Name: Développement dun Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez la synthèse de peptides cycliques par irradiation micro-ondes pour le développement de thérapeutiques antiparasitaires. Cette méthode efficace préserve les chaînes latérales et permet le criblage de conformations bioactives.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, et Daria Mochly-Rosen pour des discussions utiles. Le travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé NIH Grant RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) pour NQ Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

1. Matériel et réactifs Préparation <ol><li> Préparation de l&#39;équipement <ol><li> Effectuez toutes les étapes à l&#39;intérieur d&#39;une hotte en utilisant un équipement de protection adéquat. </li><li> Synthétiser chimiquement les peptides sur support solide en utilisant un synthétiseur de peptides à micro-ondes avec un module supplémentaire de Discover équipé d&#39;une sonde de température à fibre optique pour commander la fourniture de micro-ondes de puissance dans un récipient de réaction en Téflon (30 ml, avec une fritte de verre) ou dans un polypropylène à usage unique Cartouche (12 ml, avec une fritte grossier). </li><li> Pour un mélange correct, connecter l&#39;alimentation en azote dans le récipient de réaction, ou bien sceller les deux extrémités de la cartouche de polypropylène, et le placer sur un agitateur rotatif. </li><li> Pour drainer des mélanges ou des lavages réaction, se connecter à l&#39;aspirateur de la maison par l&#39;intermédiaire d&#39;un siphon. </li><li> Placer la sonde à fibre optique dans le récipient de réaction. </li></ol></li><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer la résine en pesant Rink Amide AM résine 100-200 mesh (0,204 mg), Ajouter 5 ml de mélange 1: 1 de N, N-diméthylformamide (DMF) / dichlorométhane (DCM) à la cartouche navire / polypropylène réaction à laver la résine vers le bas, agiter pendant 2-4 heures à gonfler correctement, et les égoutter. </li><li> Préparer 0,2 M 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) amino solutions acides en dissolvant l&#39;acide Fmoc-aminé correspondant dans du DMF et le mélange vortex jusqu&#39;à ce que les acides aminés sont dissous (tableau 1). </li><li> Préparer 0,45 M activateur solution en dissolvant 18,96 mix g O - (benzotriazol-1-yl) - N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU) dans 100 ml de DMF et le mélange au vortex jusqu&#39;à ce que le solide est dissous (Tableau 1). </li><li> Préparer 2 M activateur base de mélange de solution en combinant 34,8 ml de N, N-diisopropyléthylamine (DIEA) avec 65,2 ml de 1-méthyl-2-pyrrolidinone (NMP) (tableau 1). </li><li> Préparer une solution 0,1 M de déprotection mélange par dissolution de 3,37 g d&#39;hydrate de 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)dans 250 ml d&#39;une solution v / v de 20% de pipéridine dans du DMF et le mélange au vortex jusqu&#39;à ce que le solide est dissous (tableau 1). </li></ol></li></ol> 2. Fmoc-protégé amino acide Accouplement <ol><li> Couplage des acides aminés <ol><li> Ajouter de l&#39;acide aminé (2,5 ml) / activateur (1 ml) / de la base de l&#39;activateur (0,5 ml) à une réaction cartouche récipient / polypropylène et de laisser la réaction se déroule pendant 300 sec (25 W, 75 ° C, Tableau 2). Égoutter la solution. </li><li> Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, RT) et vidanger la solution. Répétez cinq fois. </li></ol></li><li> Déprotection Fmoc <ol><li> Ajouter 7 ml de pipéridine à 20% dans du DMF avec 0,1 M de HOBt réaction cartouche récipient / polypropylène et incuber pendant 30 sec (45 W, 75 ° C, Tableau 2). </li><li> Égoutter le mélange de réaction. </li><li> Ajouter 7 ml de pipéridine à 20% dans le DMF avec 0,1 M de HOBt à la réaction cartouche navire / polypropylène et incuber pendant 180 secondes (45 W, 75 ° C, Tableau 2). </li><li> Égoutter le mélange de réaction. </li><li> Laver la résine avec du DMF. Ajouter du DMF à la résine pour 120 sec (7 ml 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois. Remarque: En option, mettre en pause la procédure ici et reprendre à une date ultérieure. </li></ol></li><li> Après acide aminé étape de couplage, laver la résine avec du DCM et de stocker pendant au moins plusieurs jours à 4 ° C (pour une période plus longue magasin la résine à - 20 ° C). <ol><li> Déplacer la résine de la cuve de réaction à une cartouche de polypropylène. </li><li> Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li><li> Sceller la cartouche de polypropylène étroitement avec un capuchon et robinet. </li><li> Avant de commencer une nouvelle synthèse, gonfler la résine pendant 3-4 heures dans le DMF (7 ml). </li></ol></li><li> Suivi de la synthèse <ol><li> Utilisez le test de Kaiser (ninhydrine) ou un test Chloranile de déterminer rapidement les progrès de lala synthèse. En option, effectuer une réaction de clivage à petite échelle pour déterminer la pureté et la masse du peptide synthétisé. Voir la section 9. Remarque: Pour de plus amples dépannage voir le tableau 3. </li></ol></li><li> Répétez les étapes 2.1 et 2.2 comme désiré pour synthétiser peptide ciblé: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf). </li></ol> 3. Anhydride / Couplage acide <ol><li> Couplage anhydride <ol><li> Laver la résine avec de la NMP. Ajouter NMP à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li><li> Dissoudre 10 équivalents de l&#39;anhydride correspondant dans de la NMP (5 ml), ajouter 1 équivalent de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) et 10 équivalents de DIEA pour la solution (Tableau 1). </li><li> Ajouter un mélange 10: 10 d&#39;anhydride / DMAP / DIEA à la résine et incubation pendant 300 sec (25: 1W, 75 ° C, Tableau 2). Égoutter la solution. </li><li> Laver la résine avec de la NMP. Ajouter NMP à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li></ol></li><li> Couplage de l&#39;acide <ol><li> Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li><li> Dissoudre 10 équivalents de l&#39;acide dicarboxylique correspondant dans du DMF (5 ml). Ajouter 1 équivalent de DMAP et 10 équivalents de N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIC) à la solution (Tableau 1). </li><li> Pré-activer le mélange en mélangeant pendant 30 min. </li><li> Ajouter le mélange à la résine et incubation pendant 300 sec (25 W, 75 ° C, le tableau 2) et vidanger la solution. </li><li> Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger solution. Répétez l&#39;étape trois fois. </li></ol></li></ol> 4. N-méthyltrityle (MTT) Protéger Groupe Déprotégerion Remarque: La chaîne latérale de la lysine est protégée avec le N-méthyltrityle (Mtt) 81, un groupe protecteur qui peut être sélectivement déprotégé dans des conditions acides labiles 82,83. Groupe déprotègent Mtt protéger manuellement sur un agitateur sans énergie à micro-ondes. <ol><li> Transférer la résine à une cartouche de polypropylène équipé de capuchon de bougie et robinet. </li><li> Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li><li> Ajouter 15 à 25 ml d&#39;un mélange de 1% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA), 5% de triisopropylsilane (TIS), et 94% de DCM à la cartouche de polypropylène par gramme de résine. Remarque: TFA est un acide fort et corrosif et est extrêmement irritant pour la peau, les yeux et les tissus pulmonaires. <ol><li> Garder solutions concentrées de TFA dans la hotte à tout moment. </li><li> Utiliser un équipement de protection individuelle approprié (protection oculaire, une blouse et des gants) et le travail dans une hotte bien ventilée. Changer rapidement les gantssi elles entrent en contact avec du TFA et immédiatement nettoyage des déversements. Si la peau ou les yeux entrent en contact avec l&#39;acide, rincez la zone affectée immédiatement avec de l&#39;eau et laver pendant 15 min supplémentaires. </li></ol></li><li> Placez la cartouche de polypropylène sur un agitateur et agiter pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Égoutter la solution à partir de la cartouche de polypropylène par application d&#39;un vide. </li><li> Répétez les étapes 4.3-4.5, trois fois. </li><li> Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois. </li></ol> 5. La cyclisation du peptide linéaire <ol><li> Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois. </li><li> Dans un tube en polypropylene de 50 ml, dissoudre 5 équivalents de benzotriazole-ly 1-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) de dibromométhane (DBM, 5 ml) et 10 équivalents de DIEA ajouter à la solution (Tableau 1). </li><li&gt; Ajouter le mélange à la résine et incuber pendant 300 secondes (25 W, 75 ° C, tableau 2). Égoutter la solution. </li><li> Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois. </li></ol> 6. Le clivage et la déprotection des chaînes latérales <ol><li> Laver la résine avec du DCM et de l&#39;éther diéthylique. <ol><li> Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répéter deux fois. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique à la résine pour 120 sec (7 ml, 0 W, température ambiante) et vidanger la solution. Répéter deux fois. </li></ol></li><li> On sèche la résine sous vide dans un dessiccateur à température ambiante pendant au moins 3 heures sur de l&#39;hydroxyde de potassium (KOH, 10.1 g). </li><li> Peser la résine séchée et le transférer sur une cartouche en polypropylène. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;acide trifluoroacétique à un (TFA) clivage cocktail pré-refroidi (par exemple, 90% de TFA, 2,5% d&#39;eau, 2,5% de TIS et 5% de phénol) pour chaque gramme de résine. </li><li> Agiter pendant 3 heuresà la température ambiante. </li><li> Recueillir la solution de clivage TFA par filtration de la résine dans un tube de polypropylene de 50 ml. Pour la filtration, en utilisant la fritte qui se trouve dans la cartouche 12 ml en polypropylene. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique froid (35 ml) au tube. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 1207 g à 4 ° C. </li><li> Décanter la couche d&#39;éther. </li><li> Répétez l&#39;étape 6,7-6,9, cinq fois. </li></ol> 7. Le séchage du Backbone peptide cyclique <ol><li> Gardez le peptide précipité dans le même tube et le sécher dans une hotte pendant 30 min. </li><li> On dissout le peptide dans un mélange 1: 1 d&#39;eau et d&#39;acétonitrile (ACN). </li><li> Congeler la solution finale du produit dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Lyophiliser le produit final. </li></ol> 8. Caractérisation du Backbone peptide cyclique <ol><li> Dissoudre un petit échantillon (1 mg) du produit dans l&#39;eau (400 ul). </li><li> Injecter le peptide dissous (10 à 200 ul) à un liquide à haute performance en phase inverse chromatography système (RP-HPLC) pour tester la pureté du peptide 34. </li><li> Vérifiez la masse du peptide en utilisant la spectrométrie de masse par désorption laser assistée par matrice ionisation (MALDI-MS) 84. <ol><li> Mélanger 1 pi (100 pM) peptide dans un mélange 1: (v / v) d&#39;acétonitrile 1: eau avec 1 pl de matrice (acide 5 mg / ml, α-cyano-4-hydroxycinnamique) dans un mélange 1: 1 (v / v) d&#39;acétonitrile: eau avec du TFA (0,1%). </li><li> Spot 1 pl sur la plaque MS-MALDI. </li><li> Sécher l&#39;échantillon et le placer dans le spectromètre de masse. </li></ol></li><li> Peser le peptide et de calculer le rendement de pour cent. </li><li> Conserver à -20 ° C. </li></ol> 9. Suivi de la Synthèse <ol><li> Kaiser (ninhydrine) Test 85 <ol><li> Préparer les solutions de réactifs. <ol><li> Préparer la solution A en dissolvant 16,5 mg de cyanure de potassium (KCN) dans 25 ml d&#39;eau distillée. Diluer 1 ml de la solution ci-dessus avec 49 ml de pyridine. </li><li> Préparer la solution Bpar dissolution de 1 g de ninhydrine dans 20 ml d&#39;éthanol. </li><li> Préparer la solution C en dissolvant 40 g de phénol dans 20 ml d&#39;éthanol. </li></ol></li><li> Utilisez le test de Kaiser pour vérifier l&#39;achèvement du couplage de l&#39;acide aminé ou la déprotection du groupe protecteur. <ol><li> Transférer quelques perles de la résine dans un tube à essai. </li><li> Ajouter trois gouttes (~ 100 pi) de chaque solution (A, B et C) et mélanger. </li><li> Chauffer le tube à essai sur un bloc chauffant à 110 ° C pendant 5 min. Note: perles de couleur bleue (résultat positif) indiquent réaction de couplage incomplet ou déprotection du groupe protecteur Fmoc. </li></ol></li></ol></li><li> Chloranile essai 86 <ol><li> Préparer les réactifs suivants fraîches pour chaque test. <ol><li> Préparer une solution à 2% de chloranile dans du DMF, la solution A. </li><li> Préparer une solution de 2% de l&#39;acétaldéhyde dans le DMF, la solution B. </li></ol></li><li> Effectuer le test Chloranile pour vérifier l&#39;achèvement du couplage de l&#39;acide aminé ou til déprotection du groupe protecteur. <ol><li> Mélanger 100 ul de solution A avec 100 ul de solution B dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Déposez les billes et secouez doucement pendant 5 min. Remarque: perles de couleur brun foncé (résultat positif) indiquent déprotection du groupe protecteur Fmoc ou une réaction de couplage incomplet. </li></ol></li></ol></li><li> Réaction de clivage à petite échelle <ol><li> Retirer une petite quantité de résine pour une cartouche de polypropylène de 3 ml muni de capuchon de bougie et robinet. </li><li> Traitez-les avec un mélange de 2 ml de TFA à 95%, 2,5% d&#39;eau et 2,5% TIS. </li><li> Agiter le mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Éliminer la résine par filtration en utilisant la fritte de la cartouche de polypropylène et évaporer les solvants par un courant d&#39;azote. </li><li> Dissoudre le résidu dans l&#39;eau et analyser le produit par HPLC et / ou MS. </li></ol></li></ol> 10. Leishmania donovani Promastigote viabilité Culture Assay <ol> &lt;li&gt; Leishmania donovani (L. donovani) Les conditions de croissance et de traitement <ol><li> Culture L. donovani promastigotes dans la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec 4,5 g / L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium à 26 ° C. </li><li> Traiter le L. donovani promastigotes avec des peptides cycliques (100 uM) pendant 24 heures à 26 ° C. </li></ol></li><li> Leishmania donovani (L.donovani) test de viabilité <ol><li> Évaluer la viabilité parasite avec 20 ul alamarBlue selon le protocole du fabricant. </li><li> Déterminer la réduction alamarBlue en mesurant la fluorescence (à 570 nm et 590 nm excitation émission). Des valeurs plus élevées de fluorescence indiquent une plus grande activité métabolique et l&#39;augmentation de la viabilité du parasite. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La synthèse d&#39;une bibliothèque focalisée du squelette des peptides cycliques dérivés de la protéine LACK du parasite Leishmania utilisant un synthétiseur à micro-ondes est décrit entièrement automatisé. Une bibliothèque de peptides cycliques ciblée a été développé avec pharmacophores conservées et divers linkers. L&#39;addition de divers agents de liaison tels que l&#39;anhydride glutarique, l&#39;anhydride succinique, l&#39;acide adipique, l&#39;acide pimélique, la lysine, l&#39;ornithine, et d&#39;autres ...

Interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans la plupart des processus biologiques, de transduction du signal intracellulaire à la mort cellulaire 1. Par conséquent, en ciblant les IPP est d&#39;une importance fondamentale à la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. IPP peuvent être réglés par des anticorps spécifiques et stables, mais les anticorps sont coûteux et difficiles à fabriquer et ont une faible biodisponibilité. Alternativement, les IPP peuvent être ciblées par de petites molécules. Les petites molécules sont plus faciles à synthétiser et à bon marché par rapport à des anticorps; cependant, ils sont relativement moins flexible et correspondent mieux aux petites et grandes cavités à des interfaces protéine-protéine 2,3. Diverses études ont démontré que les peptides, qui sont plus simples et moins coûteux que des anticorps et plus flexibles que les petites molécules, peuvent se lier à des interfaces de protéine et réguler IPP 4,5. Le marché mondial du peptide thérapeutique a été évalué autour de quinze milliards de dollars en 2013 et est en croissance de 10,5% annually 6. En outre, il ya plus de 50 peptides, commercialisés autour de 270 peptides dans les différentes phases des essais cliniques, et environ 400 peptides en phase préclinique avancé 7. Bien que de nombreux peptides sont utilisés comme médicaments, peptides posent encore plusieurs défis qui limitent leur application généralisée, y compris une faible biodisponibilité et la stabilité, l&#39;inefficacité dans les membranes cellulaires de passage, et la flexibilité conformationnelle 8,9. Une alternative à surmonter ces inconvénients consiste à appliquer différentes modifications telles que (acide D-aminé et N-alkylation) local et global (cyclisation) 8,10-12 contraintes. Ces modifications se produisent aussi naturellement. Par exemple, la cyclosporine A, un peptide cyclique naturel immunosuppresseur, contient un acide D-aminé unique et subit des modifications N-alkylation 13,14. La modification des acides aminés naturels à induire des contraintes locales, telles que D et N-alkylation, affecte souvent le peptide9, de l&#39;activité biologique. Cependant, la cyclisation, dans laquelle la séquence d&#39;intérêt peut rester le même, est plus susceptible de conserver une activité biologique. Cyclisation est un moyen très attractif pour restreindre l&#39;espace conformationnel peptide en réduisant l&#39;équilibre entre les différentes conformations. Il augmente généralement l&#39;activité biologique et la sélectivité en limitant le peptide de la conformation active qui médie une seule fonction. La cyclisation améliore également la stabilité du peptide en maintenant le peptide dans une conformation qui est moins reconnu par les enzymes de dégradation. En effet, les peptides cycliques se sont avérés avoir une meilleure stabilité métabolique, la biodisponibilité et la sélectivité par rapport à leurs homologues linéaires 15-17. Cependant, la cyclisation peut être une arme à double tranchant puisque, dans certains cas, la restriction peut empêcher les peptides d&#39;atteindre une conformation bioactive. Pour surmonter cet obstacle, une bibliothèque ciblée dans laquelle tous les peptides ont la même sequenc primairee et par conséquent constants pharmacophores peuvent être synthétisés. Peptides dans la bibliothèque diffèrent des paramètres qui influent sur ​​leur structure, tels que la taille et la position de l&#39;anneau, afin de dépister la suite pour la conformation la plus bioactive 9,18. Peptides peuvent être synthétisés à la fois en solution et une approche par synthèse peptidique en phase solide (SPPS), qui est maintenant l&#39;approche de la synthèse des peptides plus répandue et seront discutés plus loin. SPPS est un processus par lequel les transformations chimiques sont réalisées sur un support solide par l&#39;intermédiaire d&#39;un lieur pour préparer une large gamme de composés synthétiques 19. SPPS permet d&#39;assemblage peptides par couplage consécutif d&#39;acides aminés par étapes à partir de l&#39;extrémité C-terminale, qui est fixé à un support solide, à l&#39;extrémité N-terminale. Les chaînes latérales d&#39;acide N-a-aminés doivent être masqués par des groupes protecteurs qui sont stables dans les conditions réactionnelles utilisées au cours de l&#39;allongement de peptide pour assurer l&#39;addition d&#39;un acide aminé par rep. Dans l&#39;étape finale, le peptide est libéré de la résine et la chaîne latérale sont des groupes protecteurs de façon concomitante enlevé. Bien que le peptide est synthétisé, tous les réactifs solubles peuvent être éliminés à partir de la matrice de support solide de peptides par filtration et lavés à la fin de chaque étape de couplage. Avec un tel système, un grand excès de réactifs à forte concentration peut conduire les réactions de couplage à l&#39;achèvement et à toutes les étapes de synthèse peuvent être effectuées dans le même récipient sans aucun transfert de matériel 20. Bien SPPS a quelques limitations telles que la production de réactions incomplètes, des réactions secondaires, des réactifs impurs, ainsi que les difficultés de suivi de la réaction 21, les avantages de la SPPS ont fait le «gold standard» pour la synthèse peptidique. Ces avantages comprennent la possibilité d&#39;incorporer des acides aminés non naturels, l&#39;automatisation, la purification facile, pertes physiques réduites, et l&#39;utilisation de réactifs en excès, résultant endes rendements élevés. SPPS a été montré pour être extrêmement utile dans la synthèse de séquences difficiles 21,22 fluorescents, des modifications 23 et des banques de peptides 24,25. SPPS est également très utile pour d&#39;autres ensembles de poly-chaîne tels que des oligonucleotides, des oligosaccharides 28,29 26,27 et 30,31 acides nucléiques peptidiques. Fait intéressant, dans certains cas, SPPS a été montré qu&#39;il était avantageux pour la synthèse de petites molécules qui sont traditionnellement fabriqués en solution 32,33. SPPS est utilisé à la fois sur une petite échelle pour la recherche et l&#39;enseignement ainsi que 34,35 à grande échelle dans l&#39;industrie 36-38. Deux stratégies de synthèse qui sont utilisés principalement dans la méthode SPPS pour la synthèse de peptides sont butyloxycarbonyle (Boc) et 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc). La stratégie originale a été introduit pour SPPS Boc, ce qui nécessite des conditions fortement acides pour éliminer la chaîne latérale et les groupes protecteurs de cliver le peptide de la resin. La synthèse des peptides à base de Fmoc, cependant, utilise des conditions modérées de base et est une alternative plus doux au protocole Boc labile en milieu acide 39. La stratégie Fmoc utilise de t-butyle (tBu) la protection de la chaîne latérale orthogonale qui est enlevée lors de la dernière étape de la synthèse tandis que le clivage du peptide de la résine dans des conditions acides. Le principe général pour la synthèse peptidique sur support solide est présentée dans la figure 1. L&#39;acide aminé initial, masqué par un groupe protecteur temporaire sur le N-α-terminale, est chargé sur la résine à partir de l&#39;extrémité C-terminale. Un groupe protecteur semi-permanent pour masquer la chaîne latérale est également utilisé le cas échéant (figure 1, étape 1). La synthèse du peptide cible est assemblée à partir de l&#39;extrémité C-terminale à l&#39;extrémité N-terminale par des cycles répétitifs de déprotection du groupe protecteur N-α-temporaire (figure 1, étape 2) et de couplage du prochain acide aminé protégé (Figure 1 </str<html> ong&gt;, étape 3). Après le dernier acide aminé est chargé (Figure 1, étape 4), le peptide est clivé à partir du support de résine et les groupes protecteurs semi-permanentes sont enlevés (figure 1, étape 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma général de synthèse de peptides en phase solide. L&#39;acide aminé N-α-protégé est ancrée à l&#39;aide du groupe carboxyle par l&#39;intermédiaire d&#39;un lieur à la résine (étape 1). Le peptide souhaité est assemblé de manière linéaire à partir de l&#39;extrémité C-terminale à l&#39;extrémité N-terminale par des cycles répétitifs de déprotection du groupe temporaire de protection (TPG) à partir du N-α (étape 2) et le couplage d&#39;acides aminés (étape 3). Après l&#39;accomplissement de la synthèse (étape 4), les groupes protecteurs semi-permanents (SPG) sont déprotégés pendant clivage du peptide (étape 5).obtenir = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Après assemblage de la chaîne peptidique complète, cyclisation peut être réalisé en plusieurs alternatives: (A) en tête-à-queue cyclisation - ce qui est un moyen pratique, mais limité, car il donne une seule option pour la cyclisation (figure 2A), (B) cyclisation en utilisant les acides aminés provenant de la séquence d&#39;intérêt qui contiennent des groupes fonctionnels bioactifs - cependant, l&#39;utilisation de ces acides aminés peut influer sur l&#39;activité biologique (figure 2B), et (C) la cyclisation par addition d&#39;acides aminés (ou d&#39;autres éléments de base) sans perturber la séquence bioactive. L&#39;introduction de ces molécules est très répandue car elle permet la production des banques focalisées sans modifier la séquence d&#39;intérêt (figure 2C). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" /> Figure 2. stratégies peptide alternatif de cyclisation (A) de tête à la queue cyclisation, par le biais d&#39;une liaison peptidique entre l&#39;extrémité C-terminale et N-terminale.; (B) la cyclisation entre les groupes fonctionnels comme une liaison disulfure entre les résidus de cysteine ​​(1), ou une liaison amide entre les chaînes latérales de la lysine à aspartique / acide glutamique (2), ou une chaîne latérale d&#39;extrémité N- ou C-terminale (3 -4); (C) cyclisation en ajoutant des acides aminés supplémentaires ou des dérivés d&#39;acides aminés ou de petites molécules, par exemple avant (R0) et après (R7), la séquence bioactif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Synthèse utilise irradiation micro-ondes pour chauffer réactions, accélérant ainsi chimique organique assistée par micro-ondes transformations 40,41. Chimie des micro-ondes est fondé sur la capacité du réactif / solvant pour absorber lemicro-ondes de l&#39;énergie et le convertir en chaleur 42. Avant la technologie est répandue, des inconvénients majeurs ont dû être surmontés, y compris la contrôlabilité et la reproductibilité des protocoles de synthèse et le manque de systèmes disponibles pour température et de pression des contrôles adéquats 43,44. Le premier rapport de synthèse peptidique assistée par micro-ondes a été effectué en utilisant un four micro-ondes de cuisine pour synthétiser plusieurs peptides courts (7-10 acides aminés) avec une amélioration significative de l&#39;efficacité de couplage et la pureté 45. De plus, l&#39;énergie de micro-ondes a été montré pour diminuer l&#39;agrégation de chaîne, de réduire les réactions secondaires, limiter la racémisation, et améliorer le taux de couplage, qui sont tous essentiels pour les séquences difficiles et longues 46-53. Actuellement, l&#39;utilisation de l&#39;irradiation de micro-ondes pour la synthèse de peptides ou de composés apparentés sur un support solide est très étendue, y compris: (A) synthèse dans l&#39;eau au lieu de 54 solvant organique; (B) synthèse de peptides avecmodifications post-traductionnelles communs, tels que les glycopeptides ou les phosphopeptides 59-61 55-58, dont la synthèse est typiquement difficile en raison de la faible efficacité de couplage de dérivés d&#39;acides aminés à encombrement stérique; (C) la synthèse de peptides à modification dans le squelette, tels que azapeptides, qui peuvent être formés par le remplacement de la C (α) d&#39;un résidu d&#39;acide aminé par un atome d&#39;azote 62, ou peptoïdes, dont la chaîne latérale est reliée à la amide de l&#39;azote plutôt que l&#39;atome Ca 63,64; (D) la synthèse de peptides cycliques 65-71; et (E) synthèse de bibliothèques combinatoires 51,72. Dans de nombreux cas, les auteurs ont rapporté une plus grande efficacité et une réduction du temps de synthèse en utilisant irradiation micro-ondes par rapport au protocole classique. En utilisant une conception rationnelle 73-75, nous avons développé des peptides anti-parasitaires qui ont été tirées de la récepteurs de l&#39;échafaud L eishmania for activé C-kinase (manque). MANQUE joue un rôle important dans la phase précoce de l&#39;infection Leishmania 76. Les parasites exprimant des niveaux inférieurs de l&#39;absence ne parviennent pas à parasiter les souris immunodéprimées même 77 que le manque est impliqué dans les processus de signalisation de parasites essentiels et la synthèse des protéines 78. Par conséquent, MANQUE est une protéine d&#39;échafaudage clé 79 et une cible de médicament précieux. En se concentrant sur ​​des séquences en manque qui sont conservés dans les parasites, mais pas chez l&#39;hôte mammifère homologue RACK, nous avons identifié un peptide de 8 acides aminés (RNGQCQRK) que la diminution de Leishmania sp. Viabilité dans la culture. Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse du squelette cyclique des peptides dérivés de la séquence de la protéine LACK décrit ci-dessus. Les peptides ont été synthétisés sur un support solide en utilisant un chauffage par micro-ondes par la méthode SPPS Fmoc avec protocole / tBu. Les peptides ont été conjugués à un TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) transporteur peptide par une liaison amide commepartie de la SPPS. Le transport d&#39;une variété de cargaisons dans des cellules à base de TAT a été utilisé pendant plus de 15 ans et la livraison de la cargaison dans des organites intracellulaires a été confirmée 80. Quatre groupes de liaison différents, succinique et l&#39;anhydride glutarique adipique, ainsi que et l&#39;acide pimélique, ont été utilisés pour effectuer la cyclisation pour produire des lieurs d&#39;acides carboxyliques de deux à cinq atomes de carbone. La cyclisation a été effectuée en utilisant une énergie hyperfréquence, et le clivage de la chaîne latérale et les dernières étapes de déprotection a été effectuée manuellement sans énergie micro-ondes. L&#39;utilisation d&#39;un synthétiseur automatisé de micro-ondes a amélioré la pureté du produit, a augmenté le rendement en produit, et de réduire la durée de la synthèse. Ce protocole général peut être appliqué à d&#39;autres études qui utilisent des peptides de comprendre le mécanisme moléculaire important dans vitro et in vivo et de développer des médicaments potentiels pour des maladies humaines.

<table><tbody><tr><td><fort>RÉACTIFS</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support solide, Rink Amide AM résine ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>Chargement : 0.49 mmol/g</td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asn(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-ASP(OBut)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(But)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-Méthyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td><td>Sigma</td><td>328634</td><td><fort>Prudence</fort> Toxique/Hautement inflammable/Irritant.</td></tr><tr><td>N,N-Diméthylformamide (DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43465</td><td><fort>Prudence</fort> Toxique. 
Utilisez du DMF de haute qualité pour éliminer les réactions secondaires telles que l’élimination du Fmoc à la suite des traces de diméthylamine de la décomposition du DMF.</td></tr><tr><td>Dichlorométhane (DCM)</td><td>Sigma</td><td>D65100</td><td><fort>Attention</fort></td></tr><tr><td>Dibromométhane nocif (DBM)</td><td>Sigma</td><td>D41868</td><td><fort>Attention</fort></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique nocif (TFA)</td><td>Sigma</td><td>T62200</td><td><fort>Attention</fort> Corrosif/</td></tr><tr><td>Toxique Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Sigma</td><td>91707</td><td><fort>Attention</fort> Corrosif/Toxique</td></tr><tr><td>Diéthyléther</td><td>Sigma</td><td>31690</td><td><fort>Attention</fort> Hautement inflammable/Nocif</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane (TIS)</td><td>Sigma</td><td>233781</td><td><fort>Attention</fort> Eau irritante/inflammable</td></tr><tr><td>, Grade HPLC</td><td>Sigma</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitroile, grade HPLC (ACN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td><fort>Prudence</fort> Inflammable/Irritant/Nocif</td></tr><tr><td>N,N-Diisopropyléthylamine (DIEA)</td><td>Sigma</td><td>3440</td><td><Fort>Attention</fort> Corrosif/Hautement inflammable</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma</td><td>W290807</td><td><fort>Prudence</fort> Toxique/Hautement inflammable</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma</td><td>270970</td><td><fort>Attention</fort> Hautement inflammable/Nocif</td></tr><tr><td>Éthanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td><fort>Attention</fort> Hautement inflammable/Irritant</td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole hydraté (HOBt)</td><td>Sigma</td><td>157260</td><td><fort>Attention</fort> Hautement inflammable/Irritant/Nocif</td></tr><tr><td>O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N&prime ;,N&prime ; - hexafluorophosphate de tétraméthyluronium (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td><fort>Attention</fort> Irritant/Nocif</td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)</td><td>Advanced Chemtech</td><td>RC8602</td><td><fort>Prudence</fort> Irritant</td></tr><tr><td>Ninhydrine</td><td>Sigma</td><td></td> <td>454044<fort>Attention</fort> Nocif</td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Sigma</td><td>P3653</td><td><fort>Attention</fort> Corrosif/</td></tr><tr><td>Toxique Cyanure de potassium (KCN)</td><td>Sigma</td><td>11813</td><td><fort>Attention</fort> Très toxique</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td><fort>Attention</fort> Toxique</td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)</td><td>Sigma</td><td>38370</td><td><fort>Attention</fort> Inflammable/ Toxique</td></tr><tr><td>4-Diméthylaminopyridine (DMAP)</td><td>Sigma</td><td>522805</td><td><fort>Attention</fort> Toxique/Irritant</td></tr><tr><td>Anhydride glutarique</td><td>Sigma</td><td>G3806</td><td><fort>Attention</fort> Inflammable/Irritant/Nocif</td></tr><tr><td>Anhydride succinique</td><td>Sigma</td><td>239690</td><td><fort>Attention</fort> Irritant/Nocif</td></tr><tr><td>Acide adipique</td><td>Sigma</td><td>A26357</td><td><fort>Attention</fort> Toxique/Irritant</td></tr><tr><td>Acide pimélique</td><td>Sigma</td><td>P45001</td><td><fort>Attention</fort> Toxique/Irritant</td></tr><tr><td>Chloranil</td><td>Sigma</td><td>23290</td><td><fort>Attention</fort> Toxique/Irritant</td></tr><tr><td>Acétaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>402788</td><td><fort>Attention</fort> Inflammable/ Toxique</td></tr><tr><td><fort>ÉQUIPEMENT</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R Lyophilisateur</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labconco</td><td>freezone 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Franklin Electric</td><td>modèle 1101101416 avec 3/4 CV</td><td>Alcatel pompe avec moteur Franklin&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cartouche en polypropylène 12 ml</td><td>Séparation appliquée</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon pour cartouche en polypropylène de 12 ml</td><td>Séparation appliquée</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche en polypropylène 3 ml</td><td>Séparation appliquée</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon pour cartouche en polypropylène de 3 ml</td><td>Séparation appliquée</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>Robinets d’arrêt PTFE</td><td>Séparation appliquée</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>Tubes plats, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur d’extraction, 20 pos, 16 tubes de 100 mm</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Shaker, BD adams nutator mixeur</td><td>Fisher scientific</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene HDPE à col étroit IP2 flacons, 125&nbsp ; ml</td><td>Fisher scientific</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-501, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Thermolyne</td><td>1760 bain</td><td></td>sec</tr><tr><td>Tubes jetables en verre borosilicaté à extrémité lisse</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes et pointes Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&ndash ; 200 et 100&ndash ; 1 000 &mu ; </td><td></td>l</tr><tr><td>Flacons HPLC - micro vl pp 400 & micro ; l PK100&nbsp ; &nbsp ;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>Flacon HPLC - Bouchon Snap-It bleu</td><td>VWR</td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HPLC analytique</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 &micro ; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm</td></tr><tr><td>Colonne HPLC Prep, XBridge&nbsp ;</td><td>Eaux</td><td>OBD C18 5 & micro ; m colonne</td><td>19 mm &times ; 150 mm</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse</td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager DE-RP&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td></td><td></td><td></td></tr> à <tr><td>cylindre</td><td></td><td></td><td></td>d’azote</tr><tr><td>Système analytique RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>équipé de : contrôleur de système CBM-20A, détecteur SPD-20A, four à colonne CTO-20A, 2 x unité de distribution de solvant LC-20AD, passeur d’échantillons SIL-20AC, dégazeur DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).</td></tr><tr><td>Système préparatif RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>équipé de : contrôleur de système CBM-20A, détecteur SPD-20A, four à colonne CTO-20A, 2 unités de distribution de solvant LC-6AD et collecteur de fractions FRC-10A (Shimadzu, MD, États-Unis).</td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un backbone peptide cyclique bibliothèque en tant que potentiel antiparasitaires therapeutics utilisation irradiation micro-ondes

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Interactions protéine-protéine (IPP) sont intimement impliqués dans la plupart des processus biologiques et sont liées à de nombreuses maladies humaines. Par conséquent, il ya un effort important de cibler les IPP en recherche fondamentale et dans l&#39;industrie pharmaceutique. Interfaces protéine-protéine sont généralement de grande taille, plat, et manquent souvent des poches, ce qui complique la découverte de petites molécules qui ciblent ces sites. Les approches de ciblage alternatifs utilisant des anticorps ont des limitations dues à la biodisponibilité orale pauvre, faible perméabilité cellulaire, et l&#39;inefficacité de la production. Utilisation de peptides pour cibler interfaces PPI présente plusieurs avantages. Les peptides ont flexibilité conformationnelle plus élevée, une sélectivité accrue, et sont généralement peu coûteux. Cependant, les peptides ont leurs propres limites, y compris une mauvaise stabilité et l&#39;inefficacité de traverser les membranes cellulaires. Pour surmonter ces limitations, un peptide cyclisation peut être effectuée. Cyclisation a été démontré pour améliorer la sélectivité peptide, La stabilité métabolique et la biodisponibilité. Cependant, la prédiction de la conformation bioactive d&#39;un peptide cyclique est pas trivial. Pour surmonter ce défi, une approche attrayante pour cribler une banque ciblée à l&#39;écran dans lequel tous les peptides cycliques de squelette ont la même séquence primaire, mais diffèrent dans les paramètres qui influent sur leur conformation, tels que la taille et la position de l&#39;anneau. Nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse d&#39;une bibliothèque de peptides cycliques backbone ciblant IPP de parasites spécifiques. En utilisant une approche de conception rationnelle, nous avons développé des peptides dérivés du récepteur L eishmania de protéines d&#39;échafaudage C-kinase activée (manque). Nous émettons l&#39;hypothèse que les séquences A défaut qui sont conservés dans parasites, mais pas dans l&#39;homologue hôte de mammifère, peuvent représenter des sites d&#39;interaction pour des protéines qui sont essentiels pour la viabilité des parasites. Les peptides cycliques ont été synthétisés par irradiation micro-ondes pour réduire les temps de réaction et d&#39;augmenterEfficacité. Développer une bibliothèque de peptides cycliques backbone avec différentes tailles d&#39;anneaux facilite un écran systématique de la conformation active plus biologique. Cette méthode fournit une manière générale, rapide et facile à synthétiser des peptides cycliques.

Nous décrivons ici le développement d&#39;une petite bibliothèque ciblée de la colonne vertébrale des peptides cycliques qui ciblent spécifiquement les IPP vitaux du parasite Leishmania et agir en tant qu&#39;agents antiparasitaires (pour avis sur les peptides qui ciblent les IPP comme agents antiparasitaires 87). Grâce à la synthèse de nouveaux backbone peptides cycliques, pharmacophores sont conservées dans un échafaudage de taille extensible. La force de la bibliothèque focalisée proposé ici est l...

Une méthode simple et générale de synthèse de peptides cycliques par irradiation par micro-ondes est décrite. Cette procédure permet la synthèse de peptides cycliques de squelette avec une collection de conformations différentes tout en conservant les chaînes latérales et les fractions pharmacophoriques, et permet donc de dépister la conformation bioactive.

Développement d&#39;un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

L'objectif général de cette procédure est de développer une bibliothèque ciblée de peptidomimétiques cycliques sur l'armature principale présentant une diversité conformationnelle, en utilisant l'irradiation micro-ondes pour de nouveaux traitements antiparasitaires. Cette méthode peut aider à concevoir des outils innovants permettant de cibler spécifiquement les interactions protéine-protéine. Pour commencer cette procédure, ajouter 2,5 millilitres de l'acide aminé souhaité, un millilitre d'activateur et 0,5 millilitre de base activateur dans une cartouche en polypropylène.Placer la cartouche dans un synthétiseur micro-ondes automatisé et laisser la réaction de couplage se dérouler pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius. Une fois la réaction terminée, laver la résine avec sept millilitres de N,N-diméthylformeamide, ou DMF, pendant 120 secondes à température ambiante. Après avoir répété l'étape précédente cinq fois, ajouter sept millilitres de 20 % de pipéridine dans le DMF contenant 0,1 molaire de 1-hydroxybenzotriazole, ou HOBt, à la cartouche en polypropylène et incuber pendant 30 secondes à 45 watts et 75 degrés Celsius.Lorsque la réaction est terminée, éliminer le

development-backbone-cyclic-peptide-library-as-potential

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Le protocole suivant fournit des techniques d'encapsulation du pancréas β-cellules à l'étape de croissance PEG-peptide hydrogels formés par thiol-ène photo-cliquez réactions. Cette plate-forme matérielle offre non seulement un micro-cytocompatible pour l'encapsulation de cellules, mais permet également contrôlé par l'utilisateur récupération rapide des structures cellulaires formés dans les hydrogels.

Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l&#39;étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-

Cette vidéo d'illustration, un procédé rapide et efficace de méthacrylate de poly (éthylène glycol), permettant à des polymérisations en chaîne et la synthèse de l'hydrogel. Il démontrera comment introduire similaire fonctionnalités de méthacrylamide en peptides, les méthodes d'analyse communs de détail pour évaluer l'efficacité de la fonctionnalisation, des suggestions pour le dépannage et les modifications avancées, et la démonstration de techniques typiques hydrogel de caractérisation.

La fonctionnalisation assistée par micro-ondes de poly (éthylène glycol) et peptides sur-résine pour l&#39;utilisation dans la polymérisation en chaîne et de la Formation hydrogel

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Nous décrivons ici une méthode synthétique qui combine à la fois divisée et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un une bille bibliothèque d'un composé de PTA.

Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

Un protocole de synthèse de peptoïdes à fonctionnalité cationique mixte dans la même séquence est présenté (monomères de type lysine et arginine). Des essais ultérieurs de ces composés contre Leishmania mexicana, les parasites protozoaires qui causent la leishmaniose cutanée, sont également décrits.

Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l&#39;évaluation de leur activité anti-leishmaniose

Ce protocole présente la synthèse de peptides cycliques via la bisalkylation entre la cystéine et la méthionine et la réaction thiol-yne facile déclenchée par le centre propargylsulfonium.

Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache

Ce protocole décrit la synthèse de peptides cycliques pénétrant dans les cellules avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques.

Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Un appareil simple, peu coûteux et novateur pour effectuer des synthèses de peptides en phase solide dans un réacteur à micro-ondes commercial est présenté.

Une adaptation peu coûteuse d’un réacteur à micro-ondes commercial pour la synthèse de peptides en phase solide

Ce protocole décrit une méthode pour produire et évaluer l’activité antimicrobienne et la cytotoxicité du peptide cationique Mel4 et du mimétique du peptide RK758. En intégrant la synthèse chimique, l’expression recombinante et les tests fonctionnels standardisés, il offre un flux de travail simplifié pour la production et le test de peptides et de mimiques de petites molécules.

Production et test de peptides antimicrobiens et de leurs mimiques

Des nanoparticules de silice ont été préparées à l’aide de la catalyse acide d’un précurseur de siloxane et de techniques de synthèse assistée par micro-ondes, ce qui a permis d’obtenir une croissance contrôlée de nanomatériaux allant de 30 à 250 nm de diamètre. La dynamique de croissance peut être contrôlée en faisant varier la concentration initiale d’acide silicique, le moment de la réaction et la température de la réaction.

Préparation de nanoparticules de silice Grâce assistée par micro-ondes acide catalyse

Découvrez la synthèse de peptides cycliques par irradiation micro-ondes pour le développement de thérapeutiques antiparasitaires. Cette méthode efficace préserve les chaînes latérales et permet le criblage de conformations bioactives.

Développement dun Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes (Vidéo) | JoVE Journal

Développement d'un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

Explorer plus de vidéos