Développement d'un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

L’objectif global de cette procédure est de développer une banque peptidomimétique cyclique ciblée avec une diversité conformationnelle en utilisant l’irradiation par micro-ondes pour de nouvelles thérapies antiparasitaires. Cette méthode peut aider à développer de nouveaux outils pour cibler spécifiquement les interactions protéine-protéine. Pour commencer cette procédure, ajoutez 2,5 millilitres de l’acide aminé souhaité, un millilitre d’activateur et 0,5 millilitre de base d’activateur dans une cartouche de polypropylène.

Placez la cartouche dans un synthétiseur à micro-ondes automatisé et laissez la réaction de couplage se poursuivre pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius. Une fois la réaction terminée, lavez la résine avec sept millilitres de N, N-diméthylformamide ou DMF, pendant 120 secondes à température ambiante. Après avoir répété l’étape précédente cinq fois, ajoutez sept millilitres de pipéridine à 20 % dans du DMF avec 0,1 molaire de 1-hydroxybenzotriazole, ou HOBt, à la cartouche de polypropylène et incubez pendant 30 secondes à 45 watts et 75 degrés Celsius.

Lorsque vous avez terminé, égouttez le mélange réactionnel. Ensuite, ajoutez sept millilitres de pipéridine à 20 % dans du DMF avec 0,1 molaire HOBt à la cartouche de polypropylène et incubez pendant 180 secondes à 45 watts et 75 degrés Celsius. Après avoir égoutté le mélange réactionnel, lavez la résine avec sept millilitres de DMF pendant 120 secondes à température ambiante.

Ensuite, lavez la résine avec sept millilitres de dichlorométhane, ou DCM, pendant 120 secondes à température ambiante. Pour le couplage anhydride, lavez la résine avec sept millilitres de 1-méthyl-2-pyrrolidinone, ou NMP, pendant 120 secondes à température ambiante. Lorsque vous avez terminé, égouttez le mélange réactionnel.

Après avoir répété l’étape précédente trois fois, dissolvez 10 équivalents de l’anhydride correspondant dans cinq millilitres de NMP dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez un équivalent de 4-diméthylaminopyridine, ou DMAP, et 10 équivalents de N, N-diisopropyléthylamine, ou DIEA, à la solution. Ajoutez ce mélange à la résine et incubez pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius.

Après avoir lavé la résine avec du NMP, lavez-la avec sept millilitres de DMF pendant 120 secondes à température ambiante. À ce stade, transférez la résine dans une cartouche en polypropylène équipée d’un bouchon et d’un robinet d’arrêt. Une fois la résine lavée avec du DCM, ajoutez 15 à 25 millilitres d’un mélange de 1 % d’acide trifluoroacétique, 5 % de triisopropylsilane et 94 % de DCM à la cartouche de polypropylène pour 1 gramme de résine.

Placez la cartouche en polypropylène sur un agitateur et agitez pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, égouttez la solution de la cartouche en polypropylène en appliquant un vide. Après avoir répété les étapes précédentes trois fois, lavez la résine avec sept millilitres de DCM pendant 120 secondes à température ambiante.

Ces étapes sont très importantes, car les groupes protecteurs trityles de plusieurs résines se sont partiellement clivés dans les solutions d’acide DCM-trifluoroacétique. L’élimination des groupes méthyltrityle est un processus lent qui nécessite plusieurs lavages. Dans un tube en polypropylène de 50 millilitres, dissoudre cinq équivalents de benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate dans cinq millilitres de dibromométhane.

Ensuite, ajoutez 10 équivalents de DIEA à la solution. Ajoutez le mélange à la résine rincée au DCM et incubez pendant 300 secondes à 25 watts et 75 degrés Celsius. Ensuite, lavez la résine avec sept millilitres de DCM pendant 120 secondes à température ambiante.

Après deux lavages avec du DCM, transférez la résine dans une cartouche en polypropylène et lavez deux fois avec de l’éther diéthylique. Faites sécher la résine dans un dessiccateur sous vide à température ambiante pendant au moins trois heures sur de l’hydroxyde de potassium. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’un cocktail de clivage d’acide trifluoroacétique pré-refroidi à chaque gramme de résine.

Placez la cartouche en polypropylène sur un agitateur et agitez pendant 3 heures à température ambiante. Ensuite, récupérez la solution de clivage en filtrant la résine dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez 35 millilitres d’éther diéthylique froid dans le tube.

Centrifuger pendant cinq minutes à 1, 207 fois g à quatre degrés Celsius. Ensuite, décantez la couche d’éther. Pour l’essai Kaiser, préparez la solution A en dissolvant 16,5 milligrammes de cyanure de potassium dans 25 millilitres d’eau distillée.

Diluez un millilitre de la solution avec 49 millilitres de péridine. Ensuite, préparez la solution B en dissolvant un gramme de ninhydrine dans 20 millilitres d’éthanol. Préparez la solution C en dissolvant 40 grammes de phénol dans 20 millilitres d’éthanol.

Une fois les solutions préparées, transférez quelques billes de la résine dans un tube à essai. Ajoutez trois gouttes de chaque solution dans le tube et mélangez. Enfin, chauffez le tube à essai sur un bloc chauffant à 110 degrés Celsius pendant cinq minutes.

La synthèse des peptides cycliques du squelette a été réalisée à l’aide d’un synthétiseur à micro-ondes automatisé sur support solide selon le protocole FMOC, t-butyl. Le produit a été analysé par spectrométrie de masse et son degré de pureté a été déterminé à l’aide de la HPLC. Le dépistage biologique a montré que le peptide pL1 était actif contre Leishmania donovani, un parasite responsable de la leishmaniose viscérale, la leishmaniose la plus sévère chez l’homme.

Le peptide pL1 a réduit la viabilité du parasite de 75 % par rapport au traitement témoin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à cinq jours si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans un large éventail de domaines pour explorer les peptides en tant que régulateurs pharmacologiques dans la recherche fondamentale et les thérapies.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer une bibliothèque ciblée de peptidomimétiques avec une diversité conformationnelle pour cibler spécifiquement les interactions protéine-protéine. N’oubliez pas que travailler avec de l’acide trifluoroacétique peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d’une protection oculaire, d’une blouse de laboratoire et de gants lorsque vous travaillez avec une cagoule bien ventilée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.