Name: Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Apprenez la séparation des cellules spermatogéniques par sédimentation STA-PUT sur gradient BSA. Cette méthode isole efficacement les populations cellulaires testiculaires de souris pour l'étude de la spermatogenèse.

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Cette recherche a été financée par le NIH subventions GM055360 de SLB et U54HD068157 de RGM. JMB a été pris en charge par la subvention de formation T32 génétique à l&#39;Université de Pennsylvanie (GM008216).

Le protocole STA-PUT comporte trois étapes: 1) Mise en place de l&#39;appareil et les réactifs, 2) Préparation de la suspension de cellules de testicules entiers, et 3) Cell, la sédimentation, et la collecte de fractions. Quand elle est réalisée par une équipe de deux chercheurs, le protocole faut huit heures en moyenne. Une. Mise en place du Dispositif STA-PUT (Figure 1) *** Appareil STA-PUT doit être placé dans un 4 ° C grand réfrigérateur ou une chambre froide qui peut également accueillir un collecteur de fraction, si ce mode de collecte est préférable. <ol><li> La nuit avant (ou au moins quelques heures avant), vous effectuez la méthode, laver tous les équipements (en particulier la verrerie et de tubes) et stériliser à l&#39;éthanol à 70%. Laissez sécher le matériel avant le montage de l&#39;appareil, comme illustré à la figure 1. </li><li> Fixez les deux cylindres 2 L (figures 1B et C) et la chambre cellule de chargement ( <strong&gt; Figure 1A) à la plate-forme supérieure et relier le tout avec deux petits morceaux de tube avec colliers de serrage. Fixez tous les tubes fermés. Sceller le bec sur le plus à droite 2 L cylindre. </li><li> Placer une petite barre d&#39;agitation dans la chambre cellule de chargement (figure 1A) et une plus grande barre d&#39;agitation dans le cylindre 2 L plus à gauche (figure 1B) qui contiendra le 2% de BSA. </li><li> Placer la chambre de sédimentation de 2 L sur la plate-forme (figure 1D). Placer la chicane métallique (figure 1F) directement au-dessus de l&#39;ouverture dans le fond de la chambre de sédimentation (Figure 1D). Ceci est important, car la chicane empêche tourbillonnement du liquide et de la perturbation du gradient de la cellule au cours de la collecte de fraction. Placer le couvercle sur le dessus de la chambre de sédimentation. </li><li> Après l&#39;application d&#39;une très petite quantité de graisse à vide pour le joint en verre rodé du robinet à trois voies (Figure 1G), serrer le robinet d&#39;arrêt à la partie inférieure de la sechambre de dimentation, reliant les joints en verre rodé du robinet d&#39;arrêt et la chambre de sédimentation. </li><li> Relier la chambre de cellule de chargement (Figure 1A) vers la droite la sortie du robinet d&#39;arrêt avec tubulure. Fermer le robinet. </li><li> Fixer le tube de fractionnement de cellule vers la sortie du robinet d&#39;arrêt gauche. Le tube de fractionnement comprend un morceau de tube avec une pipette Pasteur en verre reliée à l&#39;extrémité ouverte. Un petit morceau de tube de diamètre est fixée à l&#39;extrémité étroite de la pipette en verre. La pipette étroite limite l&#39;écoulement de la suspension de cellules pendant la fraction collecteur. Fixez ce petit tube au bas. </li><li> Préparer 2 L Krebs (1x) tamponner le jour de l&#39;expérience (tableau 1). Ensuite, préparer 550 ml de 2% de BSA dans du Krebs 1x, 550 ml de 4% de BSA dans du Krebs 1x, et 50 ml de 0,5% de BSA dans du Krebs 1x. Filtrer et refroidir ces solutions à 4 ° C. </li><li> Verser la solution de BSA à 4% dans le cylindre droit 2 L (figure 1C) et la BSA à 2%solution dans le cylindre de gauche 2 L (figure 1B). Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de grosses bulles dans le tube qui relie ces cylindres. </li><li> Verser tampon Krebs dans la chambre cellule de chargement et de remplir le tube reliant cette chambre avec la chambre de sédimentation, en veillant qu&#39;il n&#39;y a pas de grosses bulles, car ils pourraient perturber le gradient. Presser ou effleurant le tube aide doucement pour enlever les bulles. Assurez-vous que tout le tampon de Krebs est dans le tube et pas dans la chambre de cellule. </li><li> Laissez une petite quantité de tampon Krebs de s&#39;écouler dans la chambre de sédimentation et puis égouttez presque tout le tampon dans le tube de fractionnement cellulaire afin de remplir le tube et enlever les grosses bulles. </li><li> Placer le collecteur de fractions, directement sous la chambre de sédimentation. Assurez-vous que tous les tubes de fractions sont en place et recouverts d&#39;une pellicule de plastique pour éviter la contamination. </li></ol> 2. Isoler les cellules de la spermatogenèse de testicules entiers <ol&gt; <li> Disséquer les testicules de ca 12 souris adultes (de préférence au moins huit semaines) et les placer dans un tampon de Krebs à la température ambiante pour laver toute matière contaminante. Ce protocole est démontré implique l&#39;utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec les lignes directrices de l&#39;Université de Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux en Pennsylvanie. </li><li> Ajouter 45 mg de collagénase à 50 ml de tampon Krebs dans un tube conique juste avant vous avez l&#39;intention d&#39;ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques. </li><li> Décapsuler les testicules dans une plaque séparée contenant 8 ml de tampon Krebs, en rejetant la tunique albuginée et libérer les tubules séminifères. La tunique albuginée est la fine membrane qui entoure les tubes séminifères. Les tubes devraient facilement se détacher de l&#39;albuginée. Pour ce faire, faire une incision dans la tunique albuginée, maintenez cette membrane avec une pair des forceps, et pousser les tubes et hors de l&#39;écart de la membrane avec une autre paire de forceps. </li><li> Ajouter 4 ml de tampon de Krebs contenant les tubules à chaque tube conique contenant 25 ml de solution de collagénase et incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. A la fin, les tubules devraient avoir une apparence «spaghetti-comme&quot;. </li><li> Laisser les tubules se déposer pendant environ 5 min à la partie inférieure du tube. Verser le surnageant et laver 2x dans 25 ml de tampon Krebs (à température ambiante), ce qui permet les tubules de se déposer au fond du tube à chaque fois. Ajouter 5 ml de tampon Krebs ~ dans chaque tube. </li><li> Bien laver, ajouter 30 mg de trypsine à 50 ml de tampon Krebs dans un tube falcon juste avant vous avez l&#39;intention d&#39;ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques. </li><li> Ajouter 25 ml de solution de trypsine à chacun des deux tubes contenant les tubules. Ajouter 3 pg DNAse (1 μg/10ml) à chaque tube pour éviter cellules à partir de l&#39;agglutination. Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. </li><li> Utiliser une pipette de grand calibre pour agiter la solution contenant les tubes, les pipetage dans et hors d&#39;environ 10x. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension cellulaire unique. </li><li> Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant encore 10 min. Utiliser une pipette de grand calibre pour disperser les tubules dans une suspension de cellules individuelles, les pipetage dans et hors d&#39;environ 25x. Si vous voyez encore beaucoup de tubes ou amas de cellules, disperser plus avec la pipette et / ou ajouter un autre 3 pg DNAse à chaque tube (concentration initiale double). </li><li> On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille 100 um (un pour chaque tube de 30 ml de suspension cellulaire). Combiner les suspensions cellulaires et de compter le nombre total de cellules (qui devrait être entre 7-8 x 10 8 cellules). *** NE PAS charger plus de 800 000 000 cellules sur le gradient. </li><li> Sur la base du nombre de cellules obtenu à l&#39;étape 2.10, le culot approprle volume iate de cellules filtrées à 450 rcf pendant 5 minutes et laver avec 30 ml de tampon Krebs. Répétez. Habituellement *** 22 testicules vont produire plus de 800 000 000 cellules, mais ne chargez pas plus de ce nombre de cellules. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec précaution dans 25 ml de 0,5% de BSA contenant entre 2,5 et 5 pg de DNAse (en fonction du degré d&#39;agglutination cellulaire) sans créer de bulles. Assurez-vous que les cellules ne se collent pas. On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille de 100 um. Les cellules sont maintenant prêts à charger. Mélangez bien avant le chargement en inversant le tube plusieurs fois. </li></ol> 3. Cellule de chargement et de sédimentation <ol><li> Assurez-vous que le robinet d&#39;arrêt est fermée, mais dans la position qui permet au liquide de s&#39;écouler de la chambre de cellule (figure 1A) dans la chambre de sédimentation (Figure 1D). </li><li> Tournez les deux plaques de barres d&#39;agitation sur un réglage bas (environ 70 min) pour permettre aux barres d&#39;agitation pour se déplacer en permanence, mais lentement. </li><li> Verser la suspension de cellules dans la chambre de cellule (figure 1A) et d&#39;ouvrir le robinet d&#39;arrêt de telle sorte que les cellules s&#39;écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min (figure 1D). Fermer le robinet. Le débit peut être déterminé par le marquage des intervalles de volume de la chambre de sédimentation. </li><li> Verser 5 ml de solution de BSA à 0,5% dans la chambre de cellule et de s&#39;écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min. Fermer le robinet. Cette étape de lavage des cellules en dehors de la chambre de cellule. Répétez 4x. </li><li> Préparer le gradient: ouvrir les pinces entre la chambre à cellules (Figure 1A) et les deux cylindres 2 L (Figure 1B et C), et de commencer à vider le liquide dans la chambre de décantation à un débit de 40 ml / min (figure 1D) immédiatement. Ajuster le débit d&#39;écoulement de sorte qu&#39;il faut environ 20 à 30 min pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation. Une mince couche de cellules intactes située au-dessus de laBSA gradient doit être visible. Une fois la plupart des BSA est chargé, fermer le robinet et le tourner à la position qui permettra liquide s&#39;écouler de la chambre de sédimentation dans le tube de fractionnement. </li><li> Eteignez les plaques d&#39;agitation. </li><li> Laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes. NE TOUCHEZ PAS L&#39;APPAREIL PENDANT CE TEMPS. Toute agitation mécanique pourrait perturber le gradient. </li></ol> 4. Le fractionnement et l&#39;analyse des fractions *** Lorsque vous effectuez les étapes suivantes, veillez à ne pas perturber le gradient. Si le gradient BSA est perturbé, la procédure ne fonctionnera pas! <ol><li> Une fois que les cellules ont sédimenté, vider lentement 50 ml de la chambre de sédimentation dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Cette fraction contient généralement des amas de cellules non désirées et les débris. </li><li> Fixez le tube de fraction vers le collecteur de fraction. *** Il est également possible de recueillir les fractions à la main si une fraction de collecteur n&#39;est pas disponible. </li><li> Recueillir des fractions: Régler le débit avec le robinet de sorte que 10 ml (remplissage d&#39;un tube de collecte) sont recueillies toutes les 45 sec. </li><li> Boucher les tubes de collecte de fraction et tourner pendant 5 min à 450 rcf à 4 ° C. Verser doucement le surnageant, remettre les cellules en liquide restant, et garder les cellules sur la glace. </li><li> Une fois toutes les fractions sont recueillies, analyser au microscope les fractions de différentes populations cellulaires. Différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et la morphologie nucléaire 8,15. Figure 2 illustre &quot;des résultats représentatifs&quot; pour les trois fractions rassemblées qui sont enrichies en cellules et les spermatogonies (a) somatiques et méiotiques, (b) spermatides rondes, et (c) allongement et condensation spermatides. <ul><li> Tapez spermatogonies sont 12 14μm environ. de diamètre et ont des noyaux ronds qui sont homogènes en composition de la chromatine. </li><li> Spermatogonies de type B sont 8-9μm ca. de diamètre et ont rounnoyaux d qui montrent hétérochromatine plus dense le long de la périphérie du noyau. </li><li> Spermatocytes pré-leptotène sont 7,5 8.2μm ca. de diamètre, ont moins de cytoplasme de spermatogonies de type B, et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de type B spermatogonies. </li><li> Spermatocytes primaires sont leptotène 8-10 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes pré-leptotène, mais semblent gagner la chromatine plus dense à la membrane nucléaire. </li><li> Zygotene spermatocytes primaires sont 10-12 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes primaires leptotène. </li><li> spermatocytes Pachytène sont partout de 12 à 18 um ca. de diamètre et sont constituées d&#39;un mince rebord du cytoplasme entourant un gros noyau. Plus amas de chromatine dense peuvent être vus dans le noyau. </li><li> spermatides rondes sont de 10 um ca. de diamètre et ont un noyau rond avec une forte densité de coloration chromocentre au milieu. </li><li> Résiduelcorps sont ~ 6,5 m de diamètre, sont ronds, et n&#39;ont pas de noyau. </li><li> D&#39;allongement et condensation spermatides sont de taille similaire à arrondir spermatides, mais avoir un noyau unique, en forme de faucille. </li></ul><ol><li> Commencez par fraction de 15 et d&#39;analyser tous les cinq fractions jusqu&#39;à 85. Habituellement, les fractions inférieures à 15 seront trop mixte et touffue, et les fractions supérieures à 85 contiennent peu ou pas de cellules utilisables. </li><li> Pour analyser une fraction, prendre 5uL de liquide depuis le tube de collecte de fractions (une fois que les cellules ont été remises en suspension après centrifugation) et ajouter à 5uL de 8% de formaldehyde dans du tampon Krebs. Laisser les cellules fixées au repos à température ambiante pendant cinq minutes. </li><li> Ajouter 5uL de 0,1% de Triton et DAPI (5 de tampon μ / ml de Krebs) pour les cellules fixes. Laisser les cellules au repos à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Placer 10 ul de la solution obtenue sur une lame, couvrir avec une lamelle, et d&#39;analyser avec un microscope à fluorescence pour déterminer la pureté de chaque fraction. </li><li> Combiner les fractions qui sont similaires en taille et la morphologie nucléaire (voir «Les résultats représentatifs») pour créer les populations suivantes de cellules: les cellules diploïdes de la méiose et somatiques, spermatides rondes et condensation / montaison spermatides. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Ce protocole est démontré implique l&#39;utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Animaux utilisés dans ce protocole sont maintenues sous la direction et l&#39;approbation de l&#39;Université de comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Pennsylvanie (IACUC protocole # 804284).

Ceux qui étudient la spermatogenèse s&#39;appuient sur ​​des modèles animaux pour des échantillons de cellules spermatiques, comme il n&#39;existe pas encore un système de culture cellulaire fiable pour générer tous les types cellulaires de la spermatogenèse 3. Bien que les cellules spermatiques sont facilement collectées à partir des testicules entiers, seule une population mixte résulte. Cela pose un problème pour ceux qui souhaitent étudier les sous-types spécifiques de ces cellules, comme les cellules méi...

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules 1. En bref, la tige-comme spermatogonies qui résident près de l&#39;épithélium du tubule séminifère fracture et se différencient en spermatocytes, qui subissent alors des divisions méiotiques. Après la méiose est terminée, les cellules haploïdes résultant, ou spermatides rondes, subissent la spermiogenèse, un processus de différenciation qui implique l&#39;effusion du cytoplasme et le compactage du noyau. Spermatides développent progressivement un flagelle et subissent un allongement et la condensation du noyau, la production d&#39;allongement puis condensation spermatides, respectivement. Les produits finaux sont les spermatozoïdes, qui sont libérés dans la lumière du tube séminifère et finalement dans l&#39;épididyme, où ils mûrissent plus loin. Parce que le processus de la spermatogenèse dépend des conditions hormonaux et moléculaires spéciauxles testicules, un système fiable de culture in vitro pour l&#39;ensemble du processus de la spermatogenèse n&#39;a pas encore été mis au point 2,3. Les méthodes de culture ont été développés pour créer des &quot;cellules analogues à des cellules germinales primordiales» et «cellules rondes de spermatides comme&quot; haploïdes à partir de cellules souches, mais ces méthodes ne sont pas encore en mesure de générer un grand nombre de ces cellules et ne parviennent pas à produire cellule spermatogenèse plus tard types de 4,5. Heureusement, les types de cellules spermatiques diffèrent de manière significative dans la taille, ce qui permet une suspension à cellule unique obtenue à partir de testicules entiers à séparer avec un gradient liquide. La méthode STA-PUT, démontré ici, utilise un gradient linéaire BSA et simple sédimentation pour séparer les cellules spermatiques fonction de la taille et de la masse 6-9. La méthode STA-PUT a plusieurs avantages par rapport aux deux autres méthodes les plus utilisées pour séparer les types de cellules spermatiques: FACS et élutriation 10-13. L&#39;appareil STA-PUT nécessite ONLy plusieurs pièces de verrerie spécialisé assemblés dans une chambre froide ou un grand réfrigérateur. Ainsi, il est moins coûteux que d&#39;utiliser un trieur de cellules ou un séparateur par décantation. La méthode STA-PUT produit des quantités plus élevées de cellules par type de cellule et les testicules que peuvent être triés par FACS dans un laps de temps comparable, bien que la pureté de chaque population de cellules n&#39;est pas aussi élevés que ceux obtenus avec FACS 11. Tri cellulaire utilisant des billes magnétiques (magnétique tri cellulaire activé, MACS) a récemment été utilisée avec succès pour l&#39;enrichissement de spermatogonies à partir d&#39;une population de cellules testiculaires mixte, mais il est actuellement inadapté pour séparer spermatocytes ou spermatides en raison du manque de connaissances de surface appropriée les marqueurs 14. Un avantage supplémentaire de la méthode STA-PUT sur FACS ou MACS est la capacité à isoler des cellules viables aptes à la culture ultérieure parce que, contrairement à la plupart des protocoles de FACS, il ne nécessite pas d&#39;ADN ou d&#39;autres types de coloration. Pour des études nécessitant lrendements arge de la spermatogenèse types de cellules à ~ 90% de pureté, le STA-PUT est une méthode idéale.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Solutions BSA à 0,5 %, 2 % et 4 %</td><td>Dissoudre 0,25 g, 11 g et 22 g (respectivement) dans des volumes totaux de 50 ml, 550 ml et 550 ml de 1x KREBS (respectivement).</td><td>À faire jour de la procédure STA-PUT. Filtrer la stérilisation.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g de dextrose + 3,78 g de CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, porter à 2 L avec l’autoclave ddH20</td><td>et stocker à 4 &deg ; C depuis plusieurs mois.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissoudre 4,24 g de NaHCO3 dans 100 ml de ddH20. Ajouter 200 ml 10x KREBS. Porter à 2 L avec ddH20.</td><td>À faire jour de la procédure STA-PUT. Filtrer la stérilisation.</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (~37 %)</td><td>Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLEAU 2 : EQUIPEMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Catalogue de l’entreprise</td><td>#</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Appareil STA-PUT complet</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (ce procédé utilise la chambre de sédimentation standard : Cat. N° 56700-500)</td><td>Comprend toute la verrerie et l’équipement de l’appareil. Une verrerie alternative est disponible pour effectuer STA-PUT avec des nombres de cellules plus petits.</td></tr><tr><td>10 &mu ; Filtre à mailles Fisherbrand</td><td></td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>de souris Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de collecte de fractions à fond rond de 14 ml avec bouchons</td><td>Préférence du chercheur</td><td></td><td></td>Besoin d’environ</tr><tr><td>100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collecteur de fractions</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Modèle : Frac-920, Code produit : 18-1177-40</td><td>Une alternative peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Lames de microscope, verre de protection</td><td>Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique/fluorescent</td><td>Préférence du chercheur</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

séparation des types cellulaires de la spermatogenèse utilisation sta-put vitesse de sédimentation

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules. Actuellement, il n&#39;existe pas de système de culture cellulaire fiable permettant la différenciation de la spermatogenèse in vitro, et la plupart des études biologiques des cellules spermatiques nécessite récolte des tissus de modèles animaux comme la souris et le rat. Parce que le testicule contient de nombreux types cellulaires - à la fois non-spermatogenèse (Leydig, de Sertoli, myéloïdes et les cellules épithéliales) et la spermatogenèse (spermatogonies, spermatocytes, spermatides rondes, condensation spermatides et spermatozoïdes) - études des mécanismes biologiques impliqués dans la spermatogenèse nécessiter l&#39;isolement et l&#39;enrichissement de ces différents types cellulaires. Procédé STA-PUT permet la séparation d&#39;une population hétérogène de cellules - dans ce cas, des testicules - à travers un gradient linéaire de BSA. Types cellulaires individuels sédimentent avec la vitesse de sédimentation différente selon CEtaille de ll, et les fractions enrichies en différents types de cellules peuvent être recueillies et utilisées dans d&#39;autres analyses. Bien que la méthode STA-PUT n&#39;entraîne pas de fractions très pures de types de cellules, par exemple comme on peut obtenir avec certaines méthodes de tri cellulaire, il ne fournit avec un rendement beaucoup plus élevé de cellules totales dans chaque fraction (~ 1 x 10 8 cellules / spermatogenèse type à partir d&#39;une population de départ de 08.07 x 10 8 cellules de la cellule). Cette méthode à haut rendement nécessite que la verrerie spécialisée et peut être effectuée dans n&#39;importe quelle pièce froide ou grand réfrigérateur, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui ont un accès limité à de l&#39;équipement spécialisé comme un trieur activé par fluorescence de cellules (FACS) ou élutriateur.

Le résultat idéal de la procédure STA-PUT est une séparation assez notable des cellules des testicules sur la base de la taille des cellules et de la densité. Alors que les cellules isolées à partir des testicules sont sédimentation à travers le gradient de BSA, plusieurs bandes distinctes de cellules peuvent être observées. Toutes les amas de cellules ont tendance à couler au fond de la pente et ne pas contaminer les autres fractions. Un peu plus haut sur la pente sera le grand cellules somatiques et méiotiques. Plus h...

Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité.

Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

L'objectif général de cette procédure est de séparer les différents types de cellules présents dans les testicules. Commencez par récolter une population mixte de cellules à partir de la souris. Chargez les cellules et le gradient de BSA dans l'appareil « stay put ».Permettez maintenant aux cellules de sédimenter à travers le gradient de BSA. Ensuite, récupérez les fractions et combinez-les en fonction de la composition cellulaire. Finalement, la sédimentation de vitesse avec le « stay put » est utilisée pour séparer différents types de cellules issues des testicules selon leurs différences de taille et de densité.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les faits, est qu'elle permet d'isoler de grandes quantités de différents types cellulaires avec une pureté relativement élevée, en utilisant uniquement du matériel en verre simple et la gravité. Fixez les deux cylindres de deux litres et la chambre de chargement des cellules sur la plateforme supérieure, puis reliez-les à l’aide de deux petits morceaux de tubulure munis de pinces. Serrez toutes les pinces pour fermer les tubulures et obturez le bec verseur du cylindre de deux litres situé le plus à droite.Placer une petite barre d'agitation dans la chambre de chargement des cellules et une barre d'agitation plus grande dans le cylindre de deux litres situé le plus à gauche. Ensuite, placer la chambre de sédimentation de deux litres sur la plateforme. Positionner le déflecteur métallique directement au-dessus de l'ouverture située au fond de la chambre de sédimentation afin d'empêcher la formation d'un vortex dans le liquide et de perturber le gradient cellulaire pendant la collecte des fractions.Mettez maintenant le couvercle sur la chambre de sédimentation. Appliquez une très petite quantité de graisse à vide sur l'assemblage sphérique du robinet à trois voies. Ensuite, fixez le robinet en position à l'aide d'une pince au bas de la chambre de sédimentation, en raccordant les assemblages sphériques du robinet et de la chambre de sédimentation.Ensuite, reliez la chambre de chargement des cellules à la sortie droite du robinet à trois voies à l’aide d’un tube. Fermez le robinet à trois voies, puis fixez le tube de fractionnement cellulaire à la sortie gauche du robinet et serrez le petit tube situé tout en bas. Versez la solution de BSA à 2 % dans le cylindre gauche de deux litres.Verser la solution de BSA à 4 % dans le cylindre droit de deux litres. Veiller à ce qu'il n'y ait aucune grande bulle d'air dans le tube reliant ces cylindres. Verser le tampon de Krebs dans la chambre de chargement de la cellule et remplir le tube reliant cette chambre à la chambre de sédimentation.Vérifiez qu'il n'y a pas de grosses bulles susceptibles de perturber le gradient. Si nécessaire, pressez ou tapez doucement sur le tube pour éliminer les bulles. Vérifiez que tout le CREBS se trouve dans le tube et non dans la chambre de la cellule.Laisser s'écouler une petite quantité de tampon de Krebs dans la chambre de sédimentation. Ensuite, évacuer presque tout le tampon vers le tube de fractionnement cellulaire. Afin de remplir le tube et d'éliminer les grosses bulles d'air, placer le collecteur de fractions directement sous la chambre de sédimentation.Vérifiez que tous les tubes de fraction sont en place et recouvrez-les d’un film plastique afin d’éviter toute contamination. Désencapsulez les testicules dans une plaque séparée contenant huit millilitres de Krebs. Effectuez une incision dans la membrane fine entourant les tubes séminifères à l’aide d’une paire de pinces.Tenez la membrane avec une autre paire de forceps. Repoussez les tubules hors de la membrane et éloignez-les. Transférez quatre millilitres de Krebs contenant les tubules dans chaque tube conique contenant 25 millilitres de solution de collagénase.Agiter à 33 degrés Celsius pendant 10 minutes jusqu'à ce que les tubules présentent un aspect semblable à des spaghettis. Ensuite, laisser les tubules se déposer au fond du tube pendant cinq minutes. Verser le surnageant et laver deux fois avec 25 millilitres de Krebs à température ambiante, en laissant les tubules se déposer au fond du tube à chaque fois.Laisser environ cinq millilitres de Krebs dans chaque tube. Après avoir incubé les tubules avec la trypsine, utiliser une pipette à large embout pour agiter la solution contenant les tubules.Les pipeter environ 10 fois en va-et-vient. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension de cellules uniques. Filtrer maintenant chaque suspension de cellules uniques de 30 millilitres à travers un tamis cellulaire de 100 microns.Après avoir combiné les suspensions cellulaires, déterminez le nombre total de cellules. Assurez-vous que le robinet d'arrêt est positionné de manière à diriger l'écoulement depuis la chambre cellulaire vers la chambre de sédimentation. Mettez les deux plaques agitatrices à une vitesse faible.Ensuite, versez la suspension cellulaire dans la chambre à cellules. Ouvrez le robinet afin que les cellules s'écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 millilitres par minute. Fermez ensuite le robinet pour rincer les cellules hors de la chambre à cellules.Verser cinq millilitres de solution de BSA à 0,5 % et laisser s’écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 millilitres par minute. Fermer le robinet et répéter le lavage au BSA quatre fois supplémentaires. Ouvrir maintenant les pinces situées entre la chambre à cellules et les deux cylindres de deux litres afin d’évacuer immédiatement le liquide vers la chambre de sédimentation à un débit de 40 millilitres par minute ; régler le débit de manière à ce qu’il faille environ 20 à 30 minutes pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation.Surveiller une fine couche de cellules intactes reposant au-dessus du gradient de BSA. Une fois que la majeure partie de la BSA est chargée, fermer le robinet d'arrêt et le tourner vers la position permettant à liquide de s'écouler de la chambre de sédimentation vers le tube de fractionnement. Éteindre maintenant les agitateurs magnétiques et laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes.Une fois la sédimentation terminée, fixez le tube de fractionnement au collecteur de fractions. Réglez le débit à l’aide du robinet afin de recueillir 10 millilitres par tube de collecte toutes les 45 secondes. Une fois toutes les fractions recueillies, analysez-les au microscope pour identifier les différentes populations cellulaires.Différents types cellulaires peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et de la morphologie nucléaire afin de déterminer la pureté de chaque fraction. Transférez 10 microlitres de cellules colorées au DPI sur une lame. Placez une lamelle et analysez au microscope à fluorescence.Prélevez les fractions présentant une taille et une morphologie nucléaire similaires afin de constituer des populations cellulaires. Une préparation typique provenant d'environ 22 testicules. Cette procédure « stay put » permet d'obtenir environ 10 puissance huit cellules.Les fractions de types cellulaires métagéniques peuvent être analysées rapidement à l’aide d’une combinaison de microscopie optique et de microscopie fluorescente. Les cellules myotiques, les spermatogonies et les cellules somatiques diploïdes sont les cellules les plus volumineuses présentes dans les testicules et possèdent de grands noyaux qui se colorent de manière relativement homogène au dpi. Les spermatides rondes sont des cellules plus petites, dotées de noyaux ronds plus réduits, généralement avec un chromatine centrale fortement colorée. Les spermatides en allongement sont des cellules petites dont les noyaux présentent une forme de faucille.Une fois les fractions cellulaires combinées, la pureté peut être davantage déterminée par analyse western blot des lysats cellulaires. Les marqueurs courants des cellules méiotiques sont les protéines du complexe synaptonémal un. Les marqueurs fréquents des spermatides en condensation sont les protéines de transition ou la protamine.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est correctement exécutée après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la spermatogenèse pour explorer les processus cellulaires dans différents types cellulaires provenant des testicules.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules de Sertoli à partir des tubes séminifères de souris, un composant des testicules. La digestion enzymatique et les lavages répétés favorisent la libération de cellules de Sertoli dans la solution, qui peuvent être cultivées davantage pour la prolifération et la croissance.

Isolement de cellules de Sertoli régulatrices immunitaires à partir de tubules séminifères de souris

Un nouveau protocole pour la préparation mécanique des suspensions de cellules testiculaires de matériel de rongeurs, en évitant les enzymes et les détergents, est décrite. La méthode est très simple, rapide et reproductible, et rend les suspensions cellulaires de bonne qualité, qui sont adaptés pour le tri de flux et extraction de l'ARN.

Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Nous décrivons une stratégie de tri pour les spermatides de souris à l’aide de la cytométrie en flux. Les spermatides sont classées en quatre populations très pures : rondes (étapes 1 à 9 de la spermiogenèse), allongées précoces (étapes 10 à 12 de la spermiogenèse), allongées tardives (étapes 13 et 14 de la spermiogenèse) et spermatides allongées (étapes 15 et 16 de la spermogenèse). La coloration de l’ADN, la taille et la granulosité sont utilisées comme paramètres de sélection.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

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Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

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