Isolement de cellules de Sertoli régulatrices immunitaires à partir de tubules séminifères de souris

Les tubes séminifères des testicules contiennent des cellules de Sertoli, qui nourrissent les cellules germinales. Les cellules de Sertoli sont reliées par des jonctions serrées et sont fermement attachées à la matrice basale riche en acide hyaluronique. Cette disposition des cellules de Sertoli régule l’entrée des cellules immunitaires dans le tubule et protège les cellules germinales en développement de la dégradation.

Pour isoler les cellules de Sertoli, commencez par un tube contenant des tubes séminifères partiellement digérés dérivés de testicules de souris. Ces tubules manquent de cellules péritubulaires - des cellules musculaires lisses entourant les tubes séminifères.

Traitez les tubules avec un cocktail d’enzymes contenant de l’hyaluronidase – essentielle à l’hydrolyse de l’acide hyaluronique – et de la DNase.

Les hyaluronidases pénètrent dans les tubules et clivent l’acide hyaluronique – un polysaccharide basal – initiant le détachement des cellules de Sertoli de la matrice basale et libérant des cellules germinales dans la solution. La DNase digère tous les contaminants de l’ADN de la solution, empêchant ainsi l’agrégation cellulaire.

Lavez les tubules digérés par voie enzymatique avec un tampon, en éliminant les enzymes résiduelles, les fragments cellulaires et les cellules germinales. Remettez en suspension les tubules digérés et chargez la suspension dans un ensemble aiguille-seringue.

Passez la solution à plusieurs reprises pour créer un cisaillement hydrodynamique et perturber les jonctions serrées des cellules de Sertoli, en les libérant sous forme de cellules uniques avec les cellules germinales restantes.

Filtrez la suspension cellulaire, en éliminant les débris cellulaires et en obtenant une suspension unicellulaire. Centrifuger le filtrat pour granuler les cellules.

Remettre les cellules en suspension dans un milieu de croissance sans sérum pour une expansion sélective des cellules de Sertoli.

Pour isoler les cellules de Sertoli, utilisez une nouvelle pipette de 25 millilitres pour remettre en suspension les tubules bien installés dans 25 millilitres de PBS. Après avoir laissé les tubules reposer pendant encore 12 minutes, utilisez la même pipette pour laver les tubules trois fois de la même manière. Ensuite, transférez les tubules dans un nouveau flacon à bouchon à vis de 100 millilitres et ajoutez la solution d’hyaluronidase-DNase-I. De plus, digérez les tubules dans un bain-marie à 32 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Vérifier une aliquote de la suspension par inspection au microscope optique à un grossissement de 100x. Les tubules courts, les agrégats tubulaires et les cellules libérées doivent être visibles. Laissez les agrégats tubulaires se déstabiliser pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette neuve de 25 millilitres pour prélever le surnageant et laver les agrégats quatre fois dans 25 ml de PBS, avec 10 minutes de sédimentation entre chaque lavage.

La population de PTC contaminants aura été réduite. Après le dernier lavage, ajoutez 20 ml de milieu RPMI 1640 dans les cellules et passez la suspension dans une aiguille 18G montée sur une seringue de 20 millilitres 10 fois. Ensuite, confirmez rapidement que tous les agrégats ont été dissociés et filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns pour obtenir une suspension unicellulaire pure.

Faites tourner le filtrat à l’aide de la pipette de 25 millilitres pour aspirer soigneusement le surnageant. Ensuite, mettez en suspension les cellules de Sertoli isolées dans 40 ml de milieu RPMI 1640 sans sérum. Ensuite, comptez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trypan et ajustez la concentration cellulaire à 3 x 10⁶ cellules par millilitre. Enfin, nourrissez 1 millilitre de cellules par puits dans une plaque à six puits.