Modèle murin d'MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

L’objectif global de cette procédure est d’imiter l’AVC ischémique chez la souris. Tout d’abord, l’artère carotide commune est temporairement ligaturée, tandis que l’artère carotide externe est ligaturée en permanence aussi distalement que possible. Une autre suture temporaire légèrement serrée est placée sur l’ECA au-dessus de la bifurcation.

La deuxième étape consiste à clamper l’artère carotide interne à l’aide d’une pince à épiler à action inverse pour éviter les saignements. Coupez ensuite l’ECA entre les ligatures permanentes et temporaires. Ensuite, le monofilament recouvert de silicone est introduit dans l’ECA.

Ensuite, l’ECA est inversé pour introduire le monofilament dans l’ICA jusqu’à ce qu’il inclue la base de l’artère cérébrale moyenne. Une heure plus tard, le flux sanguin est rétabli par l’ablation du monofilament pour imiter la restauration du flux sanguin après lyse d’une griffe thromboembolique chez l’homme. En fin de compte, le déficit neurologique, qui reflète le succès de T-M-C-A-O et la gravité de l’infarctus, peut être évalué juste après la reperfusion et à différents moments après la reperfusion.

Le logiciel d’image cyan du NIH est utilisé pour calculer le volume de l’infarctus sur des tranches de cerveau représentatives colorées par le violet crestal. L’un des principaux avantages de l’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne à l’aide de la technique du filament intraluminal est qu’elle mime l’AVC ischémique chez le patient avec restauration du flux sanguin et le développement de cette procédure chez la souris offre la possibilité d’utiliser un outil de génétique de marquage pour identifier le rôle d’une protéine cible. En cas d’AVC, l’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne est réalisée sur des souris mâles C 57 noires de deux à trois mois, pesant entre 22 et 28 grammes.

Ce protocole a été approuvé par le Comité de bioéthique des soins de l’IRCM afin d’augmenter la reproductibilité du volume de l’infarctus. Nous utilisons du monofilament réutilisable de 12 millimètres de long, recouvert de six oh silicium de la société Doco. Deux heures avant l’opération.

Injecter de la buprénorphine par voie intrapéritonéale à une souris à une dose de 0,03 milligramme par kilogramme. Pour commencer la procédure, anesthésiez les souris avec 5 % de fluor et maintenez l’anesthésie à 2,5 % de fluor ISO, utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris constante pendant la chirurgie, désinfectez la peau de fougère de la souris avec 70 % d’éthanol ou de bétadine. Faites ensuite une incision médiane dans le cou et séparez les tissus mous au microscope stéréoscopique.

Disséquez brutalement le cou de la souris afin d’exposer la trachée. Ensuite, rétractez les muscles pour localiser l’artère carotide. Disséquez soigneusement l’artère carotide commune gauche des tissus environnants.

Placez une suture temporaire de cinq oh soie, coupée en segments de 20 millimètres autour de l’artère. Veillez à ne pas endommager le nerf vagal. Ensuite, séparez la bifurcation de l’artère carotide commune interne gauche ou ICA et de l’artère carotide commune externe ou ECA, placez une suture permanente autour de l’ECA aussi distalement que possible.

Et une autre suture temporaire sur l’ECA au-dessus de la bifurcation. Coupez ensuite l’ICA gauche à l’aide d’une pince à épiler à action inverse pour éviter les saignements. Encore une fois, faites très attention à ne pas endommager le nerf vagal.

Découpez un petit trou dans l’ECA avant la bifurcation entre l’ECA et l’ICA et entre les sutures permanentes et temporaires placées plus tôt. Ensuite, introduisez une suture monofilament de 12 millimètres recouverte de silicium dans l’ECA, coupez complètement l’ECA et inversez le monofilament dans l’ICA. Attachez fermement la suture pour éviter les saignements et retirez la pince à épiler à action inverse.

Introduisez ensuite le monofilament dans le cercle de Willis jusqu’à ce que le monofilament obstrue la base de la butée MCA. Son insertion à environ neuf à 10 millimètres au-delà de la bifurcation de l’ECA et de l’ACC. Généralement, le monofilament sera bloqué et ne pourra plus bouger.

Veillez à ne pas pénétrer l’artère tégo-palatine. Attachez fermement la suture sur l’ECA afin de fixer le filament en position. Fermez maintenant la peau à l’aide d’un système de fermeture automatique des plaies.

Injectez un millilitre de solutions salines par voie sous-cutanée et placez les souris sous une lampe chauffante infrarouge pendant la période post-occlusion, qui est de 60 minutes. Anesthésiez les souris comme précédemment et retirez les clips automatiques, ouvrez légèrement la suture sur l’ECA pour permettre au monofilament de se retirer et au sang de reperfuser. Ensuite, attachez définitivement la suture temporaire sur l’ECA pour éviter la perte de sang.

Une heure après l’AVC, retirez le monofilament et conservez-le pour le réutiliser. Ensuite, retirez la suture temporaire sur l’ACC pour permettre au sang de recirculer. Fermez la plaie et sous-cutanée.

Injectez un autre millilitre de solution saline dans les souris. Après vous être assuré que l’animal retrouve sa mobilité, remettez-le dans sa cage et placez la moitié de la cage sur le coussin chauffant pour permettre aux souris de choisir leur environnement. 12 heures après la chirurgie, les souris reçoivent une autre dose de buprénorphine pour toutes les opérations simulées.

Toutes les procédures sont identiques, sauf que le monofilament n’est pas inséré après la chirurgie. Le déficit neurologique est évalué pour confirmer le succès du T-M-C-A-O et déterminer son score d’efficacité. Les déficits neurologiques des souris à 1, 24, 48 et 72 heures après la perfusion sur une échelle de six points comme suit, zéro équivaut à normal, un équivaut à un léger, tournant avec ou sans enroulement incohérent lorsqu’il est attrapé par la queue. Plus de 50 % tentent de se recroqueviller du côté controlatéral.

Deux équivaut à une légère flexion constante de plus de 50 % de tentatives de courbure du côté controlatéral. Trois égale un curling constant, fort et immédiat. La souris maintient une position recroquevillée pendant plus d’une à deux secondes.

Avec son nez atteignant presque sa queue. Quatre équivaut à un curling sévère. Progressant vers une perte de réflexe de marche ou d’écriture cinq égale comateux ou monticule.

Après perfusion avec la solution PBS, brisez rapidement les cerveaux dans de l’isop pentane et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Notez que le cerveau des souris peut également être perfusé avec de l’aldéhyde paraforme à 4 % selon les études d’immunohistochimie prévues. Ensuite, utilisez un cryostat pour couper des sections de cerveau coronaire de 17 microns à l’aide de 30 lames.

Placez une section de chaque 30 sur la même diapositive. Colorez ensuite la première et la 15e lames avec du violet crestal. Pour une estimation plus précise du volume des blessures, utilisez un système d’analyse d’images tel que Scion image du NIH pour évaluer la lésion, la zone de l’infarctus qui apparaît blanche dans les hémisphères cérébraux gauche et droit.

Répétez cette limitation D sur toutes les tranches de cerveau. Calculez le volume de l’infarctus en unités arbitraires et exprimez-les en pourcentage de la surface controlatérale non lésionnée pour chaque section. Conservez les autres lames à moins 80 degrés Celsius pour les études d’immunohistochimie.

L’évaluation du score neurologique confirme le succès de T-M-C-A-O chez mon soumis à la procédure intraluminale. Comme on le voit ici, une boucle constante, forte et intermédiaire est observée et la souris maintient une position recroquevillée pendant plus d’une à deux secondes, son nez atteignant presque sa queue. Dans notre expérience, toutes les souris ont présenté au moins une légère courbure constante, ce qui correspond à un score neurologique de deux tout au long de la période de test.

Une coloration violette de Kressel a été réalisée afin d’évaluer l’étendue de l’infarctus cérébral. D’après T-M-C-A-O, on voit ici des coupes coronales représentatives du cerveau de souris colorées au violet de crête après 72 heures après la reperfusion. La zone de l’infarctus, principalement le striatum et le cortex et les zones cérébrales adjacentes, qui sont étiquetées, apparaît en blanc car elle n’est pas tachée par la crête.

Le violet représenté ici est le volume de la lésion, qui est la partie blanche de l’hémisphère droit exprimée en pourcentage de la zone controlatérale non lésée de l’hémisphère gauche. Le volume de l’infarctus chez les souris C57 noires six mâles suite à un AVC ischémique représente environ 70 % de l’hémisphère non déchaîné. Cette procédure offre une forte reproductibilité des lésions.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser un AVC ischémique transitoire chez la souris. De plus, l’approche du quiz viol pour mesurer votre cerveau en fait volume, vous offre le grand avantage d’avoir beaucoup de matériel pour tester des marqueurs pertinents par immunochimie. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.