfin, le déficit neurologique, qui reflète la réussite de la T-M-C-A-O et la gravité de l'infarctus, peut être évalué juste après la reperfusion et à différents moments suivant la reperfusion.Le logiciel Cyan de l'Institut National de la Santé (NIH) est utilisé pour calculer le volume d'infarctus sur des tranches cérébrales représentatives colorées au violet de crésyl. L'un des principaux avantages de l'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne par la technique du filament intraluminal est qu'elle imite l'accident vasculaire cérébral ischémique chez le patient, avec la restauration du flux sanguin, et le développement de cette procédure chez la souris offre la possibilité d'utiliser des outils génétiques marqués pour identifier le rôle d'une protéine cible. L'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne est réalisée sur des souris mâles C57BL/6 âgées de deux à trois mois et pesant entre 22 et 28 grammes.Ce protocole a été approuvé par le Comité d'éthique en biosanté de l'IRCM afin d'améliorer la reproductibilité du volume d'infarctus. Nous utilisons un monofilament réutilisable de 12 millimètres de long, en silicone de six ohms, provenant de la société Doco Corporation. Deux heures avant la chirurgie.Injecter une souris par voie intrapéritonéale de buprénorphine à une dose de 0,03 milligrammes par kilogramme. Pour commencer la procédure, anesthésier les souris avec 5 % d'isoflurane et maintenir l'anesthésie à 2,5 % d'isoflurane, utiliser un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris constante pendant la chirurgie, désinfecter la peau du flanc de la souris avec de l'éthanol à 70 % ou du Bétadine. Ensuite, pratiquer une incision médiane au niveau du cou et écarter les tissus mous sous un microscope stéréo.Disséquez grossièrement le cou de la souris afin d'exposer la trachée. Ensuite, rétractez les muscles pour localiser l'artère carotide. Disséquez soigneusement l'artère carotide commune gauche des tissus environnants.Placer une suture temporaire en soie de cinq ohms, coupée en segments de 20 millimètres, autour de l'artère. Prendre soin de ne pas endommager le nerf vague. Ensuite, séparer la bifurcation de l'artère carotide interne gauche ou ICA et de l'artère carotide externe commune ou ECA, puis placer une suture permanente autour de l'ECA le plus distalement possible.Et un autre point de suture temporaire sur l'ECA au-dessus de la bifurcation. Ensuite, clipper l'artère carotide interne gauche à l'aide de pinces à action inversée afin d'éviter tout saignement. Là encore, veiller très attentivement à ne pas endommager le nerf vague.Coupez un petit trou dans l'artère carotide externe (ECA) avant la bifurcation de l'ECA et de l'artère carotide interne (ICA), entre les points de suture permanents et temporaires placés précédemment. Ensuite, introduisez un fil de suture monofilament en silicone de 12 millimètres de six oh dans l'ECA, sectionnez complètement l'ECA, puis renversez le monofilament dans l'ICA. Serrez fermement la suture pour éviter tout saignement, puis retirez la pince à action inversée.Ensuite, introduire le monofilament dans le cercle de Willis jusqu'à ce que celui-ci obstrue la base de l'artère cérébrale moyenne. Son insertion doit être d'environ neuf à dix millimètres au-delà de la bifurcation de l'artère carotide externe et de l'artère carotide commune. Généralement, le monofilament sera bloqué et ne pourra plus avancer.Veillez à ne pas pénétrer l'artère tégo-palatine. Faites un nœud solide sur la CIA afin de fixer le filament en place. Fermez maintenant la peau à l'aide d'un système de fermeture de plaie par clips automatiques.Injecter un millilitre de solution saline par voie sous-cutanée et placer les souris sous une lampe chauffante à infrarouge pendant la période post-occlusion, qui dure 60 minutes. Anesthésier les souris comme précédemment, puis retirer les pinces automatiques et légèrement desserrer la ligature sur l’artère carotide externe afin de permettre le retrait du monofilament et la reperfusion sanguine. Ensuite, ligaturer de façon définitive la ligature temporaire sur l’artère carotide externe pour éviter toute perte de sang.Une heure après l'accident vasculaire cérébral, retirer le monofilament et le conserver pour une réutilisation ultérieure. Ensuite, retirer la suture temporaire sur l'artère carotide commune afin de permettre la recirculation sanguine. Fermer la plaie et par voie sous-cutanée.Injecter un autre millilitre de solution saline dans les souris. Une fois que vous vous êtes assuré que l'animal a retrouvé sa mobilité, remettez-le dans sa cage et placez la moitié de la cage sur le tapis chauffant afin que les souris puissent choisir leur environnement. Douze heures après l'intervention chirurgicale, les souris reçoivent une autre dose de buprénorphine pour toutes les opérations témoins.Toutes les procédures sont identiques, sauf que le fil monofilament n'est pas inséré après la chirurgie. Le déficit neurologique est évalué afin de confirmer la réussite de la T-M-C-A-O et de déterminer son score d'efficacité, en évaluant les déficits neurologiques des souris à 1, 24, 48 et 72 heures après la perfusion selon une échelle à six points comme suit : zéro égale normal, un égale léger, rotation avec ou sans recroquevillement inconstant lorsqu'on soulève l'animal par la queue. Plus de 50 % des tentatives de recroquevillement vers le côté controlatéral.Deux correspond à un recourbement léger et constant dans plus de 50 % des tentatives de recourbement vers le côté controlatéral. Trois correspond à un recourbement constant, fort et immédiat. La souris maintient une position recourbée pendant plus d'une à deux secondes.Avec son museau arrivant presque à sa queue. Quatre égale un enroulement sévère. Une progression menant à une perte du réflexe de marche ou d'écriture, cinq égale coma ou monticule.Après perfusion avec une solution de PBS, congeler rapidement les cerveaux dans du pentane iso et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Remarque : les cerveaux de souris peuvent également être perfusés avec du paraformaldéhyde à 4 % selon les études d'immunohistochimie prévues. Ensuite, utiliser un cryostat pour découper des sections coronales du cerveau de 17 µm en utilisant 30 lames.Placer une section sur trente sur la même lame. Ensuite, colorer les première et quinzième lames au violet de crésyl. Pour une estimation plus précise du volume de la lésion, utiliser un système d'analyse d'image tel que Scion Image du NIH afin d'évaluer le delimitation de la lésion, la zone d'infarctus qui apparaît en blanc dans les hémisphères cérébraux gauche et droit.Répétez cette limitation D sur toutes les tranches cérébrales. Calculez le volume de l'infarctus en unités arbitraires et exprimez-le en pourcentage de la zone controlatérale non lésée pour chaque section. Conservez les autres lames à moins 80 degrés Celsius pour des études d'immunohistochimie.L'évaluation du score neurologique confirme la réussite de la T-M-C-A-O chez mes sujets soumis à la procédure intraluminale. Comme on le voit ici, un enrouement marqué, fort et intermédiaire est observé, et la souris maintient une posture enroulée pendant plus d'une à deux secondes, son nez atteignant presque sa queue. Dans notre expérience, toutes les souris présentaient au moins un enrouement léger mais constant, ce qui correspond à un score neurologique de deux pendant toute la durée du test.La coloration au violet de Kressel a été réalisée afin d'évaluer l'importance de l'infarctus cérébral. Après l'occlusion artérielle cérébrale moyenne transitoire (T-M-C-A-O) illustrée ici, une section coronaire représentative du cerveau de souris colorée au violet de crête après 72 heures de reperfusion est présentée. La zone d'infarctus, principalement le striatum, le cortex et les régions cérébrales adjacentes, qui sont indiquées, apparaît en blanc car elle n'est pas colorée par le violet de crête.Le violet indiqué ici correspond au volume lésionnel, qui est la partie blanche de l'hémisphère droit exprimée en pourcentage de la zone non lésée homologue située dans l'hémisphère gauche. Le volume d'infarctus chez les souris mâles C57BL/6 après un accident vasculaire cérébral ischémique représente environ 70 % de l'hémisphère non lésé. Cette procédure assure une forte reproductibilité de la lésion.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire un accident ischémique transitoire chez la souris. En outre, l'approche par coloration au violet de crésyl permet de mesurer le volume d'infarctus cérébral et vous offre l'avantage considérable de disposer de nombreux échantillons pour tester des marqueurs pertinents par immunohistochimie. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Modèle murin d'MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

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