Name: Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Apprenez l'analyse microfluidique unicellulaire de Bacillus subtilis pour étudier la physiologie bactérienne sur plusieurs générations. Cette méthode permet d'observer les réponses cellulaires au stress dans des conditions contrôlées.

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Ce projet a été financé par le National Institutes of Health, sous GM018568. Ce protocole a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS appartient à l’Université Harvard. Merci beaucoup résultent de Thomas Norman et Nathan Lord pour leur travail dans la conception et la fabrication du gabarit principal utilisé pour les dispositifs des ici et dans la construction de la version originale de l’appareil. Aussi, nous remercions Johan Paulsson pour ses précieux conseils collaborative et remercier les membres de son laboratoire pour leurs conseils et améliorations continues pour appareils microfluidiques bactérienne.

1. PDMS dispositif Casting
<ol><li>Dans un environnement sans poussière, mélange polymère PDMS et salaison à un ratio de 10:1 et dégazer sous vide pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Placer un maître de silicium (ou une réplique époxy ou polyuréthane) sur un morceau de papier d’aluminium ininterrompue dans un polystyrène de Pétri. Versez le mélange PDMS dégazé sur le maître à une profondeur d’environ 5 mm. Degas le Pétri pendant au moins 10 mn utilisation un léger courant d’air pour casser les bulles de surface. Remarque : Les dimensions de l’appareil à deux niveaux utilisé sont fournies en l’accompagnant CAD dossier5 (voir fichier complémentaire 1). Un maître de la réplique en plastique peut-être flotter partiellement au cours de dégazage ; dans ce cas, abaissez la réplique avec un applicateur plastique propre.</li>
	<li>Guérir le PDMS pendant au moins 1 h dans un four à 60 ° C et laisser refroidir à température ambiante. Retirer le papier d’aluminium contenant le PDMS maître et soigné de la plaque de Petri. Décollez délicatement le papier d’aluminium à l’arrière du maître, puis peler soigneusement le PDMS du maître. Remarque : Vous pouvez également PDMS peut être guérie du jour au lendemain à température ambiante. La fragilité relative d’un maître plaquette de silicium peut-être être surmontée à l’aide de colle époxy pour coller en permanence l’hostie à un 1/16 de pouce-disque en aluminium épais de la même taille que la plaquette.</li>
	<li>Comme une plaquette comprend généralement plusieurs dispositifs microfluidiques avec des dimensions légèrement différentes (voir 1 de fichier supplémentaire), coupe un seul appareil à la taille à l’aide d’un scalpel propre et net. NOTE : Pour la routine de travail de b. subtilis , utiliser périphériques avec tranchées 1,0 µm-échelle cellulaire, qui sont marquées avec un C ou F dans le fichier CAD.</li>
</ol>2. dispositif de poinçonnage et de collage
<ol><li>Place un morceau de bureau translucide ruban adhésif (voir Table des matières) sur le côté motif de l’appareil pour améliorer la visibilité des motifs caractéristiques. Les ports d’entrée et de sortie sont identifiées comme zones circulaires aux extrémités des canaux fluidiques visibles (Figure 1). Afin d’améliorer leur visibilité en perçant des trous dans le dispositif pour les broches d’entrée et de sortie, marquer les entrées et sorties avec des points à l’aide d’un marqueur à pointe fine. Remarque : Pour s’assurer que les broches d’entrée et de sortie ne sont pas bondés, tous les autre canaux sont perforé, commençant par la chaîne juste sous la désignation alphabétique pour le périphérique.</li>
	<li>Retournez l’appareil PDMS afin que le côté motif est en panne et percer le dispositif pour les points marqués à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm ; jeter les poinçonnages. Remarque : Les appareils sont gravées avec le côté motif vers le bas car le trou généré par le punch biopsie est généralement légèrement évasé où le poinçon pénètre dans le polymère. Poinçonnage de l’appareil dans une orientation inversée veille à ce que le trou sur le côté motif a une frontière nette.</li>
	<li>À l’aide d’un stéréomicroscope, veiller à ce que les perforations se chevauchent avec les zones d’entrée et de sortie de l’appareil. Utiliser une pince à épiler à pointe fine pour enlever des fragments extrinsèques du PDMS des perforations.</li>
	<li>Utilisez un ruban adhésif pour enlever la poussière des deux côtés de l’appareil et le place dans une assiette de Petri propre en polystyrène. Préparer un couvercle en verre 22 x 40 mm en mouillant avec 100 % d’alcool isopropylique et en frottant avec un chiffon de salle blanche ; sec avec un jet d’air exempt de poussière ou de l’azote.</li>
	<li>Placez le poinçonné PDMS dispositif caractéristique vers le haut avec le couvercle en verre nettoyé dans un plasma oxygène nettoyeur.<ol>
<li>Plasma-traiter l’appareil avec les paramètres suivants : vide, 70 mTorr ; O pression2 , 200 mTorr ; durée, 15 s ; puissance 30 w. immédiatement après la fin de la période de traitement plasma, retirer l’appareil et le couvercle en verre du plasma nettoyant.</li>
		<li>Inverser le PDMS et placez-le sur le centre de la lamelle couvre-objet, afin que le côté motif entre en contact avec le verre ; s’assurer que les canaux d’alimentation (en cours d’exécution entre les zones d’entrée et de sortie) sont alignées avec l’axe longitudinal de la lamelle couvre-objet. Appuyez très doucement pour faire en sorte que les joints PDMS contre la vitre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire cuire l’appareil assemblé dans une étuve pendant au moins 1 h à 60 ° C. Après la cuisson, vérifier manuellement que le PDMS est collée sur le verre en appuyant doucement sur un coin de l’appareil. Remarque : Une fois que l’appareil est lié, il devrait servir sous 24h, le polymère devient plus en plus hydrophobe avec le temps après traitement au plasma.</li>
</ol>3. microfluidique plomberie
<ol><li>Couper des longueurs de polymère tube (diamètre intérieur (ID) 0,02 pouce, diamètre extérieur (OD) 0,06 pouces) à des longueurs appropriées rejoindre aisément le pousse-seringue pour les appareils de commutation (si utilisé) et de l’appareil lorsqu’il est monté sur le microscope. Couper des longueurs autant qu’il sont a voies de microfluidique.</li>
	<li>Assembler les Y joints pour vannes à manchon (si vous en utilisez) en coupe et en fixant les longueurs de 2 cm de silicone flexible, tube (0,03 po ID, 0,065 po OD) pour les barbes supérieurs du « Y » et des longueurs de 1 cm de tube de silicone à l’ardillon de fond du « V ».</li>
	<li>10 cm (ou appropriés) longueurs de tube de polymère ; Connectez-les à une extrémité pour la jonction de l’interrupteur en les insérant dans les segments de tuyau silicone 1 cm sur l’ardillon de fond du « V ». Connectez-les à l’autre extrémité à 21G des aiguilles qui ont été retirés de leurs adaptateurs seringue en plastique et bent environ 90 ° environ 9 mm de l’extrémité de l’aiguille.</li>
	<li>Se connecter à 21G aiguilles émoussées à une des extrémités des segments de tubes qui se déroulera de seringues à l’appareil de commutation en insérant des aiguilles dans le tube. Insérez l’autre extrémité de chaque longueur de tube dans les segments de tube de silicone sur les barbes d’entrée des jonctions Y. Remarque : Utilisez une sorte d’appareil pour maintenir les vannes à manchon et les jonctions en place ; Cela peut facilement être réalisé via une boîte de pointe d’une micropipette (Figure 2D).</li>
	<li>Couper des longueurs de tuyauterie de polymère pour transporter les déchets provenant de la sortie de l’appareil dans un bécher de déchets. Connectez-les à une extrémité pour aiguilles tordues de 21G préparé comme indiqué ci-dessus. Fixez l’autre extrémité des tubes dans un bécher de déchets.</li>
	<li>Préparer des volumes appropriés des supports contenant 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et indiquez la taille désirée et le nombre de seringues. Connecter les seringues de BSA-chargé aux aiguilles 21G prêt fixés aux seringues de tubes et de charge d’entrée dans les pompes à seringue. NOTE : pour des expériences typiques 5 canaux de l’appareil sont utilisés, chacun avec une seringue de 20 mL. Une expérience dans laquelle le milieu est commuté nécessitera 2 bancs de 5 seringues de chaque. Ici, la pompe contenant la première banque est dénommée la pompe de la phase 1, et la pompe contenant la deuxième banque, avec le milieu de l’interrupteur après, est dénommée la pompe de la phase 2.</li>
	<li>Purger l’air de la tuyauterie d’aspiration en exécutant les pompes seringue à un débit élevé (> 500 µL/min), commençant en orientant les pompes seringue verticalement et en tapant les seringues pour mettre des bulles d’air vers le haut. Une fois que l’air ait été purgé de seringues, placez la pompe seringue horizontalement et progressivement tap ou feuilleter les lignes de polymère de seringues l’appareillage de commutation pour déloger et éliminer les bulles d’air. Répétez cette procédure pour la deuxième banque des seringues (si changement de médias).</li>
	<li>Après les bulles d’air sont purgés, mettre la pompe de seringue phase 2 (c'est-à-dire, avec le support qui sera utilisé deuxième, après le commutateur) à 1,5 µL/min, puis mettez en pause le flux. Placer des clips de petit cartable sur les segments de tuyau flexible sur la branche des jonctions Y correspondant à la deuxième phase moyenne. Continuer à faire fonctionner la pompe phase 1 seringue à un débit modeste (p. ex., 10 µL/min) pendant au moins 30 min purger le deuxième moyen de la tubulure d’admission en aval de la jonction de Y.</li>
</ol>4. préparation de Culture cellulaire
<ol><li>Atteindre une préculture de la souche d’intérêt dans le milieu désiré du jour au lendemain, phase stationnaire. La souche bactérienne doit contenir une mutation qui rend les cellules immobile, afin que les cellules ne nagent pas sur les canaux de l’appareil. Remarque : Dans ce protocole, la souche bactérienne est b. subtilis 3610 contenant un hagA233V substitution (cette mutation entraîne le flagelle être directement plutôt que de la motilité cellulaire hélicoïdale, prévention), un PrsbV- mNeonGreen reporter pour le stress cellulaire et reporter constitutif Phyperspank- mNeptune (rouge) pour mettre en surbrillance des cellules. Milieu de Lennox LB est utilisé dans le protocole de l’exemple. Les souches typiques pour des expériences de microfluidique contiennent un ou plusieurs journalistes transcriptionnelles fluorescents et une protéine fluorescente constitutivement produite, cytoplasmique pour faciliter la détection automatisée de cellules. Défauts de croissance n’ont pas observés lorsque les riche milieu LB Lennox a été utilisé, mais b. subtilis croissance en milieu minimal peut être inhibée dans des conditions de microfluidique car sécrétée sidérophores sont emportés par le flux du fluide. Dans de telles circonstances, la croissance peut être restaurée par l’addition de citrate de sodium et le chlorure ferrique au milieu, tel qu’indiqué pour S750 moyenne11.</li>
	<li>Le matin de l’expérience, diluer les cellules de b. subtilis 01:50 dans un flacon de 250 mL dérouté contenant 25 mL de milieu de croissance. Cultiver les cellules pendant 5-6 h en secouant la culture à 37 ° C, à une densité optique supérieure à 1. NOTE : Une culture cellulaire dense est préférable parce que la phase stationnaire b. subtilis cellules sont plus petites et moins cellule souvent trouvée dans les chaînes, facilitant le chargement de l’appareil. Différentes espèces bactériennes peuvent exiger d’autres conditions de milieu ou de croissance pour un chargement optimal.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue munie d’un filtre de pores de 5 µm, filtrer environ 15 mL de culture de cellules dans un tube conique 15 mL pour supprimer des chaînes de cellules de b. subtilis (il n’est pas nécessaire pour e. coli et peut ne pas être nécessaire avec d’autres espèces). Remarque : Relativement peu les cellules doivent être éliminés ; le filtrat doit être trouble.</li>
	<li>Centrifuger la culture filtrée pendant 10 min à 4 000 x g à la température ambiante. Décanter le liquide surnageant et Resuspendre le culot dans le reste de liquide surnageant restant dans le tube, ajoutant environ 500 µL de milieu frais si nécessaire pour faciliter le pipetage la suspension cellulaire.</li>
</ol>5. dispositif chargement
<ol><li>Placez délicatement vide mince gel-chargement micropipette conseils (voir Table des matières) dans les orifices de sortie du dispositif microfluidique.</li>
	<li>À l’aide de conseils minces de gel de chargement avec une micropipette P200, passiver l’appareil en injectant du milieu contenant 1 mg/mL de BSA dans les trous d’entrée, en observant les conseils fournis dans les orifices de sortie pour surveiller le remplissage des canaux microfluidiques (Figure 2 a). Incuber le dispositif à température ambiante pendant environ 5 min. NOTE : BSA est couramment utilisé comme un blocage ou passivation agent qui se liera à la surface hydrophobe du polymère PDMS, augmentant sa hydrophilicité et en réduisant la liaison d’autres protéines ou de cellules (par l’intermédiaire des molécules de surface cellulaire).</li>
	<li>À l’aide de minces gel-chargement conseils, chargez chaque canal avec les cellules resuspendues (à partir de la Section 4), en utilisant les pointes dans le canal de sortie pour surveiller la progression des cellules par l’intermédiaire de l’appareil (Figure 2 b). NOTE : Chargement est facilitée en affectant une micropipette P200 son volume maximal 200 µL et aspirer ensuite un coussin d’air avant d’aspirer une petite quantité (environ la moitié du volume de la section mince de l’embout de la pipette) de cellules. Le volume des cellules resuspendues ne doivent pas être précis, comme le volume de l’appareil PDMS est petit par rapport à celle de la micropipette. Nous ne connaissons pas de limite supérieure à la densité des cellules resuspendues, tant que la suspension de cellules peut être distribuée dans l’appareil. Amas de cellules peuvent boucher l’appareil et doivent être évitées par pipetage approfondi et/ou de mélange de vortex.</li>
	<li>Retirez délicatement les pointes gel-chargement par les trous de sortie, travaillant à la fois pour éviter d’endommager l’appareil.</li>
	<li>Centrifuger l’appareil dans une micro-centrifugeuse paillasse dans un adaptateur approprié rotor à environ 6 000 x g pendant 10 min (Figure 2). Remarque : Un adaptateur de rotor en aluminium usiné sur mesure qui a été conçu pour s’adapter à un rotor de microcentrifuge (Figure 2) a été utilisé ; centrifugeuse différents modèles peuvent être utilisés avec des adaptateurs appropriés de rotor. La caractéristique importante de l’adaptateur est qu’il fournit une force latérale dans le sens des extrémités fermées des tranchées cellulaire, permettant ainsi aux cellules dans les chenaux secondaires.</li>
	<li>Vérifier le chargement réussi sous le microscope (Figure 3) mais sans apposition de l’appareil à la diapositive titulaire/stade insérer. Remarque : Dans le présent protocole, un 60 X, 1,4 objectif d’immersion dans l’huile NA Ph3 est utilisé pour les deux vérification à ce stade et d’imagerie ultérieur.</li>
</ol>6. montage, équilibrage et dispositif
<ol><li>Monter soigneusement le dispositif chargé sur un encart de la scène en enregistrant le couvercle en verre sur chaque côté de la PDMS jusqu’au fond de l’insert de la scène (c.-à-d., inverser l’insert de la scène avant de fixer l’appareil). Inverser l’Assemblée insert-dispositif de scène afin que le PDMS est vers le haut et le placer sur une surface molle, comme un chiffon à poussière (Figure 2D).</li>
	<li>Régler le débit de la pompe à seringue de phase 1 à 35 µL/min. travaillant avec une seule voie à la fois, introduire l’aiguille d’aspiration, puis l’aiguille de sortie (c.-à-d., en cours d’exécution dans le bécher de déchets ; Figure 2E).</li>
	<li>Essuyer tout excès du milieu avec un chiffon propre et sans poussière et inspecter visuellement le dispositif d’étanchéité. Examiner le tube de sortie pour l’apparence des cellules excès (généralement apparaissant comme une bande de trouble) et le ménisque moyen, qui se déplace lentement vers le bécher de déchets.</li>
	<li>Permettre à l’appareil de fonctionner à 35 µL/min pendant environ 15-30 min, jusqu'à ce que toutes les voies connectés sont vidaient dans le bécher de déchets.</li>
	<li>Mettre la pompe seringue phase 1 µL/min 1,5 et interrompre la circulation. Apportez tout l’appareil pompe et appareil au microscope (ce processus est facilité en le plaçant sur un chariot roulant) et redémarrer la phase-1 débit moyen à 1,5 µL/min. monter soigneusement l’insert de la scène avec le dispositif sur un microscope à fluorescence inversé, à l’aide ruban adhésif nécessaire pour acheminer l’entrée et le tube de sortie.</li>
	<li>Localiser les positions souhaitées sur l’appareil d’imagerie et commencer l’imagerie comme vous le souhaitez. Notez que les cellules nécessitent habituellement quelques heures (environ 10 générations) pour atteindre la croissance exponentielle-phase stationnaire et le début de l’acquisition d’images peut être retardé tant que désiré afin que l’imagerie commence après la période de l’équilibration. Remarque : La croissance stationnaire des cellules en phase exponentielle de croissance doit être vérifiée au cours de l’analyse d’images ultérieures en observant les temps de division cellulaire et en veillant à ce qu’ils ont atteint une valeur minimale constante.</li>
</ol>7. moyen de commutation
<ol><li>Entre les cycles successifs de l’imagerie, interrompre le débit de la pompe à seringue de phase 1. Soigneusement déclipser les attaches liant de la silicone phase 2 tubes, chacun au tuyau silicone se déplaçant sur la branche de la phase 1 de la jonction de Y. ONU-pause l’écoulement de la phase 2 seringue pompe (qui a été fixée à 1,5 µL/min à l’étape 3,8) et continuer d’imagerie. Remarque : À 1,5 µm/min avec une longueur de 10 cm de tuyauterie de polymère en aval des jonctions Y, le milieu de la seconde phase a atteint l’appareil à environ 50 min. Le temps de l’appareil peuvent être testé empiriquement à l’aide de médias contenant des particules de traceur fluorescent.</li>
</ol>

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<li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole de microfluidique est flexible car bon nombre des étapes peuvent être modifiées afin d’optimiser son utilisation avec une espèce particulière ou un souche ou dans un but précis. En effet, dans ce protocole nous avons fait des modifications apportées à l' original du concept « machine mère »4 pour optimiser son utilisation avec b. subtilis. Souvent, les tranchées où les cellules sont confinés constituent un élément de la monocouche, tandis que dans le présent protocole, nous u...

Une des caractéristiques plus frappantes de la vie sur terre est sa grande résistance et sa variété. Un objectif central de la biologie moléculaire est de comprendre la logique par lequel les cellules utilisent gènes et protéines pour maximiser leur croissance et leur condition physique sous une grande variété de conditions environnementales. Pour atteindre cet objectif, les scientifiques doivent pouvoir observer en toute confiance comment les cellules individuelles se développent, divisent et expriment leurs gènes sous un ensemble donné de conditions, notant comment les cellules réagissent aux changements ultérieurs dans leur environnement. Toutefois, des méthodes analytiques traditionnelles en microbiologie ont des limitations techniques qui affectent les types de questions qui peuvent être abordées. Par exemple, les analyses axées sur la culture en vrac ont été très utiles au cours des années, mais ils offrent uniquement des données au niveau des populations qui peuvent masquer des variations significatives de cellule-cellule ou le comportement des petites sous-populations de cellules dans la population totale. Analyses de cellule unique de bactéries vivantes, basés sur la microscopie photonique révèlent unicellulaires comportement mais sont également limités techniquement. Bactéries sont généralement immobilisées sur agarose tampons contenant le milieu de croissance, mais la vue au microscope de cellules croissance et division des foules et épuise les nutriments disponibles après quelques cycles cellulaires, limitant considérablement l’observation heure1, 2. En outre, l’appauvrissement local de nutriments et de l’accumulation concomitante de sous-produits métaboliques en raison de la croissance des cellules changent constamment le milieu de croissance des cellules locales de manières qui sont difficiles à mesurer ou à prévoir. Ces changements environnementaux à l’aide de tampons d’agarose posent un défi aux études de comportements stationnaire ou des réponses cellulaires aux changements spécifiques dans des conditions de croissance3.
Technologie de microfluidique, dans lequel un milieu liquide est a coulé en continu au moyen de dispositifs microfabriques offre une solution aux limitations expérimentales classiques. Un dispositif microfluidique peut garder les cellules individuelles en position pour la microscopie des cellules vivantes tandis que la circulation de milieu de croissance constamment fournit des cellules avec des aliments frais et lave les sous-produits métaboliques et les cellules excédentaires, créant ainsi une croissance très homogène environnement. Dans des conditions de croissance constant, comportements cellulaires peuvent être observés dans l’isolement de l’influence des facteurs environnementaux, permettant une vue dégagée de la logique interne des cellules. Car l’écoulement du fluide empêche le dispositif microfluidique de devenir bondé de cellules, observation des lignées de cellules du même pour des dizaines ou des centaines de générations devient possible4,5. Ces périodes d’observation longue de permettre la détection des comportements autrement indécelables cellules rares ou à long terme. Enfin, la composition du milieu qui traverse l’appareil peut être modifié à volonté, permettant aux cellules à observer car ils réagissent à l’apparition d’un stress ou à l’introduction ou la suppression d’un composé particulier.
Microfluidique jouit déjà d’un certain nombre d’applications importantes. Par exemple, il a été utilisé dans les tissus, orgue ou dispositifs de corps-on-a-chip, dans laquelle plusieurs types de cellules humaines sont conjointement cultivés pour simuler un en vivo condition6; pour l’étude du mouvement de nématodes dans les environnements microstructurées7; pour examiner les interactions entre les biofilms bactériens (par exemple, 8) ; et pour l’encapsulation et la manipulation de petits volumes de cellules ou de produits chimiques (p. ex., 9). Dispositifs microfluidiques sont également devenus plus en plus populaires dans le domaine de la microbiologie (pour les excellentes critiques, voir 10 et 11), surtout que leur physique et les propriétés d’écoulement sont bien assorties aux niches microbiennes naturelles12. Par exemple, microfluidique a été récemment employée par microbiologistes à de telles fins comme mesure précisément cellule croissance et division13,14,15, analyse de mouvement pathogène16, suivi quorum télédétection17 et physiologiques transitions18et pour la protéine comptant19, parmi beaucoup d’autres exemples. La méthode présentée ici est spécialement conçue pour l’analyse des lignages cellulaires bactérienne unique plutôt que des combinaisons de souches ou espèces. Le dispositif microfluidique démontré ici utilise une variante de la « machine à mère » design4, dans lequel les cellules croissent monofichier dans une tranchée de microfluidique avec une extrémité fermée et une extrémité ouverte ; Division et la croissance des cellules pousse les cellules de la progéniture et se détache de l’extrémité ouverte dans l’écoulement du fluide. En général, nos analyses se concentrent uniquement sur la cellule « mère » qui se limite à l’extrémité fermée de la tranchée. Nous considérons cette méthode comme une promotion au cours de la précédentes lumière axée sur la microscopie unicellulaire des techniques analytiques, telles que l’immobilisation de la cellule sur des tampons en gel d’agarose. B. subtilis est utilisé comme un modèle ici, la méthode est également applicable aux autres espèces de bactéries (Escherichia coli est un autre modèle commun ; certaines espèces avec des tailles de cellules différentes ou morphologies peuvent demander la fabrication de nouveaux dispositifs avec des dimensions différentes). L’utilisation de reporters fluorescentes pour marquer les cellules et de visualiser les changements dans l’expression des gènes nécessite l’utilisation d’espèces génétiquement docile ; Toutefois, les analyses de la croissance cellulaire et de morphologie sont possibles même sans marqueurs fluorescents.
Le présent protocole exclut du processus de fabrication du maître de silicium à l’aide de photolithographie, qui a été largement décrite ailleurs5; maîtres peuvent également être facilement externalisées par les installations de microfabrication. Il comprend le moulage d’un dispositif PDMS issu d’un master de silicium renforcée ; collage de l’appareil à un morceau de verre ; montage de l’entrée de la microfluidique et la plomberie de sortie, y comprises pincée vannes afin de permettre la commutation moyenne ; passivation de l’appareil, la préparation des cellules bactériennes et charger l’appareil avec des cellules bactériennes ; fixation de la plomberie pour le périphérique et équilibration des cellules ; et le chargement de l’appareil sur un microscope à fluorescence pour l’imagerie. Parce que beaucoup d’acquisition d’images différentes et traitement logiciel outils peuvent être utilisés pour visualiser et analyser les différentes données d’intérêt4,5, exemple image sont affichées, mais les méthodes de capture d’image ne sont pas inclus dans le présent protocole.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Ceci est appelé PDMS dans le protocole. Il y a 2 composants qui sont mélangés à un rapport de 10:1</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 0,75 mm</td> World <td>Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>verre de couverture 22 x 40 mm n° 1,5</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Instrument utilisé pour coller le PDMS au verre à l’aide d’un traitement au plasma d’oxygène</td></tr><tr><td>Tube flexible Tygon ID 0.02 », OD 0.06"</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>Pour la partie principale de la tubulure, par exemple fixée aux aiguilles</td></tr><tr><td>Tube en silicone, 0,04 » ID, 0,085 » OD</td><td>HelixMark Standard Silicone Tubing</td><td>60-795-05</td><td>Pour les vannes à manchon et le raccordement à jonction en Y</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Sigma-Aldrich</td><td></td><td>A7906-100G</td><td>Utilisé comme agent de passivation</td></tr><tr><td>ART Pointes de pipette en gel (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>Pour le chargement de l’appareil avec un fluide et des cellules</td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc 32 mm avec 5-&mu ; m Membrane Supor</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>Pour filtrer les cultures avant le chargement de l’appareil</td></tr><tr><td>Aiguilles émoussées de calibre 21, connecteur 1"</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y avec ardillons de la série 200, tube 1/16 » ID, polypropylène</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>L’entreprise est AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope inversé</td><td>Nikon</td><td></td><td>Cette unité a été abandonnée par le fabricant et est remplacée par la Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis souche NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>souche parentale de type sauvage modifiée pour être utilisée dans les expériences présentées dans ce protocole</td></tr><tr><td>Four à convection par gravité</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>pour le durcissement PDMS et la cuisson assemblé dispositifs</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>peut être utilisé pour coller une plaquette de silicium à une plaque de support en aluminium</td></tr><tr><td>Ruban adhésif Scotch Magic, 3/4 » de largeur</td><td>3M</td><td></td><td>pour nettoyer la poussière des dispositifs PDMS et pour placer des éléments afin d’augmenter la visibilité (désigné « ruban de bureau » ou « ruban adhésif » dans le protocole)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listé ici à titre d’exemple ; presque n’importe quel stéréomicroscope fera</td></tr><tr><td>de l’alcool isopropylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>Pour nettoyer le verre de couverture</td></tr><tr><td>Pompe à seringue, 6 canaux</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>une marque de lingettes sans poussière</td></tr></tbody></table>

analyse de microfluidic unicellulaire de bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

La technologie Microfluidic surmonte beaucoup des restrictions aux méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie. Contrairement aux méthodes de culture en vrac, il offre une résolution de cellule unique et longue observation times s’étendant sur des centaines de générations ; à la différence d’agarose microscopie axée sur le pavé, il a des conditions de croissance uniforme qui peuvent être contrôlées. Parce que le flux continu de milieu de croissance isole les cellules dans un dispositif microfluidique de variations imprévisibles dans l’environnement chimique local causée par la croissance des cellules et du métabolisme, authentiques changements dans l’expression des gènes et la croissance des cellules en réponse à des stimuli spécifiques peuvent être observés avec plus de confiance. Bacillus subtilis est utilisé ici comme une espèce de bactérie modèle afin de démontrer une « machine de la mère »-méthode d’analyse cellulaire de type. Nous montrons comment construire et sonder un dispositif microfluidique, chargez-le avec cellules, initier l’imagerie microscopique et exposer des cellules à un stimulus en passant d’un milieu à l’autre. Un journaliste sensibles aux stress est utilisé comme un exemple de révéler le type de données qui pourraient être obtenus par cette méthode. Nous discutons également brièvement plus loin les applications de cette méthode pour d’autres types d’expériences, telles que l’analyse de la sporulation bactérienne.

Cellule initiale réussie, chargement, tel qu’évalué par microscopie à contraste de phase avant d’attacher la plomberie microfluidique à l’appareil, serait considéré comme ayant la totalité ou la quasi-totalité des canaux microfluidiques côté contenant une ou plusieurs cellules bactériennes ( Figure 3 a). Chargement optimal présentera plusieurs cellules dans chaque canal, mais les canaux remplira néanmoins avec des cellules en raison de la croissance des cellu...

Nous présentons une méthode pour l’analyse de la microfluidique de lignées de cellules bactériennes individuelles à l’aide de Bacillus subtilis à titre d’exemple. La méthode surmonte les lacunes des méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie en permettant l’observation de centaines de générations de cellules dans des conditions de croissance étroitement contrôlable et uniforme.

Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

L’objectif global de ce dispositif expérimental microfluidique est de permettre l’observation à long terme de cellules bactériennes individuelles dans des conditions environnementales constantes et hautement contrôlées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie bactérienne, telles que quels sont les modèles de réponse à long terme des cellules individuelles au stress ou comment un phénotype hétérogène au sein d’une population varie-t-il avec le temps. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons observer des lignées cellulaires individuelles pendant des dizaines, voire des centaines de générations, dans des conditions environnementales constantes, uniformes et hautement contrôlées.Après avoir préparé le polymère PDMS selon le protocole de texte, placez un master en silicone sur un morceau de papier d’aluminium intact dans une boîte de Pétri en polystyrène. Versez le mélange PDMS dégazé sur le maître à une profondeur d’environ cinq millimètres. Ensuite, dégazez le plat pendant au moins 10 minutes.Faites durcir le PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant au moins une heure et refroidissez-le à température ambiante

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

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Biologie

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Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis

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