Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

L'objectif général de cette procédure est de séparer les différents types de cellules présents dans les testicules. Commencez par récolter une population mixte de cellules à partir de la souris. Chargez les cellules et le gradient de BSA dans l'appareil « stay put ».

Permettez maintenant aux cellules de sédimenter à travers le gradient de BSA. Ensuite, récupérez les fractions et combinez-les en fonction de la composition cellulaire. Finalement, la sédimentation de vitesse avec le « stay put » est utilisée pour séparer différents types de cellules issues des testicules selon leurs différences de taille et de densité.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les faits, est qu'elle permet d'isoler de grandes quantités de différents types cellulaires avec une pureté relativement élevée, en utilisant uniquement du matériel en verre simple et la gravité. Fixez les deux cylindres de deux litres et la chambre de chargement des cellules sur la plateforme supérieure, puis reliez-les à l’aide de deux petits morceaux de tubulure munis de pinces. Serrez toutes les pinces pour fermer les tubulures et obturez le bec verseur du cylindre de deux litres situé le plus à droite.

Placer une petite barre d'agitation dans la chambre de chargement des cellules et une barre d'agitation plus grande dans le cylindre de deux litres situé le plus à gauche. Ensuite, placer la chambre de sédimentation de deux litres sur la plateforme. Positionner le déflecteur métallique directement au-dessus de l'ouverture située au fond de la chambre de sédimentation afin d'empêcher la formation d'un vortex dans le liquide et de perturber le gradient cellulaire pendant la collecte des fractions.

Mettez maintenant le couvercle sur la chambre de sédimentation. Appliquez une très petite quantité de graisse à vide sur l'assemblage sphérique du robinet à trois voies. Ensuite, fixez le robinet en position à l'aide d'une pince au bas de la chambre de sédimentation, en raccordant les assemblages sphériques du robinet et de la chambre de sédimentation.

Ensuite, reliez la chambre de chargement des cellules à la sortie droite du robinet à trois voies à l’aide d’un tube. Fermez le robinet à trois voies, puis fixez le tube de fractionnement cellulaire à la sortie gauche du robinet et serrez le petit tube situé tout en bas. Versez la solution de BSA à 2 % dans le cylindre gauche de deux litres.

Verser la solution de BSA à 4 % dans le cylindre droit de deux litres. Veiller à ce qu'il n'y ait aucune grande bulle d'air dans le tube reliant ces cylindres. Verser le tampon de Krebs dans la chambre de chargement de la cellule et remplir le tube reliant cette chambre à la chambre de sédimentation.

Vérifiez qu'il n'y a pas de grosses bulles susceptibles de perturber le gradient. Si nécessaire, pressez ou tapez doucement sur le tube pour éliminer les bulles. Vérifiez que tout le CREBS se trouve dans le tube et non dans la chambre de la cellule.

Laisser s'écouler une petite quantité de tampon de Krebs dans la chambre de sédimentation. Ensuite, évacuer presque tout le tampon vers le tube de fractionnement cellulaire. Afin de remplir le tube et d'éliminer les grosses bulles d'air, placer le collecteur de fractions directement sous la chambre de sédimentation.

Vérifiez que tous les tubes de fraction sont en place et recouvrez-les d’un film plastique afin d’éviter toute contamination. Désencapsulez les testicules dans une plaque séparée contenant huit millilitres de Krebs. Effectuez une incision dans la membrane fine entourant les tubes séminifères à l’aide d’une paire de pinces.

Tenez la membrane avec une autre paire de forceps. Repoussez les tubules hors de la membrane et éloignez-les. Transférez quatre millilitres de Krebs contenant les tubules dans chaque tube conique contenant 25 millilitres de solution de collagénase.

Agiter à 33 degrés Celsius pendant 10 minutes jusqu'à ce que les tubules présentent un aspect semblable à des spaghettis. Ensuite, laisser les tubules se déposer au fond du tube pendant cinq minutes. Verser le surnageant et laver deux fois avec 25 millilitres de Krebs à température ambiante, en laissant les tubules se déposer au fond du tube à chaque fois.

Laisser environ cinq millilitres de Krebs dans chaque tube. Après avoir incubé les tubules avec la trypsine, utiliser une pipette à large embout pour agiter la solution contenant les tubules.

Les pipeter environ 10 fois en va-et-vient. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension de cellules uniques. Filtrer maintenant chaque suspension de cellules uniques de 30 millilitres à travers un tamis cellulaire de 100 microns.

Après avoir combiné les suspensions cellulaires, déterminez le nombre total de cellules. Assurez-vous que le robinet d'arrêt est positionné de manière à diriger l'écoulement depuis la chambre cellulaire vers la chambre de sédimentation. Mettez les deux plaques agitatrices à une vitesse faible.

Ensuite, versez la suspension cellulaire dans la chambre à cellules. Ouvrez le robinet afin que les cellules s'écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 millilitres par minute. Fermez ensuite le robinet pour rincer les cellules hors de la chambre à cellules.

Verser cinq millilitres de solution de BSA à 0,5 % et laisser s’écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 millilitres par minute. Fermer le robinet et répéter le lavage au BSA quatre fois supplémentaires. Ouvrir maintenant les pinces situées entre la chambre à cellules et les deux cylindres de deux litres afin d’évacuer immédiatement le liquide vers la chambre de sédimentation à un débit de 40 millilitres par minute ; régler le débit de manière à ce qu’il faille environ 20 à 30 minutes pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation.

Surveiller une fine couche de cellules intactes reposant au-dessus du gradient de BSA. Une fois que la majeure partie de la BSA est chargée, fermer le robinet d'arrêt et le tourner vers la position permettant à liquide de s'écouler de la chambre de sédimentation vers le tube de fractionnement. Éteindre maintenant les agitateurs magnétiques et laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes.

Une fois la sédimentation terminée, fixez le tube de fractionnement au collecteur de fractions. Réglez le débit à l’aide du robinet afin de recueillir 10 millilitres par tube de collecte toutes les 45 secondes. Une fois toutes les fractions recueillies, analysez-les au microscope pour identifier les différentes populations cellulaires.

Différents types cellulaires peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et de la morphologie nucléaire afin de déterminer la pureté de chaque fraction. Transférez 10 microlitres de cellules colorées au DPI sur une lame. Placez une lamelle et analysez au microscope à fluorescence.

Prélevez les fractions présentant une taille et une morphologie nucléaire similaires afin de constituer des populations cellulaires. Une préparation typique provenant d'environ 22 testicules. Cette procédure « stay put » permet d'obtenir environ 10 puissance huit cellules.

Les fractions de types cellulaires métagéniques peuvent être analysées rapidement à l’aide d’une combinaison de microscopie optique et de microscopie fluorescente. Les cellules myotiques, les spermatogonies et les cellules somatiques diploïdes sont les cellules les plus volumineuses présentes dans les testicules et possèdent de grands noyaux qui se colorent de manière relativement homogène au dpi. Les spermatides rondes sont des cellules plus petites, dotées de noyaux ronds plus réduits, généralement avec un chromatine centrale fortement colorée. Les spermatides en allongement sont des cellules petites dont les noyaux présentent une forme de faucille.

Une fois les fractions cellulaires combinées, la pureté peut être davantage déterminée par analyse western blot des lysats cellulaires. Les marqueurs courants des cellules méiotiques sont les protéines du complexe synaptonémal un. Les marqueurs fréquents des spermatides en condensation sont les protéines de transition ou la protamine.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est correctement exécutée après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la spermatogenèse pour explorer les processus cellulaires dans différents types cellulaires provenant des testicules.