Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Dans cette vidéo, un protocole très simple et efficace permettant d'obtenir une suspension cellulaire de tissu test à partir de rongeurs en seulement 15 minutes sera présenté. La méthode a été appliquée aux testicules de souris, de rats et de cobayes, et utilise un appareil mécanique pour désagréger le tissu encapsulé. Après filtration et coloration, l'ensemblage cellulaire est prêt pour la cytométrie en flux.

L'analyse cyto ou le tri de l'homogénéité des populations cellulaires est une condition préalable à l'analyse des événements biochimiques et moléculaires durant la différenciation gonadique mâle. Ainsi, l'hétérogénéité testiculaire, avec plus de 30 types cellulaires différents, représente l'un des principaux problèmes liés à l'étude des bases moléculaires de la spermatogenèse chez les mammifères. Pour cette raison, diverses méthodes ont été utilisées afin d'enrichir ou de purifier les populations cellulaires testiculaires, notamment la sédimentation par unité de densité et la sédimentation centrifuge.

La première étape de toute méthode de séparation cellulaire consiste en la préparation d'une suspension cellulaire. Toutefois, les protocoles actuels sont généralement longs et peuvent entraîner une perte de molécules à durée de vie courte, telles que les ARN, ce qui est indésirable pour des analyses d'expression ultérieures. Le principal avantage du protocole présenté ici est qu'il élimine les étapes intermédiaires entre l'euthanasie de l'animal et les études moléculaires spécifiques au stade spermatique, tout en assurant une bonne qualité et une excellente représentation des types cellulaires dans les suspensions cellulaires.

Le Dr Ana Rodriguez, chercheuse au laboratoire AL ayant mis au point la méthode, ainsi que Federico San Lopez en cytométrie en flux, qui ont été chargés de l'analyse cytométrique, démontreront la procédure. La procédure nécessite un petit équipement, le système meach, avec ses accessoires medicon et fcon. Toutefois, les accessoires fcon peuvent être parfaitement remplacés par des membranes en nylon de même taille de pore.

Les seuls autres matériaux et réactifs nécessaires sont une lame en verre, deux boîtes, des ciseaux et une pince, une seringue de trois à cinq millilitres, une chambre intestinale, un milieu de culture DMM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et de l'ADN. Si des applications en aval impliquant des manipulations d'ARN sont prévues, tous les matériaux et solutions doivent être traités en conséquence pour réaliser le protocole. Placer le testicule disséqué dans une boîte en verre de 96 millimètres contenant sur de la glace 10 millilitres de milieu DMM supplémenté refroidi.

Retirer le TAL Virginia, découper le testicule décapité en morceaux carrés de deux à trois millimètres de côté. Placer quatre à cinq de ces morceaux dans un medicon jetable, avec un millilitre de D complémenté au code, puis traiter dans le système de machine meta pendant 50 secondes. Chaque unité médicale contient un tamis fixe en acier inoxydable comportant environ cent trous hexagonaux entourés de six micro-lames.

Le tissu est dirigé vers chaque orifice par un rotor métallique situé à l'intérieur de la chambre Medicon et désagrégé en passant par les orifices aiguisés et à travers le tamis métallique, tandis qu'une micro-pompe située sous le tamis fournit du liquide et évacue les enveloppes. Récupérez le résultat sous forme de suspension cellulaire à partir du Medicon à l'aide d'une seringue de trois à cinq millimètres, sans aiguille. Imbibez ensuite une maille Falcon de 50 micromètres ou un tamis en nylon de taille équivalente de 0,5 millilitre de milieu et filtrez la suspension à travers celui-ci.

Répétez l'étape, mais en utilisant un tamis en nylon de 25 micromètres ou un unité falcon équivalente, placez sur de la glace, prélevez un aliquot de la suspension cellulaire pour effectuer un décompte dans une chambre de Noyers et ajustez la concentration cellulaire à un à deux fois 10⁷ cellules par millilitre dans le milieu de culture. Enfin, ajoutez du NDA à une concentration finale de 0,2 % afin d'éviter la pompe cellulaire et également d'éviter l'obstruction musculaire lors des études de flux ultérieures. Si l'on souhaite évaluer la viabilité cellulaire, celle-ci peut être réalisée à l'aide du kit de viabilité vivant-mort pour cellules animales, en suivant les instructions du fabricant avant l'analyse en cytométrie en flux, en ajoutant un colorant fluorescent.

Le choix du fluorochrome dépendra des lasers disponibles. Dans cette démonstration, l'utilisation de différents colorants se liant à l'ADN sera illustrée. Bien que l'iodure de propidium soit le colorant habituel pour les cellules fixées ou mortes à faible concentration, nous avons constaté qu'à forte concentration, il pénètre dans les cellules testiculaires non fixées présentes dans les suspensions préparées selon la méthode présentée ici.

Cela est probablement dû à la contrainte mécanique impliquée, qui, combinée à la nature sensible de l'épithélium semi-al, pourrait entraîner la rupture des ponts de connexion entre cellules même avec une manipulation minimale. Pour la coloration par iodure de propidium, ajouter 10 minutes avant l'analyse de l'échantillon en solution une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre à la suspension cellulaire et incuber à zéro degré Celsius à l'abri de la lumière. Pour analyser les cellules colorées au propidium mu. Pour un tri ultérieur, nous utilisons un cytomètre en flux FAX Vantage équipé d'un laser à ions argon cohérent réglé pour émettre à 488 nanomètres. La puissance du laser est fixée à cent milliwatts et la fluorescence émise par l'iodure de propidium I est recueillie par un détecteur FL2 à l'aide d'un filtre passe-bande 575/26.

Utilisez un embout de 70 micromètres pour les mesures de cytométrie en flux et le logiciel squa pour analyser les paramètres suivants : diffusion avant, diffusion latérale, fluorescence totale émise ou surface de l'impulsion et durée des émissions fluorescentes ou largeur de l'impulsion. Les résultats sont présentés en grammes représentant le nombre d'événements à chaque niveau de fluorescence et en graphiques en D affichant la diffusion latérale en fonction de la surface de l'impulsion fluorescente et la surface de l'impulsion fluorescente en fonction de sa largeur.

Les doublets sont exclus de l'analyse à l'aide de diagrammes DO de la surface des impulsions fluorescentes en fonction de leur largeur, afin de trier les populations de monocytes SM avec le mode de tri fax vantage réglé en R normal ou C normal, en utilisant trois gouttes triées comme enveloppe. Ajuster le différentiel d'échantillon pour analyser les cellules à un débit de 500 à 1500 par seconde. Maintenir les tubes d'échantillon et de collecte à trois ou quatre degrés Celsius à l'aide d'un dispositif de réfrigération.

Alternativement, les cellules en suspension peuvent être marquées avec d'autres fluorochromes. Par exemple, le colorant vital HER 3 3 3 4 2 peut être utilisé à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et incubé pendant au moins 10 minutes à 37 degrés, à l'abri de la lumière, pour Hirsch.

Échantillons de coloration 3, 3, 3, 4, 2. L’analyse cellulaire a été réalisée à l’aide d’un cytomètre en flux MO équipé d’un laser à longueur d’onde d’excitation UV fonctionnant à 25 milliwatts et d’un embout de 70 micromètres. Utilisez le logiciel Summit 4.3 ou équivalent pour analyser les mêmes paramètres indiqués précédemment lorsque les suspensions cellulaires sont analysées en optique de contraste de phase, des suspensions de qualité coupée sont observées.

Les principaux avantages de ce protocole résident tout d'abord dans la préparation de suspensions de cellules testiculaires à l'aide de la machine dédiée, suspension obtenue en seulement 15 minutes, y compris la césarienne testiculaire, la découpe du tissu, l'ach, le traitement par la machine et la filtration, une durée qui représente environ un huitième du temps habituellement nécessaire avec d'autres protocoles. La brièveté de ce protocole, combinée à une manipulation minimale, explique la bonne préservation des macromolécules à durée de vie courte, ce qui est essentiel lorsqu'un échantillon représentatif des composés présents dans la population cellulaire d'origine est requis. Comme la méthode implique une manipulation minimale, elle est facilement reproductible, comme indiqué dans ce tableau.

Les pourcentages relatifs des différentes populations cellulaires testiculaires, issus de sept expériences indépendantes réalisées avec des rats adultes et analysées par cytométrie en flux, sont présentés à titre d'exemple afin d'illustrer la reproductibilité de la méthode. Contrairement à la plupart des particules actuellement utilisées pour la préparation de suspensions cellulaires testiculaires, la méthode décrite ici ne fait pas appel à une action enzymatique. Bien que la goutte-à-goutte de collagénase dans des RNAs, qui sont les enzymes généralement incluses, contribue insuffisamment à la dissociation du tissu, elle peut également affecter la préservation des macromolécules d'intérêt.

L'absence de traitements enzymatiques favorise non seulement la préservation de l'ARN et des protéines, mais rend également le protocole moins coûteux. Bien qu'il ait été rapporté précédemment que les suspensions cellulaires préparées mécaniquement s'agglomèrent plus facilement que celles traitées à la trypsine, nous avons constaté que ce protocole conduit à des suspensions cellulaires bien désagrégées en l'absence d'action enzymatique. L'ajout de NDA s'est révélé très utile pour prévenir l'agglomération cellulaire.

La bonne qualité des suspensions est également démontrée lorsque les échantillons sont soumis à une analyse cytométrique, comme en témoigne la quantité minimale de débris cellulaires observée. Selon des données publiées, environ 13 % des spermatozoïdes ronds présentent un multinucléage, que les suspensions cellulaires soient préparées par une méthode exclusivement mécanique ou en présence de trypsine. Toutefois, de nombreuses suspensions préparées mécaniquement montrent très peu de cellules multinucléées, très probablement en raison d'un enchevêtrement réduit, puisqu'il a été établi que les cellules multinucléées se forment principalement comme conséquence de la manipulation du tissu.

Un exemple de suspension cellulaire préparée mécaniquement à partir du testicule de rat est observé sur cette image. Comme on peut le voir, les cytoplasmes sont bien préservés et les pourcentages relatifs des populations cellulaires à 2C et 4C dans les suspensions testiculaires préparées mécaniquement pour différents rongeurs reflètent ceux des PEs intacts.

Ceci soutient l'hypothèse selon laquelle la méthode décrite ici n'endommage pas sélectivement un type cellulaire particulier. De manière surprenante, la représentation des types cellulaires dans de nombreuses suspensions préparées par machine est beaucoup mieux préservée qu'avec les méthodes classiques de préparation par goutte à goutte. Comme on peut le voir, les cytogrames obtenus pour les suspensions cellulaires testiculaires traitées par meine ne diffèrent pas sensiblement de ceux rapportés précédemment.

En effet, les histogrammes et les diagrammes de dispersion obtenus montrent les trois populations cellulaires testiculaires caractéristiques à quatre C, à deux C et les cellules C, basées sur la teneur en ADN, ainsi que la population subhaploïde apparente, qui représente les spermatozoïdes haploïdes fortement condensés. Ces profils ont été observés respectivement pour les suspensions colorées à l'iode de propidium ou à l'herculeine, et ceci tant pour les spécimens adultes que juvéniles. Le tri des cellules spermatogéniques a été réalisé avec succès avec une pureté supérieure à 98 %, que ce soit pour des populations testiculaires sélectionnées selon leur teneur en ADN ou même pour des sous-populations ayant la même teneur en ADN mais un degré différent de condensation de la chromatine, telles que les cellules en sleep tine et les cellules tine myocytes.

Comme nous avons pu l'observer dans les suspensions testiculaires de cobaye, comme le protocole ne comprend pas de traitement par l'ARN, les populations triées offrent une bonne qualité d'ARN et permettent des études d'expression génique différentielle, même pour les populations marquées par l'iodure de propidium. À cet égard, il convient de rappeler que, contrairement à d'autres colorants, l'iodure de propidium marque à la fois l'ADN et l'ARN double brin. Toutefois, dans ce graphique d'une analyse de suspension testiculaire de cobaye, les profils similaires obtenus en utilisant l'iodure de propidium en parallèle avec le cycle orange vibrant, qui est un colorant vital spécifique de l'ADN, montrent que la coloration de l'ARN n'influence pas de manière significative les profils d'histogramme cytométrique.

Cette liste résume les principaux avantages du protocole décrit. La méthode optimisée présentée ici permet d'accélérer la préparation de suspensions cellulaires testiculaires adaptées à l'analyse cytométrique des différents stades de spermatozoïdes chez les rongeurs en seulement 15 minutes, y compris la dissection testiculaire, la coupe du tissu et le traitement via le système de machine ME. La brièveté, la qualité de reproductibilité accrue et les proportions des types cellulaires dans les suspensions cellulaires en font une bonne alternative à d'autres techniques de préparation manuelle actuellement utilisées, plus fastidieuses et chronophages.

De plus, cette méthode impliquant très peu de manipulations et évitant l'utilisation d'enzymes et de détergents, elle constitue un choix idéal pour des applications en aval délicates, telles que les études d'expression génique.