Modélisation colite cancer associé avec azoxyméthane (OMA) et de sodium Sulfate de Dextran (DSS)

Le jour zéro, Myer a injecté de l'azoxyméthane ou un OM la semaine suivante. Leur eau de boisson est remplacée par une solution contenant du sodium dodécylsulfate ou DSS. À la troisième semaine, les souris reçoivent de l'eau pendant les deux semaines suivantes.

Ce cycle d'eau au DSS est répété deux fois supplémentaires. Après le deuxième cycle de DSS, les souris peuvent être évaluées pour les tumeurs par endoscopie en miroir.

Après la semaine 10, les souris sont sacrifiées et les côlons sont prélevés. Les côlons sont rincés et ouverts longitudinalement. La taille et le nombre de tumeurs sont évalués sur les côlons.

Une section longitudinale du côlon en tiers peut être incluse et soumise à une analyse histologique. À l'aide d'un microscope optique, les tumeurs peuvent être comptées et classées. Nous démontrons un protocole dans lequel l'administration de l'agent génotoxique a OM est suivie de trois cycles de l'agent pro-inflammatoire.

Le DSS induit rapidement et de manière reproductible des tumeurs coliques chez la souris, présentant des similitudes morphologiques et moléculaires avec celles observées dans le cancer associé à la colite humaine. Étiquetez individuellement les souris à l’aide de marques sur la queue ou de pinces d’oreille au jour zéro, enregistrez le poids de base de chaque souris dans un tableau, puis injectez à chaque souris une solution de 10 milligrammes par kilogramme d’OM. Manipulez l’OM avec précaution car il s’agit d’un agent génotoxique. Au jour sept, fournissez aux souris une solution de DSS à 2,5 % en tant qu’eau de boisson pendant la semaine suivante. Pour préparer cette solution, ajoutez de la poudre de DSS à de l’eau distillée et mélangez jusqu’à dissolution complète.

La solution est prête lorsqu'elle a traversé un filtre en acétate de cellulose de 0,2 micron. Pour assurer un approvisionnement continu en solution de DSS pendant sept jours, remplacez la solution de DSS tous les deux à trois jours.

À l'issue de cette période, remettez les cages à l'eau pendant deux semaines. Pesez les souris deux à trois fois par semaine et surveillez la présence de saignements rectaux et de diarrhée. Les souris présentant de grosses tumeurs peuvent développer temporairement un prolapsus rectal, bien que cela n'ait généralement pas d'incidence sur le pourcentage de survie.

La perte de poids par rapport à la ligne de base est utilisée comme mesure substitutive de la gravité de la colite. Une perte de poids allant jusqu'à 10 %, accompagnée de deux à trois jours de diarrhée et de saignements rectaux, peut être attendue au cours de la semaine suivant un cycle complet de coloscopie au DSS. Un deuxième ou troisième cycle de DSS peut être réalisé afin de confirmer la croissance tumorale in vivo avant l'euthanasie.

Étant donné que le modèle A-O-M-D-S-S est très fiable pour induire des tumeurs, cette étape n'est généralement pas nécessaire. Seules quelques souris devraient être évaluées selon cette méthode, car elle pourrait perturber les tumeurs chez la souris. Votre espace de travail doit comprendre un bécher contenant du tampon salin phosphate stérile ou PBS, ainsi qu'un bécher vide.

Pour éliminer le PBS utilisé, aspirez huit à dix millilitres de PBS dans une seringue et fixez-la à l'endoscope selon chaque utilisation. Pour rincer les contenus intraluminaux, anesthésiez chaque souris à l’aide d’une sédation inhalée ou injectable et fixez la souris sur une planche plate à l’aide de ruban adhésif au niveau de la queue et de la poitrine ; les coussinets des pattes de la souris peuvent être pincés. Pour garantir une sédation adéquate, utilisez votre pouce et votre index pour pincer l’abdomen inférieur de la souris afin d’exposer l’anus, puis avancez l’endoscope murin dans le rectum de la souris.

Utiliser doucement du PBS pour insuffler et irriguer afin d'améliorer la vue intraluminale et éliminer les contenus fécaux. Continuer à avancer lentement l'endoscope tout en observant le moniteur. En cas de présence de tumeurs macroscopiques au jour 70, chaque souris traitée au A-O-M-D-S-S devrait présenter plusieurs tumeurs coliques et être prête pour l'évaluation.

Cet état peut être retardé de plusieurs semaines à plusieurs mois si l'on souhaite obtenir des tumeurs plus volumineuses. Préparez une seringue remplie de PBS fixée à une canule d'œsophage. Une seringue chargée avec du formol à 10 %, des ciseaux chirurgicaux basiques, des ciseaux à bouts ronds.

Une petite seringue chargée d'une solution de 1 % de Ian Blue et une pince fine. Préparez également un plateau froid, un bateau d'éloignement contenant du PBSA refroidi, un nouveau rasoir pour la découpe et un bac de fixation rempli de formol à 10 %. Euthanasier chaque souris par isoflurane et dislocation cervicale ou par une autre méthode approuvée par l'institution. Les mesures finales de poids et d'autres paramètres peuvent alors être effectuées.

À ce stade, placez la souris sur le dos, le côté ventral exposé, sur une planche à découper. Pulvérisez l'abdomen avec de l'éthanol à 70 % afin d'éviter que les poils n'entrent dans la zone de dissection. Utilisez une pince pour saisir la ligne médiane de l'abdomen et pratiquez une petite incision dans la peau afin d'exposer le péritoine.

Appliquez une traction douce pour séparer la peau du péritoine et exposer toute la cavité abdominale. Pratiquez une incision dans le péritoine et prolongez cette incision le long de la marge costale de manière bilatérale. Utilisez des ciseaux fermés pour déplacer l'intestin grêle et le côlon sur le côté.

Cela permettra d'exposer les ganglions lymphatiques mésentériques, qui peuvent être prélevés de façon facultative. Pour l'évaluation, déplacer vers le bas la voie urinogénitale afin d'exposer le côlon descendant et le rectum, puis exciser la vessie et les organes reproducteurs selon les besoins afin d'exposer davantage le pelvis, en prenant soin de ne pas perturber les tissus adjacents.

Couper les rami pubiens inférieur et supérieur pour exposer la jonction anorectale. Inciser la peau autour de la jonction anorectale afin de libérer le côlon tout en exerçant une légère traction vers le haut. À l’aide de pinces mésentériques, les attaches du côlon peuvent être sectionnées ou délicatement détachées.

Il est important de conserver une partie de la peau au niveau de la jonction ano-rectale, car cette zone est souvent touchée par une dysplasie. Sectionner l'intestin grêse de l'intestin grêle juste en amont du caecum. Séparer le caecum du côlon adjacent à l'aide d'une aiguille de gavage de calibre 18 fixée à une seringue de cinq millilitres.

Rincez le côlon avec du PBS glacé de manière à ce que le liquide s'écoule dans le sens physiologique, en utilisant des ciseaux à bords arrondis. Ouvrez le côlon le long de son mésentère. Étalez le côlon ouvert sur le plateau froid.

Veillez à ce que le plateau ait suffisamment dégelé pour ne pas congeler le tissu. Appliquez quelques gouttes de bleu d’ian 1 % avec le doigt afin de mieux visualiser les tumeurs. Évaluez le nombre et la taille des tumeurs à l’aide d’une règle ou prenez des photographies pour une analyse numérique.

De petits prélèvements de tumeur dans le tissu normal adjacent peuvent être excisés à ce stade pour des analyses ultérieures par des méthodes d'ARN, de protéines ou d'immunohistochimie, en laissant une partie du côlon destinée à l'évaluation histologique. Appliquez 10 % formal dans le côlon restant sur le plateau froid à l’aide d’une seringue ou du doigt, en laissant le tissu fixer pendant au moins 30 secondes. Cette méthode facilite le transfert vers le bassin de fixation.

Veillez à essuyer tout formol résiduel avant de peindre un nouveau côlon ouvert sur le même plateau. Transférez le côlon dans un bassin rempli de formol à 10 % et fixez-le par les bords. Après trois heures de fixation, jetez le formol et remplacez-le par de l'éthanol à 70 %.

Les côlons peuvent être conservés indéfiniment dans de l'éthanol à 70 %. Utilisez une faible chaleur pour préparer une solution à 2 % d'agar et mettez de côté une lame propre sur une plaque de verre. Coupez le côlon fixé en trois parties et remettez les morceaux inutilisés dans le récipient d'éthanol.

Raboter les sections à une taille uniforme à l'aide de deux rasoirs. Inclure les sections et les couches de colon dans de l'agar sur une lame propre. Répéter ce processus pour le colon suivant.

Découper en segments, éliminer l'excès d'agar et placer le côlon inclus dans une cassette pour le traitement et la coloration à l'hématine et à l'éosine. La figure un décrit le protocole d'induction du cancer associé à la colite. La figure deux montre le poids des souris par rapport à la ligne de base durant l'administration d'OM et de DSS.

À noter qu'au cours de la semaine suivant chaque cycle de DSS, les souris perdent de cinq à 10 % de leur poids corporel. La perte de poids dans cette expérience constitue un marqueur indirect de la gravité de la colite. La figure trois présente une vue des tumeurs dans le colon distal par endoscopie murine au jour 50 du traitement A-O-M-D-S-S.

Remarquez les multiples masses polypoïdes obstruant la lumière du côlon distal dans les panneaux B et C, par comparaison avec le côlon normal. Dans le panneau A, la figure quatre montre un côlon de souris ouvert longitudinalement, illustrant l'aspect macroscopique des tumeurs. Remarquez la charge tumorale plus élevée dans le côlon distal et la texture caractéristique en « dents de scie » du côlon proximal, avec peu de croissance tumorale.

La figure cinq montre des tumeurs mises en évidence par l'application d'un colorant lc et bleu. Remarquez comment le colorant met en valeur la texture normale du côlon ainsi que les limites de chaque tumeur individuelle. Une telle coloration peut être utile pour mesurer précisément la surface des tumeurs à l'aide d'une règle ou d'une mesure numérique.

La figure six montre la répartition représentative du nombre moyen de tumeurs par souris traitée avec un OM et du DSS. Remarquez que la majorité des tumeurs se situent dans le côlon distal et ont une taille inférieure à deux millimètres. La figure sept montre des coupes longitudinales du côlon incluses en paraffine dans une cassette et une lame colorée à l'hématoxyline et à l'éosine.

Remarquez que les résidus de S et la coloration bleue n'interfèrent pas avec la coloration hématoxyline et éosine. Un gros tumeur est entourée sur l'image de la lame. Les désignations distale, médiane et proximale résultent de la section complète du côlon en trois parties égales entre le caecum et l'anus.

La figure huit montre l'histologie représentative d'une tumeur résultant d'une administration de OM et de DSS dans le côlon distal. Les microphotographies présentées sont colorées à l'hématoxyline et éosine, à la B-R-D-U et à la bétacaténine, et mettent en évidence des modifications dysplasiques similaires à celles observées dans les adénocarcinomes humains du côlon. Dans cette vidéo, nous avons démontré un protocole de tumorigenèse colique induite par l'inflammation chez la souris, utilisant une injection unique de OM suivie de trois cycles de sept jours de DSS.

Sur une période de 10 semaines, ce modèle induit des tumeurs présentant des modifications histologiques et moléculaires très proches de celles observées dans le cancer associé à la colite chez l'humain, et constitue un modèle hautement pertinent pour l'étude de l'ontogenèse et de la chimioprévention dans cette maladie.