Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis

L’objectif global de ce dispositif expérimental microfluidique est de permettre l’observation à long terme de cellules bactériennes individuelles dans des conditions environnementales constantes et hautement contrôlées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie bactérienne, telles que quels sont les modèles de réponse à long terme des cellules individuelles au stress ou comment un phénotype hétérogène au sein d’une population varie-t-il avec le temps. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons observer des lignées cellulaires individuelles pendant des dizaines, voire des centaines de générations, dans des conditions environnementales constantes, uniformes et hautement contrôlées.

Après avoir préparé le polymère PDMS selon le protocole de texte, placez un master en silicone sur un morceau de papier d’aluminium intact dans une boîte de Pétri en polystyrène. Versez le mélange PDMS dégazé sur le maître à une profondeur d’environ cinq millimètres. Ensuite, dégazez le plat pendant au moins 10 minutes.

Faites durcir le PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant au moins une heure et refroidissez-le à température ambiante. Retirez ensuite la feuille d’aluminium contenant le PDMS maître et durci de la plaque. Marquez-le soigneusement et décollez la feuille d’aluminium à l’arrière du maître.

Ensuite, décollez soigneusement le PDMS du maître. En tant que plaquette, elle comprend généralement plusieurs dispositifs microfluidiques de dimensions légèrement différentes. Utilisez un scalpel propre et tranchant pour couper un seul appareil à la taille appropriée.

Placez un morceau de ruban adhésif de bureau translucide sur le côté à motifs de l’appareil pour améliorer la visibilité des éléments à motifs. Les orifices d’entrée et de sortie sont identifiés comme des zones circulaires aux extrémités opposées des canaux fluidiques visibles. Retournez l’appareil PDMS avec le motif vers le bas et utilisez un poinçon de biopsie de 0,75 millimètre pour percer l’appareil jusqu’aux points marqués.

Jetez ensuite les poinçons. Une pince à épiler peut être nécessaire pour retirer les poinçons de l’appareil. Insérez le verre de protection nettoyé et séché et l’appareil PDMS dans un nettoyeur plasma à oxygène et traitez l’appareil au plasma avec les paramètres indiqués ici.

Immédiatement après la fin du traitement au plasma, retirez l’appareil et le verre de couverture du nettoyeur plasma. Inversez le PDMS et placez-le au centre de la vitre de protection de sorte que le côté du motif entre en contact avec la vitre. Assurez-vous que les canaux d’alimentation sont alignés avec le long accès de la vitre de protection.

Appuyez très doucement pour vous assurer que le PDMS est étanche contre le verre. Faites cuire l’appareil assemblé dans un four à 60 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après la cuisson, vérifiez manuellement que le PDMS est collé au verre en appuyant doucement sur un coin de l’appareil.

Après avoir coupé le tube en polymère conformément au protocole de texte, assemblez les jonctions en Y pour les vannes à manchon, si vous les utilisez, en coupant et en fixant des longueurs de deux centimètres de tubes en silicone flexible aux ardillons supérieurs du Y et des longueurs d’un centimètre de tube en silicone à l’ardillon inférieur du Y.Ensuite, coupez des longueurs de 10 centimètres de tubes en polymère, puis connectez-les à une extrémité à la jonction de l’interrupteur en les insérant dans les segments de tube en silicone d’un centimètre sur l’ardillon inférieur du Y.Connectez les longueurs de tube à l’autre extrémité aux aiguilles de calibre 21 qui ont été retirées de leurs adaptateurs de seringue en plastique et pliées à environ 90 degrés, à environ neuf millimètres de l’extrémité de l’aiguille. Connectez des aiguilles émoussées de calibre 21 à une extrémité des segments de tube qui relieront les seringues à l’appareil de commutation en insérant les aiguilles dans le tube. Insérez les autres extrémités de chaque longueur de tube dans les segments de tube en silicone sur les ardillons d’entrée des jonctions en Y.

Après avoir rempli les seringues avec un milieu de croissance bactérienne, complété par BSA, conformément au protocole de texte, connectez les seringues chargées aux aiguilles de calibre 21 préparées, fixez-les à la tubulure d’entrée et chargez les seringues dans les pousse-seringues. Purger l’air de la tuyauterie d’entrée en faisant fonctionner les pousse-seringues à un débit élevé et en orientant les pousse-seringues verticalement, en tapotant les seringues pour amener les bulles d’air vers le haut. Une fois que l’air a été purgé de la seringue, positionnez le pousse-seringue horizontalement et tapotez ou effleurez progressivement les conduites de polymère des seringues, vers le haut à travers l’appareil de commutation pour déloger et purger les bulles d’air.

Répétez ce processus pour la deuxième banque de seringues si vous changez de support. Une fois les bulles d’air purgées, réglez la pompe à seringue de phase deux à 1,5 microlitre par minute, puis interrompez le débit. Placez de petites pinces de liant sur les segments de tube flexible sur la branche des jonctions en Y correspondant à la deuxième phase du fluide et continuez à faire fonctionner la pompe de la première phase pour purger le deuxième fluide en aval de la jonction en Y.

Pour charger le dispositif PDMS, commencez par placer délicatement les pointes de micropipette vides et fines chargées de gel dans les trous de sortie du dispositif microfluidique. À l’aide de pointes fines à chargement de gel avec la micropipette P200, passivez le dispositif en injectant un milieu contenant un milligramme par millilitre de BSA dans les trous d’entrée, en observant les pointes et les trous de sortie pour surveiller le remplissage des canaux microfluidiques. Incuber l’appareil à température ambiante pendant environ cinq minutes.

Ensuite, à l’aide d’embouts similaires, chargez chaque canal avec les cellules remises en suspension à l’aide des embouts du canal de sortie pour surveiller la progression des cellules à travers l’appareil. Retirez délicatement les embouts de chargement de gel des trous de sortie, en travaillant un par un pour éviter d’endommager l’appareil. Centrifuger l’appareil dans une microcentrifugeuse de paillasse à l’aide d’un adaptateur de rotor approprié à environ 6 000 fois g pendant 10 minutes.

Vérifiez que le chargement a réussi au microscope, mais sans fixer l’appareil à l’insert de platine du porte-diapositives. Montez soigneusement l’appareil chargé sur un insert de scène en collant le verre de protection de chaque côté du PDMS au bas de l’insert de scène. Inversez l’ensemble du dispositif d’insertion de scène de sorte que le PDMS soit orienté vers le haut et placez-le sur une surface douce telle qu’une lingette sans poussière.

Ajustez le débit de la pompe à seringue phase-one à 35 microlitres par minute. Ensuite, en travaillant avec une voie à la fois, insérez l’aiguille d’entrée, puis l’aiguille de sortie qui va jusqu’au bécher à déchets. Après avoir inspecté visuellement l’appareil pour détecter les fuites, examinez le tube de sortie pour détecter l’apparition de cellules en excès qui apparaissent sous la forme d’une bande trouble dans le ménisque moyen, qui se déplacera lentement vers le bécher de déchets.

Une fois que l’appareil a fonctionné pendant environ 15 minutes, réglez la pompe à seringue de phase un à 1,5 microlitre par minute et arrêtez le débit. Amenez l’ensemble de la pompe et de l’appareil dans un microscope à fluorescence inversée et redémarrez le débit de fluide de phase un à 1,5 microlitre par minute. Montez soigneusement l’insert de platine avec l’appareil sur le microscope, à l’aide de ruban adhésif si nécessaire pour acheminer le tube d’entrée et de sortie.

Localisez les positions appropriées sur l’appareil pour l’imagerie et commencez l’imagerie comme vous le souhaitez. Notez que les cellules ont généralement besoin de quelques heures pour lire la croissance de la phase exponentielle à l’état d’équilibre, et que le début de l’acquisition de l’image peut être retardé à volonté afin que l’imagerie commence après la période d’équilibre. Pour changer de fluide entre des cycles successifs d’imagerie, interrompez le débit du pousse-seringue de phase un, déclipsez soigneusement les clips de reliure de la tubulure en silicone de phase deux, en déplaçant chacun d’eux vers la tubulure en silicone sur la branche de la première phase de la jonction Y, puis réinterrompez le débit de la pousse-seringue de phase deux et poursuivez l’imagerie.

Comme l’a évalué la microscopie à contraste de phase, avant de fixer la plomberie microfluidique au dispositif, la charge cellulaire initiale serait considérée comme réussie si tous ou presque tous les canaux latéraux microfluidiques contenaient une ou plusieurs cellules bactériennes. Une fois l’appareil initialement chargé, il est équilibré à un débit relativement élevé. Comme le montre ici, l’inspection microscopique d’un dispositif équilibré devrait révéler quelques cellules confinées en file indienne dans la plupart des canaux latéraux.

Une fois qu’un appareil équilibré est placé sur le microscope sous un débit de 1,5 microlitre par minute à 37 degrés Celsius, les cellules reprendront une croissance de phase exponentielle uniforme et constante pendant environ deux heures. Les cellules qui ont repris une croissance en phase exponentielle peuvent être imagées de manière fiable à l’aide de la microscopie à fond clair ou à fluorescence pendant au moins 24 heures. L’introduction d’un interrupteur moyen élargit la gamme d’expériences qui peuvent être menées, mais augmente également la fréquence des événements de mort cellulaire catastrophique en raison de la présence de bulles d’air ou de grappes de cellules à l’entrée qui se délogent et passent par le canal d’alimentation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures, si elle est exécutée correctement. En utilisant cette procédure, avec différents rapporteurs fluorescents, souches et conditions environnementales, une grande variété de phénomènes physiologiques peuvent être examinés, y compris des événements très rares ou transitoires.