Constant procédé d'extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

L’objectif global de l’expérience suivante est de présenter une méthode de préparation robuste pour des vésicules lipidiques biologiquement pertinentes. Ceci est réalisé en mélangeant et en transférant des phospholipides dans des flacons en verre et en les hydratant avec un tampon aqueux pour créer une suspension SLE à plusieurs lamelles. Dans un deuxième temps, une méthode de congélation et de décongélation est effectuée, ce qui aboutit ensuite à la production de vésicules Ella à partir de vésicules à plusieurs lamelles.

Ensuite, la suspension de liposomes passe à travers une extrudeuse en utilisant la pression optimale déterminée pour produire des vésicules lipidiques homogènes de la taille souhaitée. Des résultats ont été obtenus qui montrent des tailles de vésicules submicroniques cohérentes basées sur la diffusion dynamique de la lumière et l’analyse de suivi des nanoparticules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la sonication et la sédimentation est qu’elle utilise un système de contrôle de la pression avec des débits d’azote déterminés optimaux pour une préparation efficace de la taille des vésicules lipidiques.

Pour commencer cette procédure, récupérez un flacon en verre de 20 millilitres avec un bouchon doublé de téflon, nettoyez toute la verrerie et les seringues avec du chloroforme avant utilisation pour éviter toute contamination. Transférez 100 microlitres de chloroforme de qualité réactif dans le flacon en verre à l’aide d’une seringue en verre hermétique de 250 microlitres. Ajoutez 30 microlitres de méthanol de qualité réactif dans le même flacon en verre à l’aide d’une seringue en verre hermétique de 100 microlitres.

Préparez une solution lipidique de cholestérol de pavot de deux millimolaires en transférant 216 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de pop C 42 microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Pop e et 20 microlitres de 11 milligrammes par millilitre. Les solutions de cholestérol dans le flacon en verre de 20 millilitres évaporent les solvants organiques à l’aide d’argon à débit lent ou d’azote gazeux jusqu’à ce qu’une fine pellicule de lipides soit observée au fond du flacon, placez le flacon en verre non bouché dans un dessèchement sous vide pendant au moins 30 minutes.

Pour éliminer le solvant résiduel, transférez deux millilitres de tampon préalablement passé à travers un filtre de 0,2 micron dans le flacon en verre pour hydrater les lipides. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit et l’utiliser dans les 48 heures pour des liposomes de 30 à 100 nanomètres. Libérez la suspension de liposomes dans de l’azote liquide pendant 15 secondes.

Ensuite, décongelez la suspension de liposomes à l’aide d’un bloc chauffant à 42 degrés SIU pendant environ trois minutes. Répétez le processus de congélation et de décongélation pour un total de cinq cycles. La congélation puis la décongélation produisent Ella Les à partir de vésicules à plusieurs lamelles et améliorent l’efficacité du piégeage des lipides pendant l’extrusion.

Ensuite, préparez-vous à l’extrusion en suivant les instructions de l’Avastin pour assembler soigneusement la lipo aussi rapidement que possible. L’assemblage correct de l’extrudeuse LF 50 est essentiel pour éviter les fuites d’azote, qui affectent les débits souhaitables. Pour garantir le succès, effectuez les étapes suivantes avec soin.

Pour produire un joint étanche à l’air. Placez l’écran de support à grand trou dans la base du filtre de support, suivi de la parabole centrale circulaire, d’un disque de vidange et d’une membrane en polycarbonate. Placez le petit joint torique noir sur le dessus de la membrane et fixez-le à la base du filtre de support.

Fixez l’extrudeuse de filtre supérieure en serrant quatre vis dans les quatre trous correspondants. Assemblez l’unité d’extrusion de filtre sous le grand cylindre de l’extrudeuse. Ajoutez la solution de liposomes dans le cylindre au-dessus du cylindre d’extrusion.

Placez un grand joint torique circulaire, un capuchon étroit, un grand joint torique circulaire et un capuchon circulaire. Fixez le régulateur de gaz sur le dessus du cylindre de l’extrudeuse et fermez toutes les vannes pour éviter les fuites d’air, y compris la soupape de surpression. Placez un flacon en verre de 20 millilitres ou un erlenmeyer de 50 millilitres sous l’unité de filtration de l’extrudeuse.

Une soupape de sécurité est connectée au régulateur et se détachera si la pression dépasse 600 PS. J’allume l’azote gazeux et j’ouvre la vanne de gaz reliée à l’extrudeuse. Augmentez la pression d’azote à 25 PSI pour les liposomes de 400 nanomètres, à 125 PSI pour les liposomes de 100 nanomètres et à 400 à 500 PSI pour les liposomes de 30 nanomètres. Surveillez la suspension de liposomes jusqu’à ce qu’elle s’éjecte dans le récipient tout en étant poussée par l’azote.

Maintenez l’azote en circulation jusqu’à ce qu’aucun liquide ne soit observé. Passage à travers le filtre de l’extrudeuse dans la lime en verre pour effectuer une analyse DLS. Préparez d’abord 50 microlitres d’une solution de liposomes de 20 micromolaires diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS.

Allumez ensuite la source d’alimentation et la source de la lampe. Procédez à l’ouverture du logiciel dynapro. Réglez le logiciel sur le modèle de l’algorithme pour détecter les liposomes à la taille souhaitée.

Après avoir connecté à la pipette matérielle 14 microlitres d’échantillon de liposomes dans le vete de quartz et inséré dans le support de cellule, appuyez sur start après environ 20 à 30 acquisitions, appuyez sur stop. Analysez les pics de diamètre moyen des liposomes enregistrés sur l’histogramme. L’analyse de suivi des nanoparticules commence par la préparation d’une solution de liposomes de 500 microlitres de 0,1 micromolaire solubilisée dans du PBS, rince le compartiment de l’échantillon avec de l’eau et de l’éthanol.

Séchez ensuite le compartiment à échantillons avec une serviette en papier non pelucheuse. Allumez la source d’alimentation laser et l’ordinateur délivre 300 microlitres de solution de liposomes 0,1 molaire dans le compartiment à échantillons. Ouvrez le logiciel de contrôle de la température et d’analyse de suivi des nanoparticules.

Appuyez sur le bouton de capture pour allumer le laser. Utilisez les réglages horizontaux et verticaux pour déplacer la platine et ajuster la mise au point du microscope. Réglez la température et la durée d’enregistrement souhaitées.

Appuyez sur le bouton d’enregistrement pour prendre plusieurs images des particules de liposomes pendant une durée spécifiée. Analysez les pics correspondant aux tailles de diamètre des liposomes sur l’histogramme pendant qu’il suit le mouvement de chaque particule. La DLS est une méthode établie qui collecte la lumière diffusée pour déterminer le diamètre des particules et a été réalisée pour déterminer la taille des liposomes.

Les liposomes hydratés ont été extrudés à travers des membranes en polycarbonate à différentes tailles et pressions, comme décrit dans le protocole écrit. Le diamètre des liposomes mesuré par DLS pour des pores de 30 nanomètres était de 66 plus ou moins 28 nanomètres. Pour des pores de 100 nanomètres, la taille était de 138 plus ou moins 80 nanomètres, et pour 400 nanomètres, la taille des pores était de 360 plus ou moins 25 nanomètres.

Une suspension de 50 nanomètres de perles d’Irène polies a été utilisée comme étalon d’étalonnage où elle a enregistré un diamètre de 47 plus ou moins 16 nanomètres. Le pourcentage de polydispersité montre qu’il n’y a pas de chevauchement entre les tailles des liposomes. Il est courant d’observer des diamètres supérieurs à 30 nanomètres lors de l’utilisation de l’analyse DLS en raison du biais connu de cet instrument en faveur des particules plus grosses.

Malgré cette limitation instrumentale, la courbe d’étalonnage décrit une corrélation alinéaire. L’analyse de suivi des nanoparticules est une nouvelle technologie qui mesure la taille de chaque particule à partir d’observations directes de la diffusion dans un milieu liquide, indépendamment de l’indice de réfraction ou de la densité des particules. Cette technique à haute résolution peut être utilisée pour compléter la mesure des liposomes avec DLS, le NTA a enregistré des diamètres de 95 plus ou moins 48 nanomètres et 356 plus ou moins 51 nanomètres pour deux solutions de polystyrène de 100 nanomètres et 400 nanomètres ont été utilisés pour l’étalonnage.

Les solutions lipidiques ont un diamètre plus comparable par rapport au DLS, produisant des tailles moyennes de plus ou moins 14 nanomètres pour des pores de 30 nanomètres, de 95 plus ou moins 17 nanomètres pour des pores de 100 nanomètres et de 359 plus ou moins 73 nanomètres pour des pores de 400 nanomètres. Le NTA peut être une technique de caractérisation plus générale pour quantifier les particules microscopiques puisque sa sensibilité permet de mesurer des particules de 50 à 1000 nanomètres. La courbe d’étalonnage montre une corrélation linéaire entre la pause de la membrane en polycarbonate et la transmission de la coloration négative de diamètre NTA enregistrée. Les images de microscopie électronique montrent que chaque taille de liposome suivant l’extrusion de 3, 100 et 400 nanomètres est clairement distincte l’une de l’autre.

Le grossissement a été réglé à 25 000 fois avec la barre d’échelle représentant 0,5 micron. Une expérience sur le parcours temporel a été menée avec trois tailles de liposomes. La DLS a été mesurée pour chaque solution de liposome immédiatement après l’extrusion.

Toutes les solutions de liposomes ont été stockées à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Leurs diamètres ont été enregistrés à nouveau par DLS après une nuit d’incubation. Peu ou pas de changement a été observé après une période d’incubation de 60 heures. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que plusieurs passages à travers le filtre d’extrusion amélioreront l’homogénéité de la solution Vesco.

N’oubliez pas non plus d’utiliser des flacons et des seringues en verre pour la préparation des échantillons afin d’éviter la contamination par lixiviation par des tubes en polypropylène du chloroforme.