Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

L’objectif général de l’expérience suivante est de comparer des instantanés des profils métaboliques de différents groupes d’échantillons biologiques. Ceci est réalisé en utilisant une extraction liquide, liquide pour séparer les molécules organiques et polaires. Dans un deuxième temps, les molécules sont séparées par chromatographie liquide et analysées par spectrométrie de masse à haute résolution, qui fournit des données sur le temps de rétention, le rapport masse/charge et l’intensité pour une analyse plus approfondie.

Les cycles suivants de chromatographie liquide sont alignés et les caractéristiques sont détectées, quantifiées et triées. Afin d’identifier les caractéristiques différentiellement abondantes entre les groupes. Les résultats montrent les différences de caractéristiques entre les conditions de traitement en fonction de l’abondance différentielle des analytes détectés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse à haute résolution.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier le métabolisme cellulaire, elle peut également donner un aperçu de la découverte de biomarqueurs ou du métabolisme zénobiotique. Pour les lignes adhérentes, ajoutez 1,5 millilitre de média dans les cellules dans une plaque de 10 centimètres. Placez la plaque sur de la glace et grattez doucement pour soulever les cellules.

Transférez les 1,5 millilitres de suspension à cellules soulevées dans un tube à centrifuger en verre pré-étiqueté de 10 millilitres. Ensuite, ajoutez six millilitres de méthanol chloroforme à deux pour un dans chacun des tubes de verre de 10 millilitres contenant les échantillons. Agitez les échantillons à basse vitesse pendant 30 minutes Après avoir agité, centrifugez les échantillons avec un réglage de décélération à faible accélération à 1 935 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour séparer complètement les phases à l’aide d’une pipette à longue tige.

Transférez la couche organique dans un nouveau tube à centrifuger en verre de 10 millilitres pré-étiqueté. Ensuite, transférez la couche aqueuse dans un tube en plastique propre de deux millilitres. À ce stade, évaporez les échantillons organiques et aqueux sous l’azote gazeux.

Reconstituez les échantillons séchés dans 50 à 100 microlitres de la solution de départ pour la méthode UPLC souhaitée. Pipetez doucement l’échantillon de haut en bas pour aider à dissoudre les analytes. Transférez ensuite chaque échantillon dans un tube filtrant en nylon de 0,22 micron et tournez jusqu’à 14 000 fois G pendant environ cinq minutes jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement passé à travers le filtre.

Inspectez l’échantillon pour vous assurer qu’il ne reste pas de précipités visibles dans l’échantillon. Transférez le surnageant de l’échantillon filtré dans un flacon UPLC pré-étiqueté avec bouchon d’insertion du flacon. Ensuite, effleurez-le pour éliminer les bulles du fond du flacon d’échantillon.

Placez l’échantillon dans l’échantillonneur automatique réfrigéré. Créez maintenant un cycle pour l’échantillon organique à l’aide du logiciel de contrôle du chromatographe liquide. Ensuite, créez un cycle pour l’échantillon organique en fonction des conditions UPLC optimisées.

Utilisez les conditions UPLC optimisées pour créer également une méthode pour la phase aqueuse. Si un ensemble connu d’analytes cibles présente un grand intérêt, optimisez les conditions UPLC en utilisant l’analogue fortement marqué de ces composés et générez une méthode. En utilisant ces conditions, permettez à l’UPLC de s’équilibrer adéquatement.

Avant de fixer une colonne et de suivre les instructions du fabricant pour le volume d’équilibrage d’une nouvelle colonne, tenez un registre des contre-pressions de démarrage pour aider à diagnostiquer les problèmes futurs à l’aide du logiciel de contrôle du spectromètre de masse à haute résolution. Créez une méthode en mode positif. Ensuite, en utilisant les mêmes conditions, créez une méthode en mode négatif.

Nettoyez et calibrez l’instrument. Établissez une pulvérisation stable dans le spectromètre et laissez le temps à la solution d’étalonnage de se dissiper adéquatement à partir de la source et de l’optique. La stabilité acceptable de la pulvérisation doit donner un écart-type relatif de 3 à 5 % de l’intensité sur au moins 100 balayages avec injection de solution d’étalonnage au même débit que la méthode lc utilisée.

À l’aide d’un générateur de nombres aléatoires et d’une clé, configurez les échantillons de manière aléatoire pour éviter les effets de lot introduits par l’analyse. Configurez la séquence pour tous les échantillons. Réglez le volume d’injection approprié et analysez un blanc avant le premier échantillon.

Si l’on soupçonne un transfert ou des effets matriciels entre les échantillons, effectuez des blancs ou des lavages adéquats, commencez la séquence et surveillez périodiquement les problèmes, y compris les fluctuations de pression ou la perte d’intensité du signal tout au long du cycle. Si des problèmes graves sont détectés, arrêtez la course. Nettoyez et calibrez l’instrument.

Établissez une pulvérisation stable dans le spectromètre et laissez le temps à la solution d’étalonnage de se dissiper adéquatement à partir de la source et de l’optique. Avant de commencer l’analyse différentielle, vérifiez manuellement les courants ioniques totaux ou examinez les chromatogrammes filtrés pour tout composé connu dans l’échantillon. Pour assurer la reproductibilité des tirages et la stabilité de l’injection slash UPLC slash spray sur tous les échantillons, transférez les fichiers de données RAW du spectromètre de masse vers le disque dur du poste de travail où le tamis est installé.

Ouvrez le tamis. Commencez une nouvelle expérience et chargez les fichiers appropriés dans la passoire. Attribuez des groupes de comparaison et sélectionnez un seul fichier de référence pour permettre à SIE V de générer les paramètres d’analyse.

Suivez les instructions et ajustez tous les paramètres selon les exigences de chaque expérience individuelle. Chargez la liste d’adduits correcte pour le mode positif ou négatif dans les paramètres. Une fois l’analyse terminée, vérifiez qu’une liste de cadres a été renseignée à l’écran.

Assurez-vous que l’alignement LC recouvre tous les pics de repère. Si l’une des exécutions lc non alignées présente un écart important dans les pics de repère. Cela peut indiquer un problème avec l’échantillon.

Tracez les données par coefficient de variation au sein d’un échantillon de population similaire. Triez la liste en fonction des caractéristiques souhaitées. Ensuite, examinez chaque pic pour un alignement de pic approprié entre les groupes.

Intégration des pics, gaussienne, intensité du signal de forme de crête, isotopes et affectation des adduits. Exportez les données à volonté pour une analyse plus approfondie ou pour générer des listes de masse ciblées pour confirmation et MS jusqu’aux expériences finales. Un grand nombre de résultats positifs ont été identifiés par les deux programmes utilisés pour les points verts différentiels sont des caractéristiques plus abondantes dans le contrôle, tandis que les points rouges sont plus abondants dans le traitement.

Une taille de point plus grande indique une amplitude accrue du changement de pli entre les groupes et l’intensité de la couleur démontre une valeur P décroissante avec l’augmentation de la saturation de la couleur représentée. Voici les chromatogrammes montrant le mode d’ions positifs en phase organique La fenêtre d’analyse UPLC MS A montre le courant ionique total de S Civ 2.0. Le chromatogramme ionique extrait de la caractéristique identifiée comme D paneth par XCMS est affiché dans la fenêtre B.La fenêtre C montre le chromatogramme ionique extrait pour la caractéristique identifiée comme pourriture connue de sve.

La fenêtre D montre le chromatogramme ionique extrait de la caractéristique identifiée comme pourriture connue de sve normalisée au courant ionique total. Une caractéristique différentiellement abondante réduite dans le groupe traité à la pourriture connue a été provisoirement identifiée comme étant la d panadine par une recherche de masse précise dans les bases de données. L’identité de l’analyte a été confirmée par spectrométrie de masse en tandem U-P-L-C-H-R.

Voici une comparaison des chromatogrammes et des spectres de masse de l’échantillon et du composé pur. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées, telles qu’une hotte bien ventilée, doivent être suivies.