Name: Evaluation de la fonction musculaire du muscle long extenseur des orteils Ex vivo Et du jambier antérieur In situ Chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Découvrez l'évaluation des propriétés mécaniques des muscles des membres chez la souris. Cette méthode mesure les propriétés contractiles et passives du muscle extenseur digitorum longus ex vivo et du tibialis anterior in situ.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AR-49 419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), et les NIH bourse de formation T90DK70105 (CH).

1. Evaluation des propriétés contractiles et passive de l&#39;ex vivo muscle EDL Les propriétés contractiles et passive du muscle EDL sont évalués ex vivo en utilisant la science Aurora système in vitro test musculaire. Reportez-vous au tableau 1 pour les matériaux et l&#39;équipement. 1.1 Préparation Equipement <ol><li> Assemblez le bain tissulaire d&#39;organes en assurant la oxytube au bain de tissu chemise d&#39;eau. Fixez le bain assemblés à l&#39;appareil musculaire de montage. Branchez la conduite de gaz à l&#39;oxytube. Fixez les conduites de circulation d&#39;eau au bain de tissu chemise d&#39;eau et placer la vanne aiguille dans le drainage de bain. </li><li> Allumer le bain-marie en circulation et régler la température à 30 ° C 7. Attendre 5 PSI (livres par pouce carré) de 95% O 2 -5% CO 2 à circuler à travers le oxytube. Remplir la baignoire avec un tampon de Ringer. Équilibrer la mémoire tampon pour au moins10 min avec un débit de gaz constant par réglage de la vanne oxytube. </li><li> Activer les instruments (stimulateur, système de levier à double mode, et l&#39;interface de signal). Chargez le contrôle de la dynamique musculaire (DMC) de logiciels selon les instructions du fabricant. </li></ol> 1,2 dissection de muscle EDL Toutes les études sur l&#39;animal doit être approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation. <ol><li> Anesthésier la souris avec injection intrapéritonéale de 2,5 pl / g de poids corporel du cocktail anesthésique (reportez-vous à la section matériaux). Tout au long de l&#39;intervention chirurgicale, la profondeur de la sédation a été vérifiée en effectuant un pincement de l&#39;orteil. Un supplément de 10% de la dose initiale anesthésique est administré au besoin pour maintenir l&#39;animal sous anesthésie. Raser les pattes postérieures. Maintenir la température du corps à 37 ° C avant la procédure de dissection en plaçant la souris sur un coussin chauffant. La température du corps est contrôlé en mesurant constamment la tempéra rectaleure en utilisant une sonde thermique. </li><li> Placez le dos de la souris sur la carte dissection (figure 1). Décoller la peau des pattes pour exposer les muscles des membres postérieurs. Fixer la jambe sur le bloc de Sylgard utilisant deux repères, une couturière dans le pied et l&#39;autre dans le muscle gracilis. Placer une lampe chauffante au-dessus du corps de la souris pour maintenir la température corporelle à 37 ° C. Constamment superfuse tous les muscles exposés avec un tampon de Ringer. Égoutter l&#39;excès de tampon par une ligne vide. </li><li> Exposer le tendon distal TA et le ligament extenseur sous un stéréomicroscope en disséquant la peau vers le pied. Retirez délicatement le fascia recouvrant le muscle TA. Couper le ligament extenseur pour libérer le tendon distal TA. </li><li> Couper le tendon distal TA et l&#39;utiliser pour décoller le muscle TA. Retirez délicatement le muscle TA à son attache proximale. Placer un petit morceau de coton imbibé de tampon Ringer à côté de l&#39;EDL à absorber des saignements causés par la rupture de la vascularisation du muscle TA. Utilisez la ligne de vide pour enlever l&#39;excès de tampon et de sang. </li><li> Attacher un noeuds doubles crochets suivis d&#39;un noeud en utilisant une boucle de fil de suture en soie pain à la jonction du tendon du muscle (MTJ) du muscle EDL distale (figure 2). Faire une incision dans la partie distale du muscle biceps fémoral pour exposer le muscle EDL proximale. Répétez le même ensemble de noeuds (figure 2) à la MTJ du tendon proximal EDL. Fixez le crochet de bras de levier soit à la proximal ou distal des noeuds avec un double nœud carré à l&#39;aide de la ligne de suture même. Couper la ligne de suture restant. </li><li> Couper le tendon proximal EDL supérieur au noeud de suture proximale. Soulevez le muscle EDL avec le crochet et couper la vascularisation sous le muscle. Couper le tendon distal EDL inférieur au noeud de suture distale de retirer le muscle EDL dans le membre postérieur. Couvrir le membre postérieur exposée avec un morceau de coton imbibé de tampon Ringer. </li><li> Attachez le crochet au bras de levier. Aligner verticalement le muscleentre deux électrodes. Fixer la ligne de suture distale au poste fixe. Soulevez le bain de tissu de submerger le muscle dans un tampon de Ringer. Régler la tension de repos à 1,0 g en utilisant la platine de translation à double grossière / fine et permettre au muscle de se stabiliser pendant au moins 10 min. </li></ol> 1.3 Mesure des propriétés contractiles et passive du muscle EDL Utilisez le Tableau 2 pour régler les paramètres dans le logiciel de DMC pour chacune des mesures suivantes. Analyser les données en utilisant l&#39;analyse musculaire dynamique (DMA) du logiciel. 1.3.1 Mesurer les propriétés contractiles du muscle EDL <ol><li> Stimuler le muscle EDL trois fois à 150 Hz avec 60 secondes à part pour stabiliser le muscle 8. </li><li> Stimuler le muscle EDL à différentes tensions de repos afin de déterminer la longueur optimale (Lo). La longueur optimale est la longueur à laquelle la tension musculaire se développe contraction maximale. Permettre au muscle dedétendez-vous pendant 2 min. </li><li> Régler la tension de repos à Lo. Mesurer la force musculaire à la stimulation transcutanée unique. Déterminer la force contractile absolue (Pt), le temps de la tension de crête (TPT) et le temps de relaxation de la moitié (½ RT) du Pt. Permettre au muscle de se détendre pendant 2 min. </li><li> Régler la tension de repos à Lo. Mesurer la force musculaire tétanique générée à des fréquences de stimulation différents (50, 80, 100, 120, 150 et 200 Hz). Déterminer la force maximale absolue musculaire tétanique (Po) lorsque la force musculaire atteint le maximum. Mesurer la TPT et ½ RT du Pô 9. </li><li> Permettre au muscle de se détendre pendant 5 min. Régler la tension de repos à Lo. Appliquer 10 cycles de contractions excentriques avec 2 minutes de repos entre les cycles. Calculer la perte de la force relative de la Po après chaque cycle de contraction excentrique. </li><li> Détachez le muscle EDL à partir de l&#39;appareil et couper les tendons sur le site de suture. Déterminer le poids du muscle humide et calculer la surface de section musculaire (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Mesure des propriétés passives du muscle EDL <ol><li> Disséquer le muscle controlatéral EDL et le joindre à l&#39;appareil comme décrit dans la section 1.2, les étapes 2 à 7. </li><li> Sous réserve de l&#39;EDL à un protocole en six étapes d&#39;étirement où le muscle est tendu à 160% Lo avec un incrément de 10% Lo. Analyser le 6 Profil contrainte-déformation. </li><li> Évaluer la propriété visqueuse du muscle EDL en mesurant le taux de relaxation des contraintes (SRR) dans les délais suivants après l&#39;étirement et la tenue du muscle à 10% Lo: un pic à 0,1 s post-pic (pp), de 0,1 à 0,2 s pp, de 0,2 à 0,5 s pp, de 0,5 à 1 s et p allant de 1 à 1,5 s pp </li><li> A la fin de l&#39;étude, euthanasier la souris par dislocation cervicale et / ou la décapitation alors que la souris est toujours sous anesthésie. Détachez le muscle EDL à partir de l&#39;appareil et couper les tendons sur le site de suture. Déterminer le poids du muscle humide et calculer le muscle croix soizone ctional (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluation des propriétés contractiles du muscle TA In situ Les propriétés contractiles du muscle TA sont mesurés à l&#39;aide de la science Aurora dans le système musculaire test in situ. Reportez-vous au tableau 1 pour les matériaux et l&#39;équipement. 2.1 Préparation Equipement <ol><li> Chauffer le stade animal thermo-contrôlé à 37 ° C en utilisant la circulation de l&#39;eau dans la baignoire. </li><li> Activer les instruments (stimulateur, système de levier à double mode, et l&#39;interface de signal). Chargez le logiciel DMC selon les instructions du fabricant. </li></ol> 2.2 Préparation du muscle TA pour la mesure in situ de force <ol><li> Anesthésier la souris, le raser des membres postérieurs et exposer le muscle TA comme décrit dans les étapes 1 à 3 de la section 1.2. </li><li> Un double nœud carré autour de la rotule usi ligamentun fil de suture en soie ng pain. Un double nœud carré suivie d&#39;un nœud de boucle à la MTJ du muscle TA distale (figure 2), attachez un autre noeud double carré en laissant une boucle de ~ 10 mm du nœud tendon distal TA en utilisant la ligne de suture même. Placer le deuxième noeud double carré sur le côté de la boucle. </li><li> Retirer les épingles de la patte arrière et positionner l&#39;animal couché. Exposer le muscle biceps fémoral. Faire une incision sur la ligne médiane de révéler le nerf sciatique. Un double nœud carré autour de l&#39;extrémité proximale du nerf sciatique. Couper un côté des lignes de suture et couper le nerf supérieur du nœud. Doucement, tirez sur le nerf sciatique vers le genou en utilisant la ligne de suture et d&#39;effacer le tissu conjonctif environnant libre de ~ 5 mm de sa longueur. Ne pas étirer le nerf au cours de cette procédure et constamment superfuse le nerf avec un tampon de sonnerie. </li><li> Préparer le muscle TA controlatéral comme décrit dans les étapes 1 à 3. Couvrez un exposé du membre postérieur avec un morceau de Ritampon imbibé nger de coton. Constamment superfuse les deux membres postérieurs avec pré-chauffée (37 ° C) tampon Ringer. Retirer l&#39;excès de tampon par une ligne vide. </li><li> Placez l&#39;animal en décubitus ventral sur la plate-forme animale. Fixez le support de serrage genou à la plate-forme animale et fixer les deux genoux à la broche métallique avec doubles noeuds carrés en utilisant les lignes de suture du ligament patellaire. Pin les deux pieds sur le bloc Sylgard utilisant des broches de couturière. Fixez la plate-forme animale sur la scène thermo-contrôlé. Positionner la lampe de chaleur pour maintenir la température corporelle des animaux noyau à 37 ° C. </li><li> Fixez le porte-électrode à la plate-forme d&#39;animaux et de jeter le nerf sciatique sur l&#39;électrode en utilisant la ligne de suture. Conserver l&#39;électrode à l&#39;écart des muscles des membres postérieurs. Couper le tendon TA distale du membre postérieur à découvert sur le site de suture MTJ. Attachez la boucle de suture tendon distal TA au crochet de bras de levier. Couvrir le muscle du membre postérieur exposée avec du coton imbibé d&#39;un tampon Ringer chaud de. </li></ol><ol><li> Utilisez le Tableau 2 pour régler les paramètres dans le logiciel de DMC. Suivre le même protocole décrit dans la section 1.3.1 pour déterminer les propriétés contractiles du muscle TA. Analyser les données en utilisant le logiciel DMA. </li><li> Après la mesure des propriétés contractiles, détachez la boucle de suture tendon distal TA du crochet bras niveleur. Retirer le muscle TA. Déterminer le poids du muscle humide et calculer la CSA 10. </li><li> Mesurer les propriétés contractiles du muscle TA controlatéral suivant les étapes 1 à 3 décrites ci-dessus. Euthanasier la souris selon les directives institutionnelles à la fin de l&#39;étude. </li></ol>

<ol><li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite%3A+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li>
<li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li>
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<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li>
<li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li>
<li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li>
<li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li>
<li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li>
<li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, nous avons illustré tests physiologiques pour mesurer les propriétés contractiles et passive du muscle EDL et les propriétés contractiles du muscle TA. Une préoccupation majeure dans les études de physiologie du muscle est l&#39;oxygénation du muscle cible. Pour les grands muscles (comme le muscle TA), l&#39;approche in situ est préférée parce que la diffusion de l&#39;oxygène à partir du tampon de Ringer peut pas atteindre le centre du muscle dans un test in vitro. Dans l&#39;approche in situ ne perturbe pas l&#39;approvisionnement normal du sang et de l&#39;hypoxie associée effets artificiels sont évités. L&#39;EDL est l&#39;un des muscles les plus couramment utilisés dans l&#39;étude de la physiologie. Une oxygénation adéquate de l&#39;ensemble du muscle peut être obtenue dans un système in vitro en raison de la petite taille du muscle. En outre, le système in vitro fournit un environnement clos à manipuler les concentrations d&#39;ions (Ca 2 +, Na + et K +) et chimicochimiques (ATP et glucose) qui sont nécessaires pour la génération de la force musculaire optimale. Ce système offre une excellente occasion d&#39;étudier l&#39;effet de ces variables sur la production de force. La mesure précise des propriétés contractiles et passive du muscle membres est essentielle pour étudier la fonction des muscles squelettiques. Changements caractéristiques de ces propriétés sont souvent considérés comme les maîtres mots de maladies musculaires différents. Les variations de ces paramètres sont également des indicateurs importants pour déterminer si un traitement expérimental est efficace ou non.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel </td><td> Fabricant </td><td></td><td> Spécifications et commentaires </td></tr><tr><td> Tissus d&#39;organes bain </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Bain de tissu de la chemise d&#39;eau (Cat # 158351-LL), tube disperseur oxygène (Cat # 160192), vanne Luer (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Bain de circulation d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélange de gaz </td><td> Airgas nationale, Charlotte, Caroline du Nord, Etats-Unis </td><td></td><td> 95% de O 2 et 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction appareil de dosage </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Le système se compose d&#39;un stimulateur (Modèle # 701A), un système de levier bi-mode (Modèle # 300C ou 305C), une interface de signal (Modèle # 604B) et un test apreils (Modèle # 800A) pour monter verticalement bain d&#39;organe tissus </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction du logiciel d&#39;analyse </td><td></td><td></td><td> Contrôle dynamique musculaire (DMC) et le logiciel de contrôle dynamique du muscle analyse des données (DMA) du logiciel </td></tr><tr><td> Cocktail anesthésie souris mélangés dans NaCl à 0,9% </td><td> Reportez-vous aux directives institutionnelles </td><td></td><td> Kétamine (25 mg / ml), la xylazine (2,5 mg / ml) et d&#39;acépromazine (0,5 mg / ml). Tout au long de la procédure chirurgicale, un supplément de 10% de la dose initiale peut être nécessaire pour garder un animal sous anesthésie. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Instrument de précision mondiale </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Un conseil sur mesure dissection plexiglas </td><td> Dans la maison conçue </td><td></td><td> Reportez-vous à la figure 1 </td></tr><tr><td> Lampe chauffante </td><td> Lighting Company tenseur,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 Témoin Watt pour maintenir la chaleur de la souris lors de la dissection </td></tr><tr><td> Ringer tampon </td><td> Les produits chimiques sont achetés chez Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td> Composition en mM: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO 4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 glucose CaCl 2 (Cat # C79) et 10 (Cat # D16). Dissoudre et mélanger des produits chimiques individuellement dans l&#39;ordre indiqué ci-dessus. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stéréo microscope à dissection </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Outils de dissection </td><td> Outils Fine Science, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Forceps, ciseaux grossiers, grossiers pinces fines (droite et angle de 45 °) </td></tr><tr><td> Suture en soie tressée # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Un crochet sur mesure en acier inoxydable </td><td> Petites pièces, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; long S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diamètre) pour capteur de force 305C ou 2,5&#39;&#39; de long S / S 304V (0,012&#39;&#39; de diamètre) pour le capteur 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> Dans le système musculaire test in situ fonction </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Le système (809B, dans un appareil de souris in situ) sont constitués d&#39;un stimulateur (modèle n ° 701B), un système de levier à double mode (modèle n ° 305C), une interface de signal (Modèle # 604A) et un dispositif de thermo semelle contrôlée (Modèle 809A # ) </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction du logiciel d&#39;analyse </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Contrôle dynamique musculaire (DMC) et le logiciel de contrôle dynamique du muscle analyse des données (DMA) du logiciel </td></tr><tr><td> Une plate-forme sur mesure TA animaux d&#39;essai </td><td> Dans la maison conçue </td><td></td><td> Reportez-vous à la figure 2 </td></tr><tr><td> Un crochet sur mesure en acier inoxydable </td><td> Petites pièces, Inc </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; long S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diamètre) </td></tr><tr><td> Custom-made électrodes de platine 25G </td><td> Entreprises Chalgren, Gilroy, Californie </td><td></td><td> Souder deux fils&#39;&#39; 0.016 platine d&#39;épaisseur à deux fils électriques 24G </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Matériaux et équipements.

evaluation de la fonction musculaire du muscle long extenseur des orteils<em&gt; ex vivo</em&gt; et du jambier antérieur<em&gt; in situ</em&gt; chez la souris

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Les mouvements du corps sont principalement fournis par la fonction mécanique du muscle squelettique. Muscle squelettique est composé de faisceaux de fibres musculaires de nombreux qui sont gainées par voie intramusculaire tissus conjonctifs. Chaque myofibrille contient plusieurs myofibrilles qui s&#39;exécutent longitudinalement le long de la longueur de la fibre musculaire. Myofibrilles sont l&#39;appareil contractile du muscle et ils sont composés d&#39;unités répétées contractiles appelées sarcomères. Une unité sarcomère contient des filaments d&#39;actine et de la myosine qui sont espacées par des disques à Z et de protéine titine. Fonction mécanique du muscle squelettique est définie par les propriétés contractiles du muscle et passive. Les propriétés contractiles sont utilisées pour caractériser la valeur de la force générée lors de la contraction musculaire, le temps de génération de force et de temps de relaxation musculaire. Tout facteur qui affecte la contraction musculaire (tels que l&#39;interaction entre les filaments d&#39;actine et de myosine, l&#39;homéostasie du calcium, rapport ATP / ADP, etc) influe sur la prope contractileles parties prenantes. Les propriétés passives désignent les propriétés élastiques et visqueuses (rigidité et la viscosité) du muscle en l&#39;absence de contraction. Ces propriétés sont déterminées par la extracellulaire et les composants intracellulaires structurelles (comme titine) et les tissus conjonctifs (collagène principalement) 1-2. Les propriétés contractiles et passive sont deux aspects inséparables de la fonction musculaire. Par exemple, flexion du coude est réalisé par contraction de muscles dans la région antérieure de la partie supérieure du bras et étirement passif des muscles de la loge postérieure de la partie supérieure du bras. Pour vraiment comprendre la fonction musculaire, les deux propriétés contractiles et passive doit être étudiée. Les propriétés contractiles et / ou passive mécaniques du muscle sont souvent compromis dans les maladies musculaires. Un bon exemple est la myopathie de Duchenne (DMD), une maladie du dépérissement musculaire sévère causée par une carence en dystrophine 3. La dystrophine est une prote du cytosqueletteà qui stabilise la membrane des cellules musculaires (sarcolemme) pendant 4 contraction musculaire. En l&#39;absence de dystrophine, le sarcolemme est endommagé par la force de cisaillement générée lors de la transmission de force. Cette membrane déchirer déclenche une réaction en chaîne qui conduit à la mort cellulaire musculaire et la perte de la machinerie contractile. En conséquence, la force musculaire est réduite et fibres musculaires mortes sont remplacées par des tissus fibreux 5. Ce changement augmente tard 6 raideur musculaire. La mesure précise de ces changements fournit un guide important pour évaluer la progression de la maladie et de déterminer l&#39;efficacité thérapeutique du nouveau gène / cellule / interventions pharmacologiques. Ici, nous présentons deux méthodes pour évaluer les propriétés contractiles et passive mécaniques du muscle long extenseur des orteils (EDL) muscle et les propriétés contractiles du muscle tibial antérieur (TA) du muscle.

Les résultats suivants sont une représentation de nos rapports précédents 6,9. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. Tableau 3 montre les propriétés morphométriques du muscle EDL dans BL10 normale et de la dystrophine-déficientes (mdx) souris à 4 à 6 mois d&#39;âge. La figure 4 montre représentatives des propriétés contractiles et passive de la EDL à partir BL10 et mdx souris. Les propriétés contractiles du muscle EDL sont décrits par les termes suivants, y compris le spécifique (force absolue divisée par la CSA) force contractile (figure 4A), spécifique la force tétanique maximale (figure 4B), TPT et ½ RT de la force tétanique maximale absolue (figure 4C et D). Le TPT et ½ RT peut également être calculer à partir de la force de contraction absolue. Le profil de contrainte-déformation (figure 4E) et SRR (Figure 4F) unre utilisé pour décrire les propriétés passives du muscle EDL. Absence de dystrophine a un impact significatif sur les propriétés contractiles et passive du muscle EDL 6,9. Tic précis et forces tétaniques sont significativement réduite dans le muscle mdx EDL. Le TPT est nettement plus rapide alors que la RT ½ est significativement plus lente dans le muscle mdx EDL. Le profil de contrainte-déformation suggère que la rigidité est significativement augmentée dans le muscle mdx EDL. Le muscle mdx EDL donne aussi une force de résistance significativement plus élevé (stress passive) avant d&#39;atteindre le pic de contrainte, tandis que les contraintes post-pic diminuent beaucoup plus rapidement. En outre, le RRF était significativement plus élevée dans le muscle mdx EDL par rapport à celle du muscle EDL BL10. L&#39;analyse statistique La signification statistique entre les deux groupes est analysée par le test t de Student. Pour sSTATISTIQUES importance parmi plusieurs groupes, One-way ou analyse de variance à deux voies suivies par une analyse post hoc de Bonferroni est recommandé d&#39;utiliser le logiciel SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC). Différence est considérée comme significative lorsque p &lt;0,05. Tableau 1. Matériaux et équipements. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Expérience </td><td class="jove_content_small"> La tension au repos (gramme) </td><td class="jove_content_small"> Fréquence d&#39;impulsion (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Largeur d&#39;impulsion (ms) </td><td class="jove_content_small"> Durée de stimulation (ms) </td><td class="jove_content_small"> Longueur d&#39;étirement </td><td class="jove_content_small"> Extensible (ms) </td><td class="jove_content_small"> Taux d&#39;allongement </td><td class="jove_content_small"> Commentaires </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. L&#39;évaluation des propriétés contractiles et passive du muscle EDL ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Mesurer les propriétés contractiles du muscle EDL </td></tr><tr><td> 1. Réchauffer </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Reposer les muscles pendant 60 secondes entre chaque stimulus. Ces contractions tétaniques préliminaires stabiliser le muscle pour les mesures suivantes. </td></tr><tr><td> 2. Longueur musculaire optimale (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 et 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 30 secondes entre chaque stimulus. Mesurer la longueur musculaire optimale en utilisant un compas numérique. </td></tr><tr><td> 3. Simple twitch vigueur (Pt) </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. La force musculaire tétanique </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 et 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 1 minute entre chaque stimulus. Déterminer la fréquence qui génère le maximum absolu tétanique force (Po). </td></tr><tr><td> 5. Contraction excentrique </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> Utiliser la fréquence qui génère la force maximale tétanique (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> Lo 10% </td><td> dernière 200 ms de la durée de stimulation </td><td> 0.5 Lo / s </td><td> Répétez la contraction excentrique pendant 10 cycles avec 2 minutes de repos entre les cycles. </td></tr><tr><td> 6. CSA du muscle EDL </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masse musculaire (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 est la densité musculaire et 0,44 est la longueur du muscle EDL de fibres à Lo rapport. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Mesure des propriétés passives du muscle EDL </td></tr><tr><td> 1. Six-étape d&#39;étirage protocole </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Répétez le protocole d&#39;étirement avec un incrément de 10% jusqu&#39;à 160 Lo Lo% est atteint. Alow 1,5 sec entre les cycles d&#39;étirement. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR est calculé en divisant la différence de la contrainte avec le temps écoulé entre deux points dans le temps dans un laps de temps. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2.3 Mesure des propriétés contractiles du muscle TA </td></tr><tr><td> 1. Réchauffer </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Reposer les muscles pendant 60 secondes entre chaque stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Longueur musculaire optimale (Lo) </td><td> 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 et 7,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 30 secondes entre chaque stimulus. Mesurer la longueur musculaire optimale en utilisant un compas numérique. </td></tr><tr><td> 3. CSA du muscle TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masse musculaire (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 est la longueur du muscle à fibres TA Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Paramètres pour l&#39;évaluation des propriétés mécaniques des muscles EDL et TA. <table border="1"><tbody><tr><td> Souche </td><td> Age (mois) </td><td> Poids corporel (g) </td><td> EDL poids (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Propriétés morphométriques du muscle EDL. *, La valeur mdx souris est significativement différent de celui de l&#39;âge des souris BL10 identifié. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figure 1. Un schéma de principe du conseil sur mesure souris dissection. Le conseil dissection est faite à partir d&#39;un ½ pouce d&#39;épaisseur en plexiglas et a été fabriqué à l&#39;atelier institutionnel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figure 2. Une série d&#39;images numériques montrant les étapes de faire un nœud double carré suivie d&#39;un nœud de boucle à la MTJ. Asterisk, l&#39;EDL; Arrow, le tendon distal du muscle EDL. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figure 3. Un diagramme schématique de la plate-forme sur mesure pour essai de fonction TA situ musculaire. La plate-forme animale en plexiglas et le support en acier inoxydable genou ont été conçus pour monter sur le 809B dans un appareil de souris in situ. *, Tige en acier inoxydable (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR); #, porte-électrode universelle (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, tige de fixation d&#39;électrode (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); ** Sylgard bloc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figure 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figure 4. Les résultats représentatifs pour les propriétés contractiles et passive du muscle EDL. Les propriétés contractiles du muscle EDL sont caractérisés par la force contractile spécifique (A), la force spécifique tétanique (B), le temps de la tension de crête (C) et le temps de relaxation de la moitié (D). Les propriétés passives du muscle EDL sont évalués par le profil de contrainte-déformation (E) et la SSR. *, Souris mdx sont significativement différents de appariées selon l&#39;âge BL10 souris.

Changements dans les membres musculaires contractiles et passive propriétés mécaniques sont d&#39;importants biomarqueurs pour les maladies musculaires. Ce manuscrit décrit tests physiologiques pour mesurer ces propriétés dans l&#39;extenseur commun des orteils murin et jambier muscles antérieurs.

Evaluation de la fonction musculaire du muscle long extenseur des orteils<em&gt; Ex vivo</em&gt; Et du jambier antérieur<em&gt; In situ</em&gt; Chez la souris

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

L’objectif général de cette procédure est de déterminer avec précision les propriétés mécaniques des muscles des membres de la souris. Ceci est accompli en mesurant les propriétés contractiles et passives du muscle extenseur digitole long ex evo, ou en mesurant les propriétés contractiles du muscle tibial antérieur in situ, vous pouvez finalement obtenir des résultats qui permettent de mieux comprendre les changements physiologiques dans diverses maladies musculaires et si les interventions expérimentales améliorent la fonction musculaire. Cette méthode permet une évaluation complète de la propriété contractile et passive du muscle squelettique, qui sont deux aspects indissociables de la fonction mécanique du muscle squelettique nécessaire au mouvement du corps.Par conséquent, la démonstration visuelle de la procédure de dissection musculaire est essentielle car elle nécessite beaucoup de compétences et de manipulation. De plus, le principal avantage de l’évaluation NC deux de la propriété contractile des gros muscles par rapport aux méthodes existantes comme l’AS in vitro, est que l’approche de l’institut ne perturbe pas le flux sanguin normal et l’oxygénation. Une préoccupation majeure dans l’étude de la physiologie musculaire est l’oxygénation du muscle cible.Dans un SA in vitro pour les gros muscles, comme le TA, la diffusion de l’oxygène musculaire peut ne pas atteindre le centre du muscle. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie des maladies musculaires, car la mesure précise de la fonction mécanique du muscle squelettique peut également être utilisée pour évaluer la progression des maladies musculaires et déterminer l’efficacité thérapeutique de nouvelles interventions géniques, cellulaires et pharmacologiques. Toutes les procédures animales présentées ici ont été approuvées par le comité institutionnel sur les soins aux animaux.Il s’agit d’une chirurgie de non-survie pour mettre en place le système de test musculaire pour les expériences ex vivo. Commencez par assembler le bain de tissu en fixant le tube d’oxy au bain de tissu de la chemise d’eau. Fixez le bain assemblé à l’appareil de montage musculaire et placez le robinet à pointeau dans le drainage du bain.Raccordez la conduite de gaz et les conduites de circulation d’eau au bain. Laissez 30 degrés Celsius d’eau circuler dans la chambre de la chemise et cinq PSI de gaz s’écouler à travers le tube oxymétrique. Remplissez le bain avec le tampon de la sonnerie et équilibrez-le avec un flux de gaz régulier.Allumez les instruments et chargez le logiciel DMC pour disséquer l’EDL, l’artère musculaire, l’artère, l’anesthésie et le placement de la souris sur un coussin chauffant. Rasez le membre postérieur et vérifiez la sédation en effectuant un pincement des orteils. Placez la souris sur la planche de dissection et décollez la peau de la jambe.Utilisez deux épingles de couturière pour fixer le membre postérieur dans le pied et dans le muscle gracilis. Placez une lampe chauffante au-dessus de la souris pour maintenir la température corporelle centrale à 37 degrés Celsius et fusionnez en continu tous les muscles exposés avec des bagues chaudes sous un stéréomicroscope, disséquez la peau pour exposer le tendon TA distal et le ligament extenseur, et retirez doucement le fascia recouvrant le muscle TA. Coupez le ligament extenseur pour libérer le tendon TA distal.Coupez le tendon distal TA et utilisez-le pour retirer le muscle TA avec un mince morceau de coton imbibé de tampon de ringer. Arrêtez l’hémorragie causée par la rupture du système vasculaire musculaire TA. Ensuite, à l’aide d’une suture en soie de pain, faites un double nœud carré suivi d’un nœud en boucle à la jonction tendineuse du muscle distal du muscle EDL.Ensuite, faites une incision dans le muscle biceps fems pour exposer le tendon proximal et faites le même ensemble de nœuds à la jonction du tendon du muscle proximal. Utilisez la même ligne de suture pour faire un double nœud carré. Pour fixer le crochet du bras de levier aux nœuds proximaux ou distals.Pour disséquer doucement le muscle EDL du membre postérieur. Tout d’abord, coupez le tendon proximal au-dessus des nœuds de suture et coupez le système vasculaire sous le muscle. Coupez ensuite le tendon distal inférieur au nœud de suture.Couvrez le membre postérieur exposé avec un morceau de coton imbibé de ringers. Enfin, fixez le crochet au bras de levier et alignez les muscles verticalement entre les électrodes. Fixez la ligne de suture distale au poteau fixe.Immergez le muscle dans le tampon de la sonnerie et ajustez la tension de repos à 1,0 gramme. Laissez le muscle s’équilibrer pendant au moins 10 minutes. Pour mesurer les propriétés contractiles du muscle EDL, définissez les paramètres de chacun des protocoles suivants dans le logiciel DMC présenté ici.Pour le premier protocole, stabilisez le muscle EDL en le stimulant trois fois à 150 hertz avec un 62ème repos entre les stimulations. Pour le deuxième protocole, laissez les muscles se détendre pendant deux minutes, puis déterminez la longueur optimale ou LN en stimulant le muscle EDL à différentes tensions de repos. Utilisez le pied à coulisse numérique pour mesurer la longueur optimale du muscle entre les nœuds distaux et proximaux.Laissez le muscle se détendre pendant deux minutes. Pour le troisième protocole, ajustez la tension de repos à L zéro et mesurez la force musculaire lors d’une stimulation à contraction unique. Déterminez la tension Twitch ou pt, le temps jusqu’au pic de tension ou TPT et le temps de relaxation à mi-temps du pt.Laissez le muscle se détendre pendant deux minutes. Pour réaliser le quatrième protocole, ajustez la tension de repos à LN et mesurez la force musculaire testique générée à différentes fréquences de stimulation. Mesurez le P NAUGH où la force musculaire atteint la force titanesque maximale.Mesurez le temps jusqu’au pic de tension et la moitié du temps de relaxation pour le p. naugh. Commencez le protocole cinq en laissant le muscle se détendre pendant cinq minutes, ajustez la tension de repos à L Naugh et appliquez 10 cycles de contractions excentriques avec deux minutes de repos entre les cycles. Calculez la perte de force relative du PN après chaque cycle de contraction excentrique.Enfin, détachez le muscle EDL de l’appareil et coupez les tendons au site de suture. Déterminez le poids humide du muscle et calculez la section transversale du muscle. Pour mesurer les propriétés passives du muscle EDL, disséquez le muscle EDL controlatéral et fixez-le à l’appareil comme démontré précédemment.Dans cette vidéo, soumettez le muscle à un protocole d’étirement en six étapes où le muscle est tendu à 160 % L zéro par incréments de 10 %. Analysez le profil de contrainte pour évaluer la propriété visqueuse de l’étirement musculaire EDL et maintenez le muscle à 10 % L zéro et mesurez le taux de relaxation du stress aux intervalles de temps suivants. Commencez par chauffer l’étage de l’animal thermocontrôlé à 37 degrés Celsius avec de l’eau circulatoire.Allumez le et chargez le logiciel DMC. Après avoir exposé le muscle TA sur le membre postérieur de la souris anesthésiée, utilisez une suture en soie pour faire un double nœud carré autour du ligament rotulien. Faites ensuite un double nœud carré suivi d’un nœud en boucle à la jonction du tendon musculaire ou MTJ du tendon distal ta.Utilisez la même suture pour faire une boucle d’environ 10 millimètres. Positionnez l’animal sur le ventre et exposez le muscle biceps fems. Exposez le nerf sciatique et faites un double nœud carré autour de son extrémité proximale.Coupez le nerf au-dessus du nœud et disséquez soigneusement environ cinq millimètres de sa longueur vers le genou. N’étirez pas et n’endommagez pas le nerf. Préparez le muscle ta controlatéral comme démontré plus tôt dans cette vidéo et couvrez l’un des membres postérieurs avec un morceau de coton imbibé de tampon de ringer.Ensuite, positionnez l’animal couché sur la plate-forme de l’animal et utilisez les lignes de suture du ligament rotulien autour de l’axe du genou pour faire un double nœud carré pour sécuriser le genou. Ensuite, après avoir épinglé les pieds sur le bloc de garde SIL, fixez la plate-forme de l’animal sur la platine thermocontrôlée et positionnez la lampe chauffante pour maintenir la température corporelle centrale de l’animal à 37 degrés Celsius. Après avoir fixé l’électrode à la plate-forme, fixez le nerf sciatique à l’électrode, puis coupez le tendon TA du membre postérieur distal découvert au nœud distal et fixez la boucle de suture au crochet du bras de levier.Couvrez le muscle exposé des membres postérieurs avec des bagues chaudes et du coton imbibé de tampon pour enregistrer les mesures contractiles du muscle TA. Utilisez les paramètres et le protocole du logiciel DMC présentés précédemment dans cette vidéo pour le muscle EDL et utilisez le logiciel pour analyser les données. Après avoir pris des mesures du muscle TA, détachez la boucle de suture du tendon distal TA du crochet du bras de levier et mesurez les propriétés contractiles du muscle TA controlatéral comme démontré Après l’euthanasie de l’animal, retirez les muscles TA et déterminez leur poids humide.Pour calculer l’aire de la section transversale, ce tableau montre les propriétés morphométriques du muscle EDL chez les souris normales noires 10 et déficientes en dystrophine ou MDX à l’âge de quatre à six mois. On voit ici une représentation des propriétés contractiles et passives du muscle EDL des souris noires 10 et MDX, y compris la force titanesque maximale spécifique à la force Twitch, le temps jusqu’à la tension maximale et le temps de relaxation à moitié de la force titanique maximale absolue. Le temps jusqu’au pic de tension et la moitié du temps de relaxation peuvent également être calculés à partir de la force absolue de contraction.Le profil de contrainte et le taux de relaxation du stress sont utilisés pour décrire les propriétés passives du muscle EDL. L’absence de dystrophine a un impact significatif sur les propriétés contractiles et passives du muscle EDL. Les forces spécifiques de Twitch et Titanic sont considérablement réduites dans le muscle M-D-X-E-D-L.Par exemple, le temps jusqu’au pic de tension est nettement plus rapide tandis que le temps de demi-relaxation est nettement plus lent dans le muscle M-D-X-E-D-L. De plus, le profil de contrainte suggère que la rigidité est considérablement augmentée dans le muscle M-D-X-E-D-L. Le muscle M-D-X-E-D-L produit également une force de résistance nettement plus élevée avant d’atteindre le stress maximal, tandis que les stress post-pic diminuent beaucoup plus rapidement.De plus, le taux de relaxation du stress était significativement plus élevé dans le muscle M-D-X-E-D-L par rapport à celui du muscle noir 10 EDL. Une fois la procédure de dissection maîtrisée, l’analyse ex vivo de la propriété contractile et passive du muscle EDL peut être réalisée en 40 minutes. Et l’évaluation in situ de la propriété contractile des deux muscles TA peut être effectuée en 60 minutes après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans l’évaluation des propriétés contractiles et passives du muscle squelettique dans le domaine des maladies musculaires pour aider à déterminer l’efficacité du traitement après cette procédure. D’autres méthodes, comme l’analyse histopathologique du muscle squelettique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, l’effet du traitement expérimental sur l’histopathologie du muscle squelettique.

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