Développement d'un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

L'objectif général de cette procédure est de développer une bibliothèque ciblée de peptidomimétiques cycliques sur l'armature principale présentant une diversité conformationnelle, en utilisant l'irradiation micro-ondes pour de nouveaux traitements antiparasitaires. Cette méthode peut aider à concevoir des outils innovants permettant de cibler spécifiquement les interactions protéine-protéine. Pour commencer cette procédure, ajouter 2,5 millilitres de l'acide aminé souhaité, un millilitre d'activateur et 0,5 millilitre de base activateur dans une cartouche en polypropylène.

Placer la cartouche dans un synthétiseur micro-ondes automatisé et laisser la réaction de couplage se dérouler pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius. Une fois la réaction terminée, laver la résine avec sept millilitres de N,N-diméthylformeamide, ou DMF, pendant 120 secondes à température ambiante. Après avoir répété l'étape précédente cinq fois, ajouter sept millilitres de 20 % de pipéridine dans le DMF contenant 0,1 molaire de 1-hydroxybenzotriazole, ou HOBt, à la cartouche en polypropylène et incuber pendant 30 secondes à 45 watts et 75 degrés Celsius.

Lorsque la réaction est terminée, éliminer le mélange réactionnel. Ensuite, ajouter sept millilitres de pipéridine à 20 % dans le DMF contenant du HOBt à 0,1 molaire dans la cartouche en polypropylène et incuber pendant 180 secondes à 45 watts et 75 degrés Celsius. Après avoir éliminé le mélange réactionnel, laver la résine avec sept millilitres de DMF pendant 120 secondes à température ambiante.

Ensuite, lavez la résine avec sept millilitres de dichlorométhane, ou DCM, pendant 120 secondes à température ambiante. Pour le couplage avec un anhydride, lavez la résine avec sept millilitres de 1-méthyl-2-pyrrolidinone, ou NMP, pendant 120 secondes à température ambiante. Une fois terminé, éliminez le mélange réactionnel.

Après avoir répété l'étape précédente trois fois, dissoudre 10 équivalents de l'anhydride correspondant dans cinq millilitres de NMP dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ensuite, ajouter un équivalent de 4-diméthylaminopyridine, ou DMAP, et 10 équivalents de N,N-diisopropyléthylamine, ou DIEA, à la solution. Ajouter ce mélange à la résine et incuber pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius.

Après avoir lavé la résine avec du NMP, rincez-la avec sept millilitres de DMF pendant 120 secondes à température ambiante. À ce stade, transférez la résine dans une cartouche en polypropylène équipée d’un bouchon et d’un robinet. Une fois que la résine a été lavée avec du DCM, ajoutez 15 à 25 millilitres d’un mélange composé de 1 % d’acide trifluoroacétique, 5 % de triisopropylsilane et 94 % de DCM par gramme de résine à la cartouche en polypropylène.

Placer la cartouche en polypropylène sur un agitateur et agiter pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer la solution de la cartouche en polypropylène en appliquant un vide. Après avoir répété ces étapes trois fois, laver la résine avec sept millilitres de DCM pendant 120 secondes à température ambiante.

Ces étapes sont très importantes, car on a observé que les groupes protecteurs trityle de plusieurs résines étaient partiellement clivés dans les solutions de chlorure de méthylène et d'acide trifluoroacétique. Le retrait des groupes méthyltrityle est un processus lent qui nécessite plusieurs lavages. Dans un tube en polypropylène de 50 millilitres, dissoudre cinq équivalents de benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate dans cinq millilitres de dibromométhane.

Ensuite, ajouter 10 équivalents de DIEA à la solution. Ajouter le mélange à la résine rincée au DCM et incuber pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius. Après cela, laver la résine avec sept millilitres de DCM pendant 120 secondes à température ambiante.

Après deux lavages avec du DCM, transférez la résine dans une cartouche en polypropylène et lavez deux fois avec de l'éther diéthylique. Sèchez la résine dans un dessiccateur sous vide à température ambiante pendant au moins trois heures sur de l'hydroxyde de potassium. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d'un mélange de clivage à l'acide trifluoroacétique prérefroidi pour chaque gramme de résine.

Placer la cartouche en polypropylène sur un agitateur et agiter pendant 3 heures à température ambiante. Ensuite, recueillir la solution de clivage en filtrant la résine dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ajouter 35 millilitres d'éther diéthylique froid au tube.

Centrifuger pendant cinq minutes à 1 207 × g et à quatre degrés Celsius. Ensuite, décantez la couche éther. Pour le test de Kaiser, préparez la solution A en dissolvant 16,5 milligrammes de cyanure de potassium dans 25 millilitres d'eau distillée.

Diluez un millilitre de la solution avec 49 millilitres de paridine. Ensuite, préparez la solution B en dissolvant un gramme de ninhydrine dans 20 millilitres d'éthanol. Préparez la solution C en dissolvant 40 grammes de phénol dans 20 millilitres d'éthanol.

Une fois les solutions préparées, transférez quelques billes de la résine dans un tube à essai. Ajoutez trois gouttes de chaque solution dans le tube et mélangez. Enfin, chauffez le tube à essai sur un bloc chauffant à 110 degrés Celsius pendant cinq minutes.

La synthèse des peptides cycliques sur l'armature a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatisé à micro-ondes sur support solide, selon le protocole FMOC, t-butyle. Le produit a été analysé par spectrométrie de masse, et son degré de pureté a été déterminé par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le criblage biologique a montré que le peptide pL1 était actif contre Leishmania donovani, un parasite responsable de la leishmaniose viscérale, la forme la plus sévère de leishmaniose chez l'homme.

Le peptide pL1 a réduit la viabilité des parasites de 75 % par rapport au traitement témoin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à cinq jours si elle est effectuée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans de nombreux domaines pour explorer les peptides en tant que régulateurs pharmacologiques dans la recherche fondamentale et les thérapeutiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de concevoir une bibliothèque ciblée de peptidomimétiques présentant une diversité conformationnelle afin de cibler spécifiquement les interactions protéine-protéine. N'oubliez pas que le travail avec l'acide trifluoroacétique peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port d'une protection oculaire, d'une blouse de laboratoire et de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure, qui doit être réalisée dans une hotte bien ventilée.