Modélisation colite cancer associé avec azoxyméthane (OMA) et de sodium Sulfate de Dextran (DSS)

Le jour zéro, Myer s’est injecté de l’azoxyméthane ou un OM la semaine suivante. Leur eau potable est remplacée par une solution contenant du sulfate de dextran sodique ou DSS. À la troisième semaine, les souris reçoivent de l’eau pour les deux semaines suivantes.

Ce cycle d’eau DSS est répété deux fois de plus. Après le deuxième cycle DSS. Les souris peuvent être évaluées pour les tumeurs par endoscopie miroir.

Après la semaine 10, les souris sont sacrifiées et les côlons récoltés. Les côlons sont rincés et ouverts longitudinalement. La taille et le nombre de tumeurs sont évalués dans les côlons.

Une coupe longitudinale du côlon en tiers peut être encastrée et soumise à une analyse histologique. À l’aide de la microscopie optique, les tumeurs peuvent être comptées et classées. Nous démontrons un protocole dans lequel l’administration de l’agent génotoxique est une MO, suivie de trois cycles de l’agent pro-inflammatoire.

Le DSS génère rapidement et régulièrement des tumeurs du côlon chez les souris présentant des similitudes morphologiques et moléculaires avec celles observées dans le cancer associé à la colite humaine Des souris marquées individuellement avec des marques de queue ou des clips d’oreille au jour zéro, enregistrez le poids de base de chaque souris sur une table, puis injectez à chaque souris une solution de 10 milligrammes par kilogramme d’un exercice de MO. Prudence lors de la manipulation d’un MO car il s’agit d’un agent génotoxique le septième jour, l’avare étant fourni avec une solution DSS à 2,5 % comme eau de boisson pour la semaine suivante. Pour préparer cette solution, ajoutez de la poudre de DSS à de l’eau distillée et mélangez jusqu’à ce qu’elle soit dissoute.

La solution est prête après avoir été passée à travers un filtre en acétate de cellulose de 0,2 micron. Fournir un approvisionnement continu en solution DSS pendant sept jours. Remplacez le DSS tous les deux à trois jours.

Après cette période, remettez les cages à l’eau pendant deux semaines. Pesez les souris deux à trois fois par semaine et observez les saignements rectaux et la diarrhée. Les souris atteintes de grosses tumeurs peuvent développer temporairement un prolapsus rectal, bien que cela ne réduise généralement pas le pourcentage de survie.

La perte de poids par rapport à la ligne de base est utilisée comme mesure de substitution de la gravité de la colite. Une perte de poids allant jusqu’à 10 % ainsi que deux à trois jours de diarrhée et de saignements rectaux peuvent être attendus dans la semaine suivant un cycle complet d’endoscopie DSS. Suivant. Le deuxième ou le troisième cycle de DSS peut être effectué pour confirmer la croissance tumorale in vivo avant le sacrifice.

Comme le modèle A-O-M-D-S-S est assez fiable dans la production de tumeurs, cette étape n’est généralement pas nécessaire. Seules quelques souris doivent être évaluées à l’aide de cette méthode car elle a le potentiel de perturber les tumeurs de souris. Votre zone de travail doit inclure un bécher de phosphate stérile, de solution saline tamponnée ou de PBS ainsi qu’un bécher vide.

Pour jeter le PBS usagé, prélevez huit à 10 millilitres de PBS dans une seringue et fixez-le à l’endoscope par utilisation. Lors du rinçage du contenu intraluminal, anesthésez chaque souris avec une sédation inhalée ou injectable et fixez la souris à une planche plate Avec du ruban adhésif à la queue et à la poitrine des coussinets de pied de souris peuvent être pincés. Pour assurer une sédation adéquate, utilisez votre pouce et votre index pour pincer le bas-ventre de la souris afin d’exposer l’anus, avancez l’endoscope de muren dans le rectum de la souris.

Utiliser doucement le PBS pour gonfler et irriguer afin d’améliorer la vue intraluminale et d’éliminer le contenu fécal. Continuez à avancer lentement l’endoscope tout en observant le moniteur. Pour la présence de tumeurs macroscopiques au jour 70, chaque souris traitée A-O-M-D-S-S doit héberger plusieurs tumeurs du côlon et être prête pour l’évaluation.

Cet état peut être retardé de plusieurs semaines à quelques mois si des tumeurs plus importantes sont souhaitées. Préparez une seringue remplie de PBS attachée à une aiguille à gavage. Une seringue chargée de ciseaux chirurgicaux de base à 10 % de formol, des ciseaux à pointes arrondies.

Une petite seringue chargée d’une solution Ian Blue à 1 % et une pince fine. De plus, disposez un plateau froid, un bateau contenant un nouveau rasoir PBSA réfrigéré pour la section et un bassin de fixation rempli de 10 % de formol euthanasiez chaque souris par isof, fluor et luxation cervicale ou toute autre méthode approuvée par l’institution. Le poids final et d’autres mesures peuvent être effectués.

À ce moment, posez la souris avec sa face ventrale exposée sur une planche à découper. Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % pour garder les poils libres de la zone de dissection. À l’aide d’une pince, saisissez la ligne médiane de l’abdomen et faites une petite incision à travers la peau pour exposer le péritoine.

Utilisez une traction douce pour séparer la peau du péritoine et exposer toute la cavité abdominale. Faites une incision dans le péritoine et prolongez cette incision le long du bord costal de manière bilatérale. Utilisez des ciseaux fermés pour balayer l’intestin grêle et le côlon sur le côté.

Cela exposera les ganglions lymphatiques mésentéraux, qui peuvent être éventuellement prélevés. Pour l’évaluation, balayez les voies urinaires génitales vers le bas pour exposer le côlon et le rectum descendants, excisez la vessie et les organes reproducteurs si nécessaire pour exposer davantage le bassin. Veiller à ne pas perturber les tissus adjacents.

Coupez à travers le rameau pubien inférieur et supérieur pour exposer la jonction rectale anale. Coupez la peau autour de la jonction rectale anale pour libérer le côlon tout en assurant une traction douce vers le haut. Avec une pince mésentérique, les attaches du côlon peuvent être excisées ou retirées.

Il est important de conserver une partie de la peau au niveau de la jonction anale rectale, car cette zone est souvent touchée par la dysplasie. Transect du gros intestin de l’intestin grêle juste à proximité du cæcum. Séparez le sécum du côlon adjacent à l’aide d’une aiguille de gavage de calibre 18 attachée à une seringue de cinq millilitres.

Rincer le côlon avec du PBS glacé de sorte que le liquide s’échappe dans le sens physiologique à l’aide de ciseaux à bords arrondis. Ouvrez le côlon le long de son mésentère. Peignez le côlon ouvert sur la plaque froide.

Assurez-vous que le plateau est suffisamment décongelé pour ne pas geler le tissu. Appliquez quelques gouttes de 1 %Ian Blue avec un doigt pour mieux visualiser les tumeurs. Évaluez le nombre et la taille de la tumeur à l’aide d’une règle ou prenez des photos pour une analyse numérique.

De petites sections de tumeur dans les tissus normaux adjacents peuvent être excisées à ce stade pour une analyse future par des méthodes immunohistochimiques, laissant une partie du côlon pour une évaluation histologique. Appliquer 10 % formel dans le côlon restant sur le plateau froid à l’aide d’une seringue ou d’un doigt, en laissant le tissu se fixer pendant au moins 30 secondes. De cette manière, facilite le transfert vers le bassin de fixation.

Assurez-vous que le formin résiduel est essuyé avant de peindre un nouveau côlon ouvert sur le même plateau. Transférez le côlon dans une bassine remplie de 10 % de formine et épinglée sur les bords. Après trois heures de fixation, jetez, formine et remplacez par de l’éthanol à 70 %.

Les deux-points peuvent être conservés indéfiniment dans de l’éthanol à 70 %. Utilisez un feu doux pour faire une solution de gélose à 2 % et réservez une lame propre sur une plaque de verre. Coupez le côlon fixe en trois et retournez les morceaux inutilisés dans le bassin d’éthanol.

Coupez les sections à une taille uniforme à l’aide de deux rasoirs. Intégrez les sections et les couches du côlon dans la gélose sur la lame propre. Répétez ce processus pour les deux-points suivants.

Segmentez le pan coupé, l’excès de gélose et placez le côlon incrusté dans une cassette pour le traitement et la coloration avec de l’hématine et de l’eoin. La première figure décrit le protocole d’induction du cancer associé à la colite. La figure deux montre le poids de la souris par rapport à la ligne de base lors d’une administration d’OM et de DSS.

Notez que dans la semaine qui suit chaque cycle de DSS, les souris perdent 5 à 10 % de leur poids corporel. La perte de poids dans cette expérience est un marqueur de substitution de la gravité de la colite. La figure trois montre une vue des tumeurs du côlon distal via l’endoscopie de Muren au jour 50 du traitement A-O-M-D-S-S.

Notez les multiples masses polypoïdes obstruant la lumière du côlon distal dans les panneaux B et C par rapport au côlon normal. Dans le panneau, une figure quatre montre un côlon de souris ouvert longitudinalement, illustrant l’apparence grossière des tumeurs. Notez la charge tumorale plus élevée dans le côlon distal et la texture caractéristique du côlon proximal avec une faible croissance tumorale.

La figure cinq montre des tumeurs mises en évidence par l’application de lc et de coloration bleue. Notez comment le colorant met l’accent sur la texture normale du côlon ainsi que sur les bords de chaque tumeur individuelle. Une telle coloration peut être utile dans la mesure précise des zones tumorales à l’aide d’une règle ou d’une mesure numérique.

La figure six montre la distribution représentative du nombre moyen de tumeurs par souris traitées avec une OM et une DSS. Notez que la majorité des tumeurs sont situées dans le côlon distal et mesurent moins de deux millimètres. La figure sept montre des coupes longitudinales du côlon incrustées en paraffine dans une cassette et une lame de coloration h et E.

Notez que la coloration résiduelle S et bleue n’interfère pas avec la coloration h et e. Une grosse tumeur est encerclée sur l’image de la diapositive. La désignation distale, médiane et proximale résulte de la section de l’ensemble du côlon en tiers entre le cæcum et l’anus.

La figure huit montre l’histologie représentative d’une tumeur résultant d’une administration d’OM et de DSS dans le côlon distal. Les photomicrographies montrées sont colorées avec H et E-B-R-D-U et bêta-caténine et montrent des changements dysplasiques similaires aux adénocarcinomes humains du côlon. Dans cette vidéo, nous avons démontré un protocole pour la tumorogenèse colique induite par l’inflammation chez la souris, en utilisant une seule injection d’un MO suivie de trois cycles de sept jours de DSS.

Sur une période de 10 semaines, ce modèle induit des tumeurs avec des changements histologiques et moléculaires ressemblant étroitement à ceux qui se produisent dans le cancer associé à la colite humaine, et fournit un modèle très précieux pour l’étude de l’oncogenèse et de la prévention de la chimiothérapie dans cette maladie.