Synthèse en phase solide d'un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant "Sécurité Catch" Méthodologie

L’objectif général de l’expérience suivante est de synthétiser un peptide BSP fonctionnalisé à l’aide de techniques de phase solide. Ceci est réalisé en chargeant un acide aminé BIS protégé sur une résine d’acide hydroxyéthylbenzoïque. Ensuite, des cycles de couplage de protection profonde sont répétés pour attacher des acides aminés bis fonctionnalisés, un processus qui allonge le peptide BIS et affiche la fonctionnalité souhaitée.

Enfin, le premier acide aminé bis est modifié avec un acide aminé alpha afin de cliver le peptide BIS de la résine par formation de DI Keto pyrazine. On obtient des résultats qui montrent la synthèse réussie d’un peptide BSP fonctionnalisé d’une bonne pureté brute et des rendements isolés constants d’environ 10 % sur la base d’une analyse par chromatographie liquide par spectrométrie de masse. Les implications de cette technique s’étendent à la synthèse parallèle et en banque de peptides bis, car les peptides BIS sont assemblés sur une résine solide, qui est plus facilement manipulée que les réactions en solution et les sous-produits sont facilement éliminés par filtration.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car de nombreuses étapes sont difficiles à apprendre, car de nombreux détails importants sont nécessaires pour s’assurer que toutes les réactions se rapprochent le plus possible de la fin. Avec la synthèse en phase solide, il n’y a aucun moyen de purifier les intermédiaires. Ainsi, afin d’obtenir un produit final propre, chaque réaction doit être poussée aussi loin que possible.

Nous vous recommandons de créer une liste de contrôle des procédures expérimentales pour éviter toute confusion, car les étapes sont de nature répétitive. Ce protocole commence par le chargement du premier peptide BSP, la protection du premier peptide BSP et le recouvrement simultané de la résine. Pour commencer, chargez le premier peptide BSP en pesant 114 milligrammes de résine H-M-B-A-A dans un récipient de réaction de huit millilitres et ajoutez une barre d’agitation magnétique.

Recouvrez le haut du récipient avec le septum en caoutchouc et purgez le tube avec de l’Argonne pendant au moins cinq minutes. Pendant ce temps, préparez la solution d’acides aminés BIS activée comme décrit dans le protocole écrit. Accompagnant cette vidéo, transférez la solution dans le récipient de réaction à l’aide d’une seringue et mélangez sous Argonne pendant la nuit du lendemain, retirez le septum et égouttez le mélange réactionnel.

Lavez la résine en ajoutant environ deux millilitres de chlorométhane à la résine. Remuez pendant 30 secondes à une minute, puis égouttez. Répétez ce processus quatre fois avec du DCM, puis lavez la résine cinq fois avec du diméthylformamide.

Pour effectuer une protection en profondeur du premier acide aminé bis et un recoiffage simultané de la résine, ajoutez lentement deux millilitres d’une solution de bromure d’hydrogène à 33 % dans de l’acide acétique et du DCM dans le récipient de réaction. Laisser remuer pendant 15 minutes après avoir égoutté et lavé la résine cinq fois dans du DCM. Répétez la séquence de protection D une fois de plus.

Ensuite, lavez la résine cinq fois dans du DCM puis cinq fois dans du DMF, neutralisez la résine en lavant deux fois avec la solution volumique à 5 % de D-I-P-E-A dans du DMF. Ensuite, lavez cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF une fois de plus. Maintenant, le couplage de l’acide aminé bis fonctionnalisé protégé peut être effectué.

Tout d’abord, réintroduisez une atmosphère inerte dans le récipient de réaction contenant de la résine en le lavant trois fois avec du DCM anhydre. Ensuite, fixez une purge de septum et de ligne d’argonne et lavez le récipient en ajoutant un à deux millilitres de DCM anhydre et en remuant pendant 30 secondes. Égouttez ensuite le récipient jusqu’à ce que le barboteur de ligne d’argonne commence à monter.

Répétez ce processus au moins une fois de plus. Ensuite, préparez une solution d’acide aminé bis fonctionnalisé dans un tube à essai séché à la flamme sous atmosphère d’Argonne. Ajouter 47 microlitres de DIC et remuer pendant 90 minutes.

Ajoutez ensuite 35 microlitres de D-I-P-E-A dans 666 microlitres et du DMF hydrus à la résine et remuez pendant cinq minutes supplémentaires. Transférez la solution d’acides aminés BIS pré-activée dans le récipient à l’aide d’une seringue et remuez pendant la nuit le lendemain. Égouttez le mélange réactionnel et lavez-le deux fois avec du DCM anhydre sous argon.

Une étape critique de cette procédure est le couplage des acides aminés biz. Pour garantir les fermetures d’anneau des pipérazines céto, nous utilisons des temps de réaction plus longs avec des agents activateurs supplémentaires. Pour favoriser la fermeture de la di keto pyrazine, ajoutez une solution de HOAT et de DIC en remuant sous l’argon pendant une heure.

Ensuite, retirez le septum et égouttez le mélange réactionnel. Lavez la résine cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF. Cette section couvre la protection en profondeur de l’acide aminé BIS fonctionnalisé, la protection en profondeur du carbone et l’acylation du premier acide aminé BIS.

Pour effectuer une protection en profondeur de l’acide aminé bis fonctionnalisé protégé, ajoutez lentement deux millilitres d’une solution de TFA et de TIPS dans le récipient de réaction et remuez pendant une heure après l’égouttage, lavez la résine avec du DCM pendant environ 30 secondes, puis vidangez à nouveau le DCM cinq fois. Répétez ensuite toute la séquence de lavage de la résine de protection en profondeur après le lavage A-D-C-M-M-F. Neutralisez la résine en la lavant deux fois avec une solution volumique à 5 % de D-I-P-E-A dans du DMF.

Effectuez ensuite un autre lavage D-C-M-D-M-F. À partir de là, le peptide BIS peut être allongé avec d’autres acides aminés bis fonctionnalisés ou fonctionnalisé sur l’acide carboxylique d’azote ou les deux. Pour protéger le groupe FM, ajoutez une solution de deux millilitres de 20 % de paridine dans du DMF et mélangez la réaction pendant 20 minutes.

Égouttez et lavez la résine cinq fois dans du DMF. Répétez ce processus une fois de plus après un lavage supplémentaire de la résine. A Isolez le premier acide aminé en ajoutant la solution d’acides aminés préparée dans le récipient de réaction et remuez pendant six heures comme étape finale.

Lavez la résine cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF. La dernière partie de ce protocole comprend l’élimination du groupe Bach de l’acide aminé lié à la résine et le clivage de la résine. Tout d’abord, ajoutez deux millilitres d’une solution individuelle T-F-A-D-C-M dans le récipient de réaction et remuez pendant 30 minutes.

Égouttez et lavez la résine cinq fois dans DCM. Répétez ensuite ce processus une fois de plus. Lavez et égouttez la résine pendant 30 secondes, cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une solution à 10 % D-I-P-E-A dans du DMF anhydre et remuez pendant 24 à 48 heures. Enfin, recueillez le mélange réactionnel dans une fiole à fond rond pré-pesée. Transférez 30 microlitres de cette solution à 450 microlitres de Tetra Hydro FU dans un fichier lc MS et soumettez-le pour analyse.

Lavez la résine avec des aliquotes supplémentaires de DMF et recueillez-la dans la fiole à fond rond. Les méthodes suivantes peuvent être utilisées pour surveiller les transformations chimiques de la résine tout au long de la synthèse. Pour détecter les groupes hydroxyles libres, effectuez le test du rouge de méthyle en prélevant d’abord environ un milligramme de résine sèche à l’aide d’une pipette jetable.

Rincer dans un récipient de réaction de quatre millilitres. Ajouter une solution de rouge de méthyle préparée comme décrit dans le texte et remuer pendant cinq à 10 minutes. Égouttez et lavez la résine cinq fois avec des billes de résine DCM orange ou rouge indiquant la présence de groupes hydroxyles libres.

Ce test peut être utilisé pour évaluer la charge des premières étapes de coiffage des acides aminés et de la résine. Pour détecter les moyens secondaires, effectuez le test au chloral en transférant environ un milligramme de résine sèche dans un petit flacon à l’aide d’une pipette jetable. Ajouter trois gouttes de chloral à 0,8 millimolaire dans une solution de DMF et d’aldéhyde acide à 2 % dans une solution de DMF.

Et laissez-nous reposer à température ambiante pendant cinq à 10 minutes. Dans ce cas, des billes de résine bleues ou violettes sont une indication que des moyens secondaires libres sont présents sur le composé lié à la résine. Pour confirmer l’efficacité de l’activation, effectuer le test du piège d’activation, le composé activé pendant la synthèse peut être évalué en transférant cinq à 10 microlitres de la solution activée dans un flacon de spectrométrie de masse par chromatographie en phase liquide contenant 50 microlitres d’olaine mélangé à la main.

Pendant quelques secondes, la solution doit jaunir, puis diluer avec 450 microlitres de tétra hydro uran et la soumettre à l’analyse lc MS. Le produit final et les intermédiaires activés peuvent être évalués à l’aide d’un système LCM S équipé d’une colonne en phase inverse C18 et d’un système de solvant composé d’eau acétylnitrile avec 0,1 % d’acide formique. Cette trace L-C-M-S-U-V fournit un exemple de la bonne pureté du produit brut.

Le pic majeur du spectre trouvé à 21,3 minutes a un masque compatible avec la masse de produit attendue. Cela peut être visualisé dans le spectre de masse du produit brut, le pic révélant les pics majeurs correspondant à la masse, plus la masse de l’ion sodium, ainsi que la masse moins la masse du groupe protecteur IV DDE. On voit ici la trace UV LCMS des spectres purifiés révélant un produit très pur à 21,3 minutes et le spectre de masse confirmant l’identité de ce pic de sonde purifié.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les techniques de face solide pour synthétiser des peptides bis fonctionnalisés après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des peptides biz pour explorer des applications dans les interactions protéine-protéine et la catalyse une fois maîtrisée. Cette technique peut conduire à la synthèse d’un trimère peptidique biz fonctionnalisé en quatre à cinq jours si elle est correctement réalisée.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder les billes immergées dans les solutions de réaction et de lavage après cette procédure. D’autres méthodes telles que la synthèse parallèle ou de banque peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’effet de la stéréochimie ou des fonctionnalités alternatives sur la liaison aux protéines ou l’activité catalytique. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs organiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’un équipement de sécurité individuelle approprié et d’une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.