Name: Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez la métabolomique non ciblée pour l'analyse de profils métaboliques en utilisant l'extraction liquide-liquide et la spectrométrie de masse haute résolution. Cette méthode permet d'identifier les métabolites différentiellement abondants entre groupes.

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Nous reconnaissons l&#39;appui de subventions des NIH P30ES013508 et 5T32GM008076. Nous remercions également Thermo Scientific pour l&#39;accès au tamis de 2,0 et Drs. Eugene Ciccimaro et Mark Sanders de Thermo Scientific pour des discussions utiles.

1. Extraction de l&#39;échantillon à partir de cellules <ol><li> Pour une plaque de cellules cm 10: recueillir 1,5 ml de suspension cellulaire dans un milieu levé dans un tube à centrifuger de verre pré-marqué 10 ml. Pour les lignes adhérentes, les cellules devraient être levées avec grattant délicatement dans 1,5 ml de milieu conservés dans la glace en option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape. Commentaire: Trempe du métabolisme cellulaire est cruciale pour certains métabolites. Pour l&#39;analyse des métabolites sensibles au facteur temps, des procédures telles que l&#39;extraction de méthanol froid devraient être considérés. 17 </li><li> Ajouter 6 ml de chloroforme (CHCl 3) / méthanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) pour chacun des tubes de verre de 10 ml contenant les échantillons. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min. Après agitation, les échantillons sont centrifugés avec un réglage bas d&#39;accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer complètement les phases. Optionnel </em&gt;: Pour éviter d&#39;utiliser CHCl3, extractions peuvent être menées avec du dichlorométhane (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> Utilisation d&#39;une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l&#39;échantillon dans de l&#39;azote gazeux. Continuer à 2.6.2 pour le dessalage de phase aqueuse ou de continuer à 4.1 pour l&#39;analyse directe. </li></ol> 2. Extraction des échantillons de sérum <ol><li> Transférer 20 ul de sérum dans un tube en plastique de 2 ml Eppendorf option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape. </li><li> Ajouter 190 ul de CH 3 OH et vortex pendant 10 sec. </li><li> Ajouter 380 ul de CHCl 3 et vortex pendant 10 sec. </li><li> Ajouter 120 ul de H 2 O pour induire une séparation de phase. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et laisser s&#39;équilibrer à température ambiante pendant 10min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer les phases. </li><li> Transférer la phase organique inférieure en plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Continuer à 4,1. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l&#39;échantillon dans de l&#39;azote gazeux. </li><li> Re-suspendre l&#39;échantillon dans 200 pi H 2 O. Acide ou une base réactifs (0,1% d&#39;acide acétique, d&#39;acide formique ou de 0,1% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium), peuvent être utilisés pour extraire préférentiellement métabolites sensibles au pH. Ultrasons pendant 20 min sur la glace pour remettre en suspension l&#39;échantillon complètement. </li><li> Activez les colonnes de centrifugation C18 avec 500 pi CH 3 OH. </li><li> Équilibrer la colonne de spin avec deux lavages de 500 pi H 2 O puis charger l&#39;échantillon. Si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage. </li><li> Laver avec 500 pi H 2 O pour dessaler l&#39;échantillon. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration dans le lavageétapes. </li><li> Eluer avec deux volumes de 200 pi 80% CH 3 OH en H 2 O dans un tube Eppendorf pré-étiquetés propre 2 ml. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage. Continuer à 4,1. </li></ol> 3. Extraction des échantillons de tissus <ol><li> Selon le tissu, utiliser entre 10-100 mg de tissus congelés. Ajouter le morceau entier de tissu à un ml bas tube de pré-étiquetés 2 de rétention Eppendorf avec 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) dans un bain de glace en option:. Si les normes internes sont utilisés, ajoutez-le dans la mémoire tampon, avant d&#39;ajouter le tissu. </li><li> Homogénéiser le tissu dans la glace avec un broyeur de tissus électrique pendant 30 secondes dans chaque Eppendorf. Entre échantillons, nettoyer le broyeur de tissus à deux tubes séparés contenant CH 3 OH et H 2 O, respectivement. </li><li> Transfert de l&#39;homogénat de tissu avec une pipette en plastique dans un tube de centrifugation de verre pré-marqué 10 ml. Après le transfert, rincer chaque tube Eppendorf2x avec 1 ml de CH 3 OH et ajouter les lavages à l&#39;homogénat de tissu dans des tubes de verre. </li><li> Ajouter 4 ml de CHCl3 à chacun des tubes de verre de 10 ml contenant le broyat de tissus et de CH 3 OH lavages. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min. </li><li> Après agitation, centrifuger les échantillons avec une faible valeur d&#39;accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à séparer complètement les phases En option:. Pour éviter d&#39;utiliser le chloroforme, les extractions ont été mis au point avec CH 2 Cl 2. </li><li> Utilisation d&#39;une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1. </li><li> En utilisant une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche aqueuse à une nouvelle pré-étiquetés tube de centrifugation en verre de 10 ml. Aller à 2.6.2 pour le dessalage ou continuer à 4,1. </li></ol> 4. Re-suspension et la filtration des échantillons pour UPLC <ol><li> Évaporer le samples sous azote gazeux. </li><li> Reconstituer séché jusqu&#39;à échantillons dans un volume approprié de la solution de départ pour la méthode UPLC désirée (voir tableau 1). 50-100 ul est habituellement un volume re-suspension souhaitable. Doucement vortex et / ou d&#39;une pipette l&#39;échantillon de haut en bas pour aider à dissoudre les analytes. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans une um filtre du tube de nylon 0,22 et tournent à jusqu&#39;à 14.000 xg jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon ait complètement passé à travers le filtre (~ 5 min). Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas visible précipités restant dans l&#39;échantillon. </li><li> Transférer le surnageant de l&#39;échantillon filtré dans un flacon UPLC pré-marquée avec insert. Flacon de capsule, puis feuilleter le flacon pour éliminer les bulles à partir du fond de la cuvette d&#39;échantillon. Placer l&#39;échantillon dans l&#39;échantillonneur automatique réfrigéré (4-5 ° C). </li></ol> 5. UPLC Setup <ol><li> Utilisation du logiciel de contrôle du chromatographe en phase liquide, de créer une course pour l&#39;échantillon biologique basé au large des conditions énumérées à l&#39; <strong&gt; Tableau 1. Ensuite, créez une méthode pour la phase aqueuse hors les conditions énumérées dans le tableau 1 en option:. Si un ensemble connu des analytes cibles sont d&#39;un grand intérêt, d&#39;optimiser les conditions UPLC l&#39;aide de l&#39;analogue marqué lourd de ces composés, et de générer une méthode utilisant ces conditions . </li><li> Permettre à l&#39;UPLC pour équilibrer adéquatement. Cela devrait inclure un amorçage complet de solvants avant de fixer une colonne, et en suivant les instructions du fabricant pour le volume d&#39;équilibration d&#39;une nouvelle colonne (habituellement 3-5 volumes de colonne). Tenir un registre de départ de retour pressions pour aider à diagnostiquer les problèmes futurs. </li></ol> 6. Configuration du spectromètre de masse <ol><li> Utilisation du logiciel de contrôle du spectromètre de masse à haute résolution, de créer une méthode en mode positif en utilisant les conditions énumérées dans le tableau 2. Ensuite, en utilisant les mêmes conditions, créer une méthode de mode négatif en option:. Si un ensemble connu des analytes cibles sont de haute intEREST, la source et optimiser les conditions de l&#39;optique en utilisant l&#39;analogue marqué lourd de ces composés, et de générer un procédé utilisant ces conditions. </li><li> Nettoyer et étalonner l&#39;instrument, d&#39;établir un spray stable dans le spectromètre, et laisser le temps à la solution d&#39;étalonnage pour dissiper correctement de la source et de l&#39;optique. Bonne stabilité de pulvérisation doit donner une 3-5% RSD de l&#39;intensité sur au moins 100 balayages par injection d&#39;une solution d&#39;étalonnage à la même vitesse d&#39;écoulement que la méthode LC étant utilisé. </li><li> Mettre en place la séquence pour tous les échantillons, régler le volume d&#39;injection approprié, et d&#39;exécuter un espace avant le premier échantillon. Si report ou la matrice des effets entre les échantillons sont soupçonnés, exécutez blancs / lave adéquates. Les échantillons doivent être configurés de manière aléatoire à l&#39;aide d&#39;un générateur de nombre aléatoire et une clé pour éviter les effets de lots introduits par l&#39;analyse. Commentaire: Les échantillons de contrôle de la qualité, y compris les normes d&#39;isotopes stables ou normes d&#39;analyse de cibles potentielles peuvent êtreextrêmement précieux pour le dépannage et d&#39;assurer des résultats fiables, reproductibles et valides. Une technique répliquée d&#39;un seul échantillon de référence, suivie par un blanc de solvant peut être utilisé pour les accès écart d&#39;intensité du signal et le temps de rétention, ainsi que des reports dans la course vide. </li><li> Commencez séquence et surveiller périodiquement pour des problèmes tels que la variation de pression ou de perte d&#39;intensité du signal à travers la course. Si de graves problèmes sont détectés, arrêter la course, et recommencez à partir de 6.2. </li></ol> 7. Differential Analysis <ol><li> Deux flux sont présentés pour ce protocole. La première est à travers un tamis 2.0, un logiciel d&#39;analyse différentielle sans étiquette exclusive vendu par Thermo Fisher. Le deuxième flux est par XCMS en ligne, une plate-forme libre par Scripps Research Institute. 11 Avant de commencer l&#39;analyse différentielle, vérifier manuellement les TIC ou regarder chromatogrammes filtrés pour tous les composés connus dans l&#39;échantillon afin d&#39;assurer la reproductibilité des essaiset l&#39;injection / UPLC / spray stabilité dans tous les échantillons. </li><li> TAMIS <ol><li> Transférez le fichier. Fichiers de données brutes du spectromètre de masse sur le disque dur du poste de travail où tamis est installé. (Note: en cours d&#39;exécution tamis données stockées sur un disque dur connecté en réseau ou le port USB n&#39;est pas conseillé car il peut limiter la vitesse d&#39;analyse.) </li><li> Ouvert crible, et commencer une nouvelle expérience. </li><li> Chargez les fichiers appropriés dans tamis. </li><li> Affectez des groupes de comparaison et de sélectionner un fichier unique de référence pour permettre tamis pour générer des paramètres à analyser. </li><li> Suivez les instructions et régler tous les paramètres selon les exigences de toute expérience individuelle. Il est souvent conseillé de commencer avec des paramètres stricts, puis revenir en arrière et desserrer les paramètres comme paramètres plus généreuses peuvent allonger le temps d&#39;analyse. </li><li> Charger la liste de produit d&#39;addition correcte pour le mode positif ou négatif dans les paramètres. </li></ol></li><li> XCMS ligne <ol><li> Convertir des fichiersdans un format acceptable pour XCMS en ligne. Dans notre cas, nous convertissons à mzXML le format 19. </li><li> XCMS ouverts en ligne, et création d&#39;emploi. </li><li> Téléchargez et nommer des ensembles de données. Seuls deux ensembles de données (contrôle vs traitement) peuvent être téléchargées comme XCMS autonomes sont limitées à des comparaisons en tête-à-tête. </li><li> Sélectionnez les paramètres souhaités dans la liste déroulante. Paramètres pré-remplis sont disponibles pour différentes configurations d&#39;instrumentation, et ceux-ci peuvent encore être modifiés pour répondre aux besoins expérimentaux. Dans notre cas, nous utilisons les paramètres HPLC-Orbi2. </li><li> Soumettre et confirmer travail. </li></ol></li><li> Analyse des données <ol><li> Pour passoire et XCMS une liste de cadres et de fonctionnalités, respectivement, sera rempli une fois l&#39;analyse terminée. Assurez-vous que l&#39;alignement LC superpose les pics de repère. Si l&#39;une des séries LC non alignés spectacle à grand écart de sommets emblématiques, cela peut indiquer un problème avec l&#39;échantillon. Facultatif: Pour Sieve, si les normes internes sont utilisés, localisezle groupe de pic correspondant à normaliser et à la monture choisie. Pour XCMS On-line, la normalisation peut être effectuée dans un tableur après l&#39;exportation. </li><li> Tracer les données par le coefficient de variation (CV) dans un échantillon de population comme (par exemple des échantillons de contrôle). Toutes les grandes valeurs de CV peut indiquer un problème avec un ou plusieurs échantillons. Trier la liste en fonction des caractéristiques souhaitées (par exemple p-value &lt;0,05, facteur de variation&gt; 1,5, faible écart type au sein d&#39;un groupe, etc.) </li><li> Examinez chaque pic pour l&#39;alignement approprié de pointe dans tous les groupes, l&#39;intégration de pointe, gaussien forme de pic, intensité du signal, isotopes et l&#39;affectation des produits d&#39;addition. </li><li> Exporter des données comme vous le souhaitez pour une analyse ultérieure ou pour générer des listes de masse ciblées pour confirmation et n expériences de SEP. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+the+fission+yeast+S.+pombe%3A+quantification+of+compounds+under+different+temperatures+and+genetic+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation.</a> Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).</li>
<li>Makarov, A., Denisov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Evaluation+of+a+Hybrid+Linear+Ion+Trap%2FOrbitrap+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).</li>
<li>Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative%2C+validated+capillary+electrophoresis-time+of+flight-mass+spectrometry+method+with+integrated+high-confidence+analyte+identification+for+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics.</a> Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+methods+for+differential+analysis+of+LC%2FMS+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data.</a> BMC Bioinformatics. 6, 179(2005).</li>
<li>Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultra+performance+liquid+chromatography+coupled+to+q-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).</li>
<li>Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS2%3A+processing+tandem+mass+spectrometry+data+for+metabolite+identification+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization.</a> Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine%3A+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS%3A+Processing+Mass+Spectrometry+Data+for+Metabolite+Profiling+Using+Nonlinear+Peak+Alignment%2C+Matching%2C+and+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li>
<li>Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS+Online%3A+A+Web-Based+Platform+to+Process+Untargeted+Metabolomic+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).</li>
<li>Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Lipid+Extraction+for+Targeted+Stable+Isotope+Dilution+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis.</a> J. Vis. Exp. (57), e3399(2011).</li>
<li>Want, E. J., Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLCG%C3%87%C3%B4MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
<li>Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+extraction+from+suspension-cultured+mammalian+cells+for+global+metabolite+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling.</a> Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+metabolite+extraction+protocols+for+untargeted+metabolic+profiling+of+liver+samples+by+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).</li>
<li>Shaham, O., Slate, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+signature+of+human+mitochondrial+disease+revealed+through+metabolic+profiling+of+spent+media+from+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).</li>
<li>Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloromethane+as+a+Solvent+for+Lipid+Extraction+and+Assessment+of+Lipid+Classes+and+Fatty+Acids+from+Samples+of+Different+Natures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).</li>
<li>Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+proteomics+MS%2FMS+analysis+platform+utilizing+open+XML+file+formats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.</a> Mol. Syst. Biol. 1, (2005).</li>
<li>Cleveland, W. S., Devlin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+weighted+regression+-+an+approach+to+regression-analysis+by+local+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting.</a> J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).</li>
<li>Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+alignment+procedures+for+LC-MS+proteomics+and+metabolomics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 375(2008).</li>
<li>Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+feature+detection+for+high+resolution+LC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 504(2008).</li>
<li>Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAMERA%3A+An+Integrated+Strategy+for+Compound+Spectra+Extraction+and+Annotation+of+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometry+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets.</a> Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).</li>
<li>Kanehisa, M., Goto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG%3A+kyoto+encyclopedia+of+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).</li>
<li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+a+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PubChem%3A+a+public+information+system+for+analyzing+bioactivities+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules.</a> Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).</li>
<li>Wishart, D. S., Knox, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+a+knowledgebase+for+the+human+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: a knowledgebase for the human metabolome.</a> Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Folch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).</li>
<li>Avery, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+differential+ion+suppression+on+liquid+chromatography%2Fatmospheric+pressure+ionization+mass+spectrometric+bioanalytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Non ciblée métabolomique offre un outil puissant pour étudier biotransformations endogènes ou xénobiotiques, ou de capturer un profil métabolique d&#39;un échantillon d&#39;intérêt. La sortie de la balance de la technique avec la résolution et la sensibilité de la technologie utilisée pour séparer et analyser l&#39;échantillon, la capacité de faire face aux grands ensembles de données générées, et la possibilité d&#39;exploiter l&#39;ensemble des données des informations utiles (par exemple, la recherche précis...

Grâce aux progrès technologiques récents dans le domaine de la gestion des ressources humaines, non ciblées, génératrice d&#39;hypothèses métabolomique approches sont devenus une approche réalisable à l&#39;analyse d&#39;échantillons complexes. 1 spectromètres de masse capables de 100.000 résolution facilitant routine faible partie par million (ppm) Précision de masse sont devenus largement disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. 2,3 Cette précision de masse permet une plus grande spécificité et la confiance dans une mission préliminaire de l&#39;identité de l&#39;analyte, reconnaissance de formes isotopiques, et l&#39;identification des produits d&#39;addition. 4 Lorsque couplé avec une méthode d&#39;extraction appropriée et, mélanges complexes de haute performance LC ou UPLC peuvent être analysées avec une spécificité supplémentaire tirée des données de temps de rétention. 5 UPLC possède une plus grande efficacité chromatographique et permet une plus grande sensibilité, la résolution et l&#39;analyse temps à faire une plus grande couverture du métabolome possible. 6 Les grands ensembles de données qui en résultent peuvent être intégrés dans n&#39;importe quelde multiples logiciels d&#39;analyse différentielle et exploitées pour les modèles d&#39;utilité ou d&#39;analytes individuels d&#39;intérêt. 7,8,9,10,11 coups putatifs peuvent être initialement identifiés à l&#39;aide d&#39;une combinaison d&#39;algorithmes de détection de pointe, précise basée sur la prévision de la formule chimique de masse, la prédiction de la fragmentation et recherche de base de données chimique. Cette approche permet la priorisation des objectifs de temps identification structurelle complète ou pour le développement de dilution des isotopes stables plus sensible et plus spécifique de surveillance UPLC / sélectionné ou multiple réaction / MS études qui sont les méthodes standards actuels de l&#39;or pour la quantification. 12 La nature variable des échantillons biologiques a conduit à une optimisation des protocoles d&#39;extraction d&#39;urine 13, 14 cellules, le sérum 15 ou 16 tissu. Ce protocole caractéristiques extractions de cellules, le sérum et le tissu. Le cas échéant, des commentaires et des références supplémentaires ont été incluses pour moditions de la procédure pour l&#39;inclusion des isotopes stables, ou l&#39;inclusion des métabolites particulièrement instables.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Réactif</fort></td></tr><tr><td>Phosphate Saline</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Eau (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Acétonitrile (CH3CN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Méthanol (CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Chloroforme (CH3Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hazard Dichlorométhane (CH2Cl2)</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>Pour remplacer le chloroforme</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td>Pour remplacer</td></tr><tr><td>l’acide formique chloroforme (FA)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(optima)</td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Formiate d’ammonium (HCOONH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78314</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin C18 Colonnes</td><td>Nest Group Inc</td><td>SS18V</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Tubes à centrifuger en verre</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Tubes à centrifuger en plastique</td><td>CellTreat</td><td>CLS-4301-015</td><td></td></tr><tr><td>Flacons LC (verre)</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Inserts LC (verre)</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr><tr><td>LC Flacons (plastique)</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186002640</tr><tr><td>0,22 &mu ; m Filtres</td><td>Corning</td><td>8169</td><td>nylon</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td>Faible Rétention</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse haute résolution</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL-Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/UPLC</td><td>Waters</td><td>nanoACQUITY UPLC</td><td></td></tr><tr><td>Source</td><td>Michrom</td><td>Thermo Logiciel d’analyse</td> différentielle Thermo <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>SIEVE 2.0</td><td></td></tr><tr><td>nanoACQUITY C18 BEH130</td><td>Waters</td><td>186003546</td><td>1.7 &mu ; taille des particules M, 150 mm x 100 &mu ; m</td></tr><tr><td>Acentis Express C8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54262</td><td>2.7 &mu ; taille des particules M, 15 cm x 200 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant ultraperformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (uplc-hrms)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Nous présentons ici un flux de travail pour analyser les profils métaboliques des échantillons biologiques d&#39;intérêt, y compris, les cellules, le sérum ou les tissus. L&#39;échantillon est d&#39;abord séparé en fractions polaires et non polaires par une extraction en phase liquide-liquide, et partiellement purifié pour faciliter l&#39;analyse en aval. Les deux aqueuses (métabolites polaires) et organique phases (métabolites non polaires) de l&#39;extraction initiale sont traitées pour étudier un large éventail de métabolites. Les métabolites sont séparées par différentes méthodes de chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés de la partition. Dans cette méthode, nous présentons microflow ultra performant (UP) méthodes LC, mais le protocole est extensible à des débits plus élevés et des pressions plus basses. L&#39;introduction dans le spectromètre de masse peut être soit par des conditions optimisées de source générales ou composé. La détection d&#39;un large éventail d&#39;ions est effectuée en mode balayage complet en mode à la fois positif et négatif sur une large gamme m / z en utilisant haute résolution sur un récemment calibrated instrument. Sans étiquette analyse différentielle est effectuée sur les plates-formes bioinformatique. Les applications de cette approche comprennent le dépistage métabolique de la voie, la découverte de biomarqueurs et le développement de médicaments.

Les résultats présentés montrent les données sélectionnées à partir d&#39;un traitement de 6 h de cellules de glioblastome SH-SY5Y avec le pesticide et complexe mitochondrial I inhibiteur de la roténone. Par souci de concision, seules les données du mode positifs de phase organique est présenté. Les échantillons ont été traités et analysés comme décrit ci-dessus (figure 1, tableau 1, tableau 2) et chargés sur deux plates-formes d&#39;analyse différentielle pour le label sans quantification, tamis et XCM...

Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d&#39;un profil métabolique. Ce protocole démontrera l&#39;extraction et l&#39;analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d&#39;analyse différentielle.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de comparer des instantanés des profils métaboliques de différents groupes d'échantillons biologiques. Cela est réalisé en utilisant une extraction liquide-liquide afin de séparer les molécules organiques et polaires. Dans une deuxième étape, les molécules sont davantage séparées par chromatographie liquide et analysées par spectrométrie de masse à haute résolution, ce qui fournit des données de temps de rétention, de rapport masse/charge et d'intensité pour des analyses ultérieures.Les prochaines analyses par chromatographie liquide sont alignées et les caractéristiques sont détectées, quantifiées et triées. Afin d'identifier les caractéristiques dont l'abondance diffère entre les groupes. Les résultats montrent les différences de caractéristiques selon les conditions de traitement, basées sur l'abondance différentielle des analytes telle que détectée par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse à haute résolution.Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier le métabolisme cellulaire, elle peut également fournir des informations sur la découverte de biomarqueurs ou le métabolisme zéno-biotique. Pour les lignées adhérentes, ajouter 1,5 millilitre de milieu aux cellules dans une plaque de 10 centimètres. Placer la plaque sur de la glace et racler délicatement pour détacher les cellules.Transférez 1,5 millilitre de suspension cellulaire soulevée dans un tube en verre de centrifugation de 10 millilitres préalablement étiqueté. Ensuite, ajoutez six millilitres de chloroforme-méthanol deux pour un à chacun des tubes en verre de 10 millilitres contenant les échantillons. Agitez les échantillons à faible vitesse pendant 30 minutes. Après agitation, centrifugez les échantillons avec un réglage de faible accélération et décélération à 1 935 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de séparer complètement les phases, à l’aide d’une pipette Pasteur à longue tige.Transférez la couche organique dans un nouveau tube à centrifuger en verre de 10 millilitres préalablement étiqueté. Ensuite, transférez la couche aqueuse dans un tube einor en plastique propre de deux millilitres. À ce stade, évaporez les échantillons organique et aqueux sous un courant d'azote gazeux.Reconstituez les échantillons séchés dans 50 à 100 microlitres de la solution initiale correspondant à la méthode UPLC souhaitée. Pipetez doucement l'échantillon plusieurs fois afin de faciliter la dissolution des analytes. Transférez ensuite chaque échantillon dans un filtre en nylon de 0,22 micron et centrifugez à environ 14 000 ×g pendant cinq minutes, jusqu'à ce que l'échantillon ait complètement traversé le filtre.Inspectez l'échantillon pour vous assurer qu'aucun précipité visible n'est présent. Transférez le surnageant de l'échantillon filtré dans un flacon UPLC pré-étiqueté avec bouchon à insert, puis agitez-le légèrement pour éliminer toute bulle présente au fond du flacon. Placer l'échantillon dans l'autoéchantillonneur réfrigéré. Créer ensuite une analyse pour l'échantillon organique à l'aide du logiciel de contrôle du chromatographe liquide. Ensuite, créer une analyse pour l'échantillon organique selon les conditions UPLC optimisées.Utilisez les conditions UPLC optimisées pour créer également une méthode pour la phase aqueuse. Si un ensemble connu d'analytes cibles présente un intérêt particulier, optimisez les conditions UPLC à l'aide de l'analogue marqué lourdement de ces composés et élaborez une méthode. À l'aide de ces conditions, laissez l'UPLC s'équilibrer adéquatement.Cela devrait inclure une mise en place complète des solvants avant de fixer une colonne et de suivre les instructions du fabricant concernant le volume d'équilibrage d'une nouvelle colonne. Tenez un registre des pressions arrière initiales afin d'aider à diagnostiquer d'éventuels problèmes futurs à l'aide du logiciel de contrôle du spectromètre de masse à haute résolution. Créez une méthode en mode positif, puis, en utilisant les mêmes conditions, créez une méthode en mode négatif.Nettoyez et étalonnez l'instrument. Établissez un spray stable dans le spectromètre et laissez suffisamment de temps pour que la solution d'étalonnage se dissipe correctement depuis la source et les optiques. Une stabilité adéquate du spray doit fournir un écart-type relatif de 3 à 5 % sur l'intensité, sur au moins 100 balayages, avec une injection de la solution d'étalonnage au même débit que celui utilisé dans la méthode LC.À l'aide d'un générateur de nombres aléatoires et d'une clé, préparer les échantillons de manière randomisée afin d'éviter tout effet de lot introduit par l'analyse. Établir la séquence pour tous les échantillons. Régler un volume d'injection approprié et exécuter un blanc avant le premier échantillon.Si des interférences ou des effets de matrice entre échantillons sont suspectés, exécutez des blancs ou des lavages suffisants, démarrez la séquence et surveillez périodiquement les problèmes, notamment les fluctuations de pression ou la perte d'intensité du signal au cours de l'analyse. Si des problèmes graves sont détectés, arrêtez l'analyse. Nettoyez et étalonnez l'instrument.Établir un spray stable vers le spectromètre et laisser suffisamment de temps pour que la solution d'étalonnage se dissipe adéquatement de la source et des optiques. Avant de commencer l'analyse différentielle, vérifier manuellement les courants ioniques totaux ou examiner les chromatogrammes filtrés à la recherche de tout composé connu dans l'échantillon. Pour garantir la reproductibilité des analyses ainsi que la stabilité de l'injection, de la UPLC et du spray tout au long de tous les échantillons, transférer les fichiers de données brutes (RAW) du spectromètre de masse vers le disque dur de la station de travail sur laquelle Sieve est installé.Ouvrir le tamis. Commencer une nouvelle expérience et charger les fichiers appropriés dans le tamis. Attribuer des groupes de comparaison et sélectionner un seul fichier de référence pour permettre à SIE V de générer les paramètres d'analyse.Suivez les invites et ajustez les paramètres selon les exigences de chaque expérience. Chargez la liste correcte d'adduits pour le mode positif ou négatif dans les paramètres. Une fois l'analyse terminée, vérifiez qu'une liste de trames a été remplie à l'écran.Veillez à ce que l'alignement de la CL recouvre les pics de référence. Si l'un des chromatogrammes en CL non alignés présente un écart important au niveau des pics de référence, cela pourrait indiquer un problème avec l'échantillon.Tracer les données par coefficient de variation au sein d'une population d'échantillons similaire. Trier la liste selon les caractères souhaités. Ensuite, examiner chaque pic pour vérifier l'alignement approprié des pics entre les groupes.Intégration des pics, forme de pic gaussienne, intensité du signal, attribution des isotopes et des adduits. Exporter les données selon les besoins pour des analyses supplémentaires ou pour générer des listes ciblées de masses afin de confirmer les expériences en spectrométrie de masse. Un grand nombre de résultats positifs ont été identifiés par les deux programmes utilisés pour la différenciation : les points verts correspondent aux caractéristiques plus abondantes dans le témoin, tandis que les points rouges sont plus abondants dans le traitement.Une taille de point plus grande indique une augmentation de l'ampleur du changement d'expression entre les groupes, et l'intensité de la couleur illustre une diminution de la valeur de P avec une saturation croissante de la couleur représentée. Voici les chromatogrammes montrant l'analyse en mode ions positifs par UPLC-MS de la phase organique : la fenêtre A présente le courant ionique total de S Civ 2.0. Le chromatogramme d'ions extraits pour la caractéristique identifiée comme D paneth par XCMS est affiché dans la fenêtre B. La fenêtre C montre le chromatogramme d'ions extraits pour la caractéristique identifiée comme rot connue de sve.La fenêtre D montre le chromatogramme d'ions extraits de la caractéristique identifiée comme rot known provenant de sve normalisé par rapport au courant ionique total. Une caractéristique différentiellement abondante, réduite dans le groupe traité au rot known, a été identifiée de manière préliminaire comme étant la d panadine par recherche dans une base de données de masse exacte. L'identité de l'analyte a été confirmée par spectrométrie de masse tandem U-P-L-C-H-R.On voit ici une comparaison des chromatogrammes et des spectres de masse de l'échantillon et du composé pur. N'oubliez pas que le travail avec le chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées, comme l'utilisation d'une hotte de ventilation adéquate, doivent être prises.

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Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme.  Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Un protocole pour l'extraction complète de lipides, de métabolites et de protéines à partir de tissus biologiques en utilisant un échantillon est présenté.

Une méthode simple d&#39;extraction fractionnée pour l&#39;analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d&#39;un seul échantillon

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma à l’aide d’une méthode de chromatographie-spectrométrie de masse semi-ciblée.

Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés

Nous avons construit un flux de travail métabolomique non ciblé qui intégrait XY-Meta et metaX ensemble. Dans ce protocole, nous avons montré comment utiliser XY-Meta pour générer une bibliothèque spectrale de leurre à partir de références de spectres en libre accès, puis effectué un contrôle FDR et utilisé le metaX pour quantifier les métabolites après avoir identifié les spectres métabolomiques.

Un flux de travail intégré d’identification et de quantification sur le métabolome non ciblé basé sur le contrôle FDR

Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer avec précision et fiabilité les métabolites dans les types de cellules rares. Des améliorations techniques, y compris un fluide de gaine modifié pour le tri cellulaire et la génération d’échantillons à blanc pertinents, permettent une quantification complète des métabolites avec une entrée de seulement 5000 cellules par échantillon.

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Découvrez la métabolomique non ciblée pour l'analyse de profils métaboliques en utilisant l'extraction liquide-liquide et la spectrométrie de masse haute résolution. Cette méthode permet d'identifier les métabolites différentiellement abondants entre groupes.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) (Vidéo) | JoVE Journal

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

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