Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

L’objectif global de cette procédure est de séparer les différents types de cellules présentes dans les testicules. Tout d’abord, récoltez une population mixte de cellules de la souris. Les testicules chargent les cellules et le gradient BSA dans l’appareil de maintien.

Laissez maintenant les cellules sédimenter à travers le gradient BSA. Ensuite, collectez les fractions et combinez-les en fonction de la composition cellulaire. En fin de compte, la sédimentation à vitesse avec le stay put est utilisée pour séparer différents types de cellules des testicules en fonction des différences de taille et de densité.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les faits, est que l’on peut isoler de grandes quantités de différents types de cellules avec une pureté assez élevée en utilisant de la verrerie simple et la gravité. Fixez les deux cylindres de deux litres et la chambre de chargement de la cellule à la plate-forme supérieure et connectez le tout avec deux petits morceaux de tube avec des colliers de serrage. Fermez tous les tubes et scellez le bec sur le cylindre de deux litres le plus à droite.

Placez une petite barre d’agitation dans la chambre de chargement de la cellule et une barre d’agitation plus grande dans le cylindre de deux litres le plus à gauche. Placez ensuite la chambre de sédimentation de deux litres sur la plate-forme. Positionnez le déflecteur métallique directement sur le dessus de l’ouverture au fond de la chambre de sédimentation pour éviter le tourbillon du liquide et la perturbation du gradient cellulaire lors de la collecte des fractions.

Placez maintenant le couvercle sur la chambre de sédimentation. Appliquez une très petite quantité de graisse sous vide sur le joint en verre rodé du robinet d’arrêt à trois voies. Fixez ensuite le robinet d’arrêt au fond de la chambre de sédimentation, en reliant les joints en verre rodé du robinet d’arrêt et de la chambre de sédimentation.

Ensuite, connectez la chambre de chargement de la cellule à la sortie droite du robinet d’arrêt avec tubulaire. Fermez le robinet d’arrêt, puis fixez le tube de fractionnement de la cellule à la sortie gauche du robinet d’arrêt et fixez le petit tube tout en bas. Versez la solution à 2 % BSA dans le cylindre gauche de deux litres.

Versez la solution à 4 % BSA dans le cylindre droit de deux litres. Assurez-vous qu’il n’y a pas de grosses bulles dans le tube qui relie ces cylindres. Versez le tampon Krebs dans la chambre de chargement de la cellule et remplissez le tube reliant cette chambre à la chambre de sédimentation.

Vérifiez qu’il n’y a pas de grosses bulles susceptibles de perturber le dégradé. Si nécessaire, pressez ou effleurez doucement le tube pour éliminer les bulles. Confirmez que toutes les crebs se trouvent dans le tube et non dans la chambre cellulaire.

Laissez une petite quantité de tampon Krebs s’écouler dans la chambre de sédimentation. Videz ensuite presque tout le tampon dans le tube de fractionnement de la cellule. Afin de remplir le tube et d’éliminer les grosses bulles, placez le collecteur de fractions directement sous la chambre de sédimentation.

Vérifiez que tous les tubes de fraction sont en place et couvrez-les d’une pellicule plastique pour éviter toute contamination. Désencapsulez les testicules dans une plaque séparée contenant huit millilitres de Krebs. Faites une incision dans la fine membrane qui entoure les tubes séminifères avec une paire de pinces.

Tenez maintenant la membrane avec une autre paire de pinces. Poussez les tubules hors et loin de la membrane. Transférez quatre millilitres de Krebs contenant les tubules dans chaque tube conique contenant 25 millilitres de solution de collagénase.

Agitez à 33 degrés Celsius pendant 10 minutes jusqu’à ce que les tubules développent une apparence de spaghetti. Ensuite, laissez les tubules se déposer pendant cinq minutes au fond du tube. Versez le surnageant et lavez deux fois avec 25 millilitres de Krebs à température ambiante, en laissant les tubules se déposer au fond du tube à chaque fois.

Laissez environ cinq millilitres de Krebs dans chaque tube. Après avoir incubé les tubules avec de la trypsine. Utilisez une pipette de gros calibre pour agiter la solution contenant les tubules.

En les pipetant et en sortant environ 10 fois. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension à cellule unique. Filtrez maintenant chaque suspension à cellule unique de 30 millilitres à travers une crépine à mailles de 100 microns.

Après avoir combiné les suspensions de cellules, comptez le nombre total de cellules. Assurez-vous que le robinet d’arrêt est positionné pour diriger l’écoulement de la chambre cellulaire vers la chambre de sédimentation. Tournez les deux plaques du bar à agitation sur un réglage bas.

Versez ensuite la suspension cellulaire dans la chambre cellulaire. Ouvrez le robinet d’arrêt pour que les cellules s’écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à une vitesse de 10 millilitres par minute. Fermez ensuite le robinet d’arrêt pour laver les cellules hors de la chambre cellulaire.

Versez cinq millilitres de solution BSA à 0,5 % et égouttez-les dans la chambre de sédimentation à raison de 10 millilitres par minute. Fermez le robinet d’arrêt et répétez le lavage BSA quatre fois de plus. Ouvrez maintenant les pinces entre la chambre de la cellule et les deux cylindres de deux litres pour évacuer immédiatement le liquide dans la chambre de sédimentation à une vitesse de 40 millilitres par minute, ajustez le débit de sorte qu’il faut environ 20 à 30 minutes pour charger le gradient BSA dans la chambre de sédimentation.

Surveillez la présence d’une fine couche non perturbée de cellules situées au-dessus du gradient BSA. Une fois que la majeure partie du BSA est chargée, fermez le robinet d’arrêt et tournez-le dans la position qui permettra au liquide de s’écouler de la chambre de sédimentation dans le tube de fractionnement. Éteignez maintenant les plaques d’agitation et laissez les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes.

Une fois la sédimentation terminée, fixez le tube de fraction au collecteur de fractions. Ajustez le débit avec le robinet d’arrêt de manière à ce que 10 millilitres par tube de collecte soient collectés toutes les 45 secondes. Une fois que toutes les fractions sont collectées, analysez-les au microscope pour différentes populations cellulaires.

Différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et de la morphologie nucléaire pour déterminer la pureté de chaque fraction. Transférez 10 microlitres de cellules colorées DPI sur une lame. Placez une lamelle et analysez avec un microscope à fluorescence.

Tirez les fractions qui sont similaires en taille et en morphologie nucléaire pour créer des populations de cellules. Une préparation typique d’environ 22 testicules. Avec cette procédure de maintien en place, on obtient environ 10 à la huitième cellule.

Les fractions de type cellulaire métagénique Perper peuvent être analysées rapidement à l’aide d’une combinaison de microscopie optique et fluorescente. Les cellules myotiques, spermatogoniales et diploïdes somatiques sont les plus grandes cellules trouvées dans les testicules et contiennent de gros noyaux qui se colorent de manière relativement homogène avec dpi. Les spermatides rondes sont des cellules plus petites avec des noyaux ronds plus petits, généralement avec un centre chromo de coloration brillante condensant Les spermatides allongées sont de petites cellules qui ont des noyaux en forme de faucille.

Une fois que les fractions cellulaires sont combinées, la pureté peut être déterminée par une analyse sanguine occidentale des lysats cellulaires. Les marqueurs courants des cellules myotiques sont les protéines Synap Neal Complex. Les marqueurs courants des spermatides condensatives sont les protéines de transition ou la protamine.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est exécutée correctement après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la spermatogenèse pour explorer les processus cellulaires dans différents types de cellules à partir des testicules.