Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Dans cette vidéo, un protocole très simple et efficace pour obtenir la suspension cellulaire du matériel d’essai à partir de rongeurs en seulement 15 minutes sera présenté. La méthode a été appliquée à des tests sur des souris, des rats, des cobayes et utilise un dispositif de méta-machine pour désagréger le tissu encapsulé. Après une filtration et une coloration, l’inion de la cellule est prête à s’écouler.

L’homogénéité des populations cellulaires est une condition préalable à l’analyse des événements biochimiques et moléculaires lors de la différenciation des GA mâles. Ainsi, l’hétérogénéité testiculaire avec plus de 30 types de cellules différents représente l’un des problèmes majeurs concernant l’étude des bases moléculaires de la spermatogenèse des mammifères. Pour cette raison, diverses méthodes ont été utilisées pour obtenir des populations de cellules testiculaires enrichies à purifiées, y compris l’illustration PU et centrifuge.

La première étape de toute méthode de séparation cellulaire est la préparation d’une suspension cellulaire. Cependant, les protocoles actuels prennent généralement du temps et peuvent impliquer la perte de molécules à courte durée de vie telles que les ARN, ce qui n’est pas souhaitable pour l’analyse de l’expression ultérieure. Le principal avantage du protocole présenté ici est qu’il élimine les étapes entre les sacrifices animaux et les études moléculaires spécifiques au stade du spermatozoïde, mais garantit en même temps une bonne qualité et une excellente représentation du type cellulaire dans les suspensions cellulaires.

La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Ana Rodriguez, chercheuse au laboratoire AL qui a développé la méthode, et Federico San Lopez, cytométrie en flux, qui était en charge de l’analyse cytométrique. La procédure nécessite un petit équipement, le système de pêche, avec ses accessoires medicon et fcon. Cependant, les accessoires fcon peuvent être parfaitement remplacés par des membranes en nylon de la même taille de pores.

Les seuls autres matériaux et réactifs nécessaires sont le verre étalé, deux plats, des ciseaux et des pinces, une seringue de trois à cinq millilitres pour déranger la chambre intestinale, un milieu de culture DMM complété par 10 % de sérum contre la toux fœtale et NDA. Si des applications en aval impliquant des manipulations d’ARN sont prévues, tous les matériaux et solutions doivent être traités en conséquence pour exécuter le protocole. Placez le testicule disséqué dans un verre de 96 millimètres selon les données montrant de la glace contenant 10 millilitres de glace supplémentée appelée dm.

Retirez le TAL Virginia, coupez le testicule en morceaux carrés de deux à trois millimètres de chaque côté. Placez quatre à cinq de ces pièces dans un médicament jetable désagrégé avec un millilitre de code complété D et traité dans le système de méta-machine pendant 50 secondes. Chaque unité médicale contient un tamis fixe en acier inoxydable avec une centaine de trous hexagonaux entourés de six micro-lames.

Le tissu est amené à chaque trou par un rotor métallique à l’intérieur de la chambre médicale et désagrégé en passant sur les trous aiguisés et à travers l’écran métallique, tandis qu’une micro-pompe sous l’écran fournit du liquide et rince les coques. Récupérez le résultat en suspension cellulaire du médicament à l’aide d’une seringue de trois à cinq millimètres sans aiguille. Ensuite, trempez un faucon de 50 micromètres ou la même maille en nylon de quatre tailles avec un demi-millilitre de milieu et filtrez la suspension à travers celui-ci.

Répétez l’étape, mais à l’aide d’un filet de nylon de 25 micromètres ou d’une unité de faucon équivalente et placez-le sur de la glace, prenez une citation ALI de la suspension cellulaire à compter dans une chambre de noyer et ajustez la concentration cellulaire à une à deux fois 10 à sept cellules par millilitre dans les milieux de culture. Enfin, ajoutez du NDA à une concentration finale de 0,2 % pour éviter le pompage cellulaire et également pour éviter l’obstruction musculaire lors des études de débit ultérieures. Si la viabilité cellulaire doit être évaluée, cela peut être effectué au moyen du kit de viabilité des cellules animales vivantes et mortes en suivant les instructions du fabricant avant l’analyse par cytométrie en flux, en ajoutant un colorant fluorescent.

Le choix du fluorochrome dépendra des lasers disponibles. Dans cette démonstration, l’utilisation de différents colorants qui lient le document à l’ADN sera montrée. Bien que le propidium soit le colorant habituel pour les cellules fixes ou mortes à de faibles concentrations, nous avons constaté que lorsqu’il est utilisé à des concentrations élevées, le ROM pénètre dans les cellules testiculaires non fixées dans les suspensions préparées par la méthode présentée ici.

Cela est probablement dû à la contrainte mécanique impliquée, qui, combinée à la nature sensorielle de l’épithélium semial, pourrait entraîner la rupture des ponts de connexion de cellule à cellule avec une manipulation minimale Pour la coloration à l’iodure de propidium 10 minutes avant l’analyse de l’échantillon à la solution à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre à la suspension cellulaire et incuber un degré Celsius de zéro degré Celsius dans l’obscurité Pour l’analyse des cellules de coloration au propidium mu. Pour un tri plus poussé, nous utilisons un cytomètre de flux Fax Vantage équipé d’un laser ionique targon cohérent réglé pour émettre à 488 nanomètres. La puissance du laser est réglée à cent milliwatts et la fluorescence émise par le propidium I est collectée par un détecteur FL deux à l’aide d’un filtre passe-bande 5, 7, 5, barre oblique, 26

Utilisez une buse de 70 micromètres pour les mesures de cytométrie en flux et un logiciel squa pour analyser les paramètres suivants. Diffusion latérale de la diffusion vers l’avant, fluorescence totale émise ou zone d’impulsion et durée des émissions fluorescentes ou largeur d’impulsion. Les résultats sont présentés en grammes représentant le nombre d’événements à chaque niveau de fluorescence et dans des graphiques en D montrant la diffusion latérale en fonction de la zone d’impulsion fluorescente et la zone d’impulsion fluorescente en fonction de sa largeur.

Les doublets sont exclus de l’analyse à l’aide de tracés DO de la zone d’impulsion fluorescente en fonction de sa largeur pour trier les populations de monocytes SM avec le mode de tri R normal ou C normal et utilisent trois gouttes triées comme enveloppe. Ajustez le différentiel d’échantillon pour analyser les cellules à une vitesse de 500 à 1500 par seconde. Conservez les tubes d’échantillon et de prélèvement à une température de trois à quatre degrés Celsius à l’aide d’une unité de réfrigération.

Alternativement, les cellules de la suspension peuvent être colorées avec d’autres fluorochromes. Par exemple, le colorant vital. HER 3 3 3 4 2 peut être utilisé à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et incubé pendant au moins 10 minutes à 37 degrés à l’abri de la lumière pour Hirsch.

3, 3, 3, 3, 4, 2 échantillons de colorants. L’analyse cellulaire a été réalisée à l’aide d’un cytomètre en flux MO équipé d’un laser à longueur d’onde d’excitation UV fonctionnant à 25 milliwatts et d’une buse de 70 micromètres. Utilisez le logiciel Summit 4.3 ou similaire pour analyser les mêmes paramètres indiqués précédemment lorsque les suspensions de cellules sont analysées sous l’optique de contraste du visage, des suspensions de qualité de coupe sont observées.

Les principaux avantages de ce protocole sont en premier lieu des suspensions de cellules testiculaires préparées à l’aide de nombreuses machines et n’obtenant que 15 minutes, y compris le test, la césarienne, la coupe de tissus, l’ach, le traitement mécanique et la filtration, ce laps de temps environ un huitième du temps habituellement pris par d’autres protocoles. La brièveté de ce protocole ainsi qu’une manipulation minimale permettraient de bien conserver les macromolécules à courte durée de vie, ce qui est essentiel lorsqu’un échantillon représentatif des composés présents dans la population cellulaire d’origine est requis. Comme le méthane implique une manipulation minimale, il est facilement reproductible dans ce tableau.

Les pourcentages relatifs des différentes populations de cellules testiculaires pour sept expériences indépendantes réalisées sur des rats adultes et analysées par cytométrie en flux sont présentés à titre d’exemple pour montrer la reproductibilité de la méthode. Contrairement à la plupart des particules actuellement utilisées pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires, la méthode présentée ici n’implique pas d’action enzymatique. Bien que la collagénase s’écoule dans un ARN, qui sont les enzymes généralement incluses, contribue à une ségrégation insuffisante du tissu, elle peut affecter la préservation des macromolécules d’intérêt.

L’absence de traitements enzymatiques favorise non seulement la préservation de l’ARN et des protéines, mais rend également un protocole moins cher. Bien qu’il ait été rapporté précédemment que les suspensions cellulaires préparées mécaniquement s’agglutinaient plus facilement que les suspensions inisées par tryps, nous avons constaté que ce protocole conduit à des suspensions cellulaires bien désagrégées en l’absence d’action enzymatique. L’inclusion de la NDA s’est avérée très utile dans la prévention de l’agglutination cellulaire.

La bonne qualité des suspensions est également mise en évidence lorsque les échantillons sont soumis à une analyse cytométrique, à en juger par le minimum de débris cellulaires observés. Selon les informations publiées, environ 13 % des spermatozoïdes ronds se retrouvent multinucléés, soit lorsque les suspensions cellulaires sont préparées par une méthode exclusivement mécanique, soit en présence de trypsine. Cependant, de nombreuses suspensions préparées à la machine rendent les multinucléés très rares, probablement en raison de la réduction de l’enchevêtrement, car il a été déclaré que les multinucléés sont produits principalement à la suite de la manipulation des tissus.

Un exemple d’une suspension cellulaire préparée à la machine à partir de testicules de rat est observé dans cette image. Comme on peut le voir. Les cytoplasmes sont bien conservés, les pourcentages relatifs de cellules C, 2 C et 4 C dans de nombreuses suspensions testiculaires préparées à la machine pour différents rongeurs ont réassemblé celles des PE intacts.

Cela soutient l’hypothèse selon laquelle la méthode décrite ici n’endommage pas sélectivement un type de cellule spécifique. Étonnamment, la représentation du type cellulaire dans de nombreuses suspensions préparées à la machine est beaucoup mieux maintenue qu’avec les méthodes classiques de préparation au goutte-à-goutte. Comme on peut le voir, les graphiques de cytographie obtenus pour les suspensions de cellules testiculaires traitées meine ne diffèrent pas sensiblement de celles précédemment rapportées.

En fait, les histogrammes et les diagrammes à points obtenus présentent les trois populations caractéristiques de cellules testiculaires C à C et C basées sur le contenu en ADN ainsi que la population apparemment subha, qui représente les spermatozoïdes haploïdes hautement condensés. Ces profils ont été observés soit pour ses suspensions de coloration à l’iodure de propidium, respectivement, et cela vaut également pour les spécimens adultes et juvéniles. Le tri des cellules sper mitogènes a été réalisé avec succès avec une pureté de plus de 98 %, soit pour des populations testiculaires sélectionnées en fonction de leur contenu en ADN, soit même pour des sous-populations ayant le même contenu en ADN, mais un niveau de condensation de la chromatine différent tels que les myocytes de sommeil et de tine.

Comme nous avons pu l’observer dans les suspensions de tests de cobayes, comme le protocole n’inclut pas le traitement par ARN, les populations triées rendent un ARN de bonne qualité et permettent des études d’expression génique différentielles même pour les populations colorées à l’iodure de propidium. En ce sens, il convient de rappeler que, contrairement à d’autres colorants, aux colorants à l’iodure de propidium, à l’ADN ainsi qu’à l’ARN double brin, cependant, dans ce graphique d’une analyse de la suspension testiculaire d’un cobaye, les profils similaires obtenus en utilisant de l’iodure de propidium en parallèle avec de l’orange vif à cycle élevé. Il s’agit d’un colorant spécifique de l’ADN vital qui montre que la coloration de l’ARN n’influence pas de manière significative les modèles d’histogramme cytométrique.

Cette liste récapitule les principaux avantages du protocole en pourcentage. La méthode optimisée décrite ici permet d’accélérer la préparation de suspensions de cellules testiculaires appropriées pour l’analyse cytométrique des différents stades des spermatozoïdes de rongeurs en seulement 15 minutes, y compris la dissection des testicules, la coupe des tissus et le traitement à travers le système de machine ME. La brièveté, la qualité de reproductibilité plus élevée et les proportions de types de cellules dans les suspensions cellulaires en font une bonne alternative pour d’autres techniques d’auto-préparation plus fastidieuses et chronophages actuellement utilisées.

De plus, comme cette méthode implique très peu de manipulation et évite les enzymes et les détergents, elle constitue un choix idéal pour les applications délicates en aval telles que les études d’expression génique.