Name: Lanalyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier linteraction protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Découvrez une méthode BiFC par cytométrie de flux pour cartographier les interactions protéine-protéine entre AKAP-Lbc et PDE4D3 dans les cellules HEK293T. Cette approche quantitative permet un criblage à haut débit rapide et fiable.

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Nous remercions le laboratoire O&#39;Bryan à l&#39;UIC pour l&#39;évaluation expérimentale critique et à la discussion. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association Grant 11SDG5230003 à GKC et National Center for Advancing Translational Sciences - Centre des sciences de l&#39;UIC clinique et translationnelle Grant UL1TR000050.

1. La transfection cellulaire <ol><li> Cellules de la plaque le jour avant la transfection, le placage moins de cellules pour immunofluorescence. <ol><li> Pour immunofluorescence: dans un des lamelles de verre manteau plaque à 6 puits (1 par puits) avec 0,02% de gélatine à 37 ° C pendant au moins 4 heures, laver une fois avec le milieu, et pour chaque puits, la plaque 1 x 10 5 HEK 293T cellules dans 2 ml de milieu de croissance complet [media de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) plus 10% de FBS]. </li><li> Pour des analyses par transfert de cytométrie et de l&#39;Ouest flux: plaque 1,2 x 10 5 cellules HEK 293T / puits dans 2 ml de milieu de croissance complet en plaque de 6 puits (0,3 x 10 5 cellules HEK 293T dans un milieu de croissance complet de 0,5 ml par puits dans une plaque de 24 puits ). </li></ol></li><li> Préparer l&#39;ADN pour la transfection selon le protocole de fabrication: Effectene (Qiagen) est utilisé pour immunofluorescence. TransIT-LT1 (Mirus) est utilisé pour des analyses par transfert de cytométrie et de l&#39;Ouest débit. Montant de l&#39;ADN utilisé est répertorié ci-dessous. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> Plaque de 24 puits (ng) </td><td> Plaque de 6 puits (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vecteur </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) </td><td> 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-DUC1 (un fragment N-terminal PDE4D3 contenant le domaine DUC1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-DUC 2 + CAT (un fragment C-terminal PDE4D3 contenant les domaines du Programme DUC 2 et catalytique) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Transfection en utilisant Effectene (6 puits): <ol><li> Ajouter la quantité indiquée d&#39;ADN plasmidique + 4 pl activateur à 100 pi de tampon CE, mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 5 ul Effectene, mélanger et incuber pendant 10 min àla température ambiante. Ajouter goutte à goutte aux cellules. </li></ol> Transfection en utilisant le transport en commun LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Ajouter la quantité indiquée d&#39;ADN plasmidique à 250 μl/50 ul d&#39;Opti-MEM I milieu sans sérum dans un tube stérile. </li><li> Ajouter transit LT1 réactif au mélange d&#39;ADN dilué et la pipette doucement pour mélanger. (Transit-LT1 réactif: rapport de l&#39;ADN est de 3 pi de transit LT1 réactif par 1 pg d&#39;ADN). </li><li> Incuber pendant 30 min à température ambiante et ajouter goutte à goutte aux cellules. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des cellules pour la cytométrie en flux, Western blot et immunofluorescence <ol><li> 24 h après la transfection, vérifiez fluorescence sous microscope à épifluorescence avant la récolte des cellules. </li><li> La préparation des cellules pour l&#39;analyse par cytométrie de flux: <ol><li> Laver les cellules avec 0,5 ml / 2 ml de PBS glacé pour les plaques 24-well/6-well. </li><li> Détacher les cellules à l&#39;aide de 50 μl/250 ul 0,05% de trypsine. </li><li> Neutraliser la trypsine avec 200 pl / 1 ml du milieu DMEM. </li><li> Collect 250 pi de cellules (à la fois pour plaque de 24 puits et 6 puits) par centrifugation à 500 g pendant 5 min, utilisent les cellules restantes (1 ml) pour analyse par Western blot. </li><li> Reprendre les cellules dans 250 ul de tampon FACS [PBS + 0,5% (p / v) de BSA + 2 mM EDTA], un magasin sur la glace pour l&#39;analyse par cytométrie de flux. Les cellules peuvent également être fixés en paraformaldéhyde à 1% (en PBS) si l&#39;analyse de cytométrie de flux ne sera pas immédiate. </li></ol></li><li> La préparation des cellules pour l&#39;analyse Western blot: menée en parallèle avec la préparation de la cellule d&#39;analyse de cytométrie en flux. <ol><li> Laver les cellules 1x avec 2 ml de PBS glacé, lyse des cellules par addition de 100 pi de tampon de lyse cellulaire [tampon de 10 mM de phosphate de sodium, pH 6,95, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] . </li><li> Recueillir lysat cellulaire par centrifugation pendant 10 min à 21000 g à 4 ° C. </li><li> Quantifier la concentration de la protéine par dosage des protéines de Bradford, charger des quantités égales de protéines par voie de SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose pour immunoblot. </li></ol&gt; </li><li> La préparation des cellules pour immunofluorescence. <ol><li> Rincer les cellules 3x avec 2 ml de PBS, réparer les cellules dans 1 ml de 3,7% de paraformaldéhyde (dans PBS) pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3x avec 2 ml de PBS pendant 5 min. </li><li> Montez couvrir glissement sur une lame de verre, en utilisant un milieu de montage. Sceller les bords de la lamelle à l&#39;aide de vernis à ongles si nécessaire. </li><li> Stocker les lames à 4 ° C avant l&#39;examen. </li></ol></li></ol> 3. cytométrie de flux et immunofluorescence <ol><li> La cytométrie en flux est réalisée à l&#39;aide d&#39;un Beckman Coulter Cyan ADP, équipé de 488 nm, 405 nm et 642 nm lasers à semi-conducteurs. logiciel Summit est utilisé pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse. <ol><li> Calibrer cytomètre de flux en utilisant des billes standard. </li><li> Terrain diffusion vers l&#39;avant (FSC) / latéral scatter (SSC) sur une échelle linéaire pour la population de cellules vivantes de déclenchement. </li><li> Terrain FSC / tension largeur d&#39;impulsion pour la population de cellules vivantes non agrégées déclenchement. </li><li> Terrain count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) sur une échelle logarithmique pour les cellules vivantes CFP-positifs non agrégées déclenchement. </li><li> Terrain count/FL1 (YFP fluorescence, 488 nm) sur une échelle logarithmique pour l&#39;intensité BiFC. </li><li> Exécuter des échantillons YFP-CFP-Double Negative, ajuster FSC, SSC, FL1 et FL6 tube photomultiplicateur (PMT) de tension de fixer le seuil pour chaque signal. </li><li> Exécuter positif unique (à la fois YFP + et + PCP) échantillons pour la rémunération future off-line </li><li> Acquérir au moins 10.000 événements dépendants (+ cellules vivantes PCP non agrégées) pour analyse. </li></ol></li><li> Immunofluorescence est réalisée en utilisant un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Remarque: il est important de garder tous les paramètres (comme le zoom, sténopé, gain du détecteur, amplificateur de décalage, la taille d&#39;image, vitesse de balayage, balayage moyenne, et la puissance du laser) cohérente entre des échantillons de comparaison correcte de toutes les données. </li></ol> 4. Analyse des données (réalisées avec le logiciel Summit) <ol><li> Mettre en place le protocole d&#39;analyse similaire à celle de acquisition avec déclenchement approprié: Porte 1 à FSC / SSC en points pour les cellules vivantes. Porte 2 au FSC / largeur d&#39;impulsion de la porte 1 pour les cellules vivantes non agrégées. Porte 3 de la numération / CFP de la porte 3 pour PCP non agrégées + cellules vivantes. </li><li> Compenser YFP et le signal YFP PCP en utilisant + et + PCP cellules positives simples. </li><li> Lignes réexamen de coupure pour les cellules CFP / YFP-positif. </li><li> Export YFP intensité moyenne de fluorescence (MFI) de PCP + cellules dans Excel pour les données de traçage. </li><li> Normaliser YFP IMF à des niveaux d&#39;expression de AKAP-Lbc, PDE4D3, et le chargement contrôle α-tubuline, tel que déterminé par Western blot. </li></ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li>
<li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).</li>
<li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Adv.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li>
<li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).</li>
<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l&#39;interaction protéine-protéine dans les cellules et d&#39;étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d&#39;interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites molécules / peptid...

650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales 1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l&#39;étalon-or pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules 3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l&#39;énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) 4,5. BiFC est basé sur l&#39;association facilité de deux fragments d&#39;une protéine fluorescente (ici nous utilisons Vénus; une variante YFP) qui sont fusionnées chacune à un partenaire de protéine d&#39;interaction potentielle (dans cet exemple, nous utilisons AKAP-Lbc et PDE4D3). L&#39;interaction des deux protéines d&#39;intérêt dans les cellules en résulte fluorescence fonctionnel, qui peut être visualisée par fmicroscopie luorescence en utilisant soit des cellules vivantes ou fixe 6,7,8. Comparé à d&#39;autres ACI, BiFC est sensible et techniquement moins difficile, avec un potentiel d&#39;étudier la localisation cellulaire dans les cellules vivantes. Un inconvénient majeur de cette technique est cependant que, une fois formé, le complexe protéine fluorescente peut pas être inversée. Par conséquent, il n&#39;est pas une bonne méthode pour étudier l&#39;interaction dynamique de la protéine-protéine. Dans cet article, nous utilisons BiFC pour cartographier les sites d&#39;interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc en contrôlant l&#39;intensité de fluorescence de Vénus. Par rapport à l&#39;analyse traditionnelle en utilisant la microscopie à fluorescence, qui prend beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre (si elle n&#39;est pas effectuée en utilisant des machines à haut débit automatisé), la cytométrie en flux permet une analyse quantitative simple de milliers de cellules dans une population hétérogène sur une courte période 9, 10. Ici, en effectuant une comparaison côte-à-côte de l&#39;écoulement cytométrie-BiFC et co-IP traditionnel, nous démontrons que les deux mes méthodes fournissent des données comparables, toutefois, analyse des flux BiFC cytométrie prend moins de temps et utilise moins de matériaux qui peuvent être plus utiles lorsque les cellules d&#39;intérêt sont limités.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>RÉACTIFS</fort></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217 ; s modifié Eagle&#8217 ; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine (stylo/streptocoque), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-drapeau</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HA</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945 ;-tubuline</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire, culture tissulaire à 6 puits traitée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit de purification plasmidique, haute vitesse</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217 ; s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), stérile 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 0,05 % (p/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond rond pour coloration FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td> S74337MF Réactif anti-décoloration à <td>l’or</td><td></td></tr><tr><td>Prolong avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest verre de protection premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>CO2 Incubateur à enveloppe</td><td></td><td></td><td>d’air NuAIR DH microscope</td></tr><tr><td>confocal LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité d’électrophorèse et de transfert</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Cytomètre en flux</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Parmi les méthodes d&#39;étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l&#39;aide de deux fragments non fluorescents d&#39;une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l&#39;interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d&#39;une protéine fluorescente fonctionnelle à l&#39;intérieur des cellules. BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l&#39;intensité de fluorescence. Cependant, l&#39;analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l&#39;interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l&#39;hétérogénéité dans l&#39;expression des protéines et de l&#39;interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d&#39;interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l&#39;interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l&#39;interaction protéine-protéine.

AKAP-Lbc et PDE4D3 constructions (figure 1B) ont été fusionnées au VN et fragments de capital-risque, respectivement. Interaction des AKAP-Lbc et PDE4D3 résultats en fonction YFP fluorescence (figure 1A). Ici, nous utilisons la méthode BiFC pour cartographier les sites AKAP-Lbc contraignantes dans PDE4D3. Région en amont conservé 1 (DUC1), région en amont conservé 2 (DUC 2) et la région catalytique (CAT) sont conservées parmi PDE4 protéines de la famille, donc, pleine longueur (FL), DUC...

L&#39;analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l&#39;interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier les sites d'interaction entre ACAP LBC et PDE quatre D trois. Pour ce faire, on mesure l'intensité moyenne de fluorescence de la complémentation de la fluorescence biomoléculaire ou de BC par cytométrie en flux. Les cellules sont transfectées avec des fragments d'ACAP LBC et de PDE quatre D trois fusionnés à la portion N-terminale ou C-terminale de la protéine rapporteur fluorescente.La cytométrie en flux Venus est ensuite réalisée pour évaluer la fluorescence si les fragments protéiques interagissent, entraînant la complétion de Venus et l'émission de fluorescence. Si les fragments protéiques n'interagissent pas, aucune fluorescence n'est détectée. Une analyse complémentaire du sang par immunotransfert est effectuée afin de déterminer les niveaux relatifs d'expression protéique.La force des interactions entre protéines est ensuite calculée en normalisant l'intensité moyenne de fluorescence de YFP par rapport aux niveaux d'expression protéique. Les données obtenues indiquent que la liaison de la PDE 43 à l'ACAP LBC est médiée par plusieurs régions au sein de la PDE 43, principalement par la région conservée en amont un ou UCR un. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la co-immunoprécipitation et le BP C utilisant un microscope résident dans sa simplicité relative, sa sensibilité et sa capacité à faciliter le criblage rapide d'un grand nombre de cellules.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre protéines, elle peut également être utilisée pour rechercher des facteurs régulant ces interactions protéine-protéine dans le cadre de la découverte de médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il est nécessaire de déterminer une réponse B linéaire. L'expression du construit doit être similaire afin que les résultats obtenus avec différents fragments protéiques puissent être comparés entre eux.Dans les expériences décrites ici, les cellules sont cotransfectées avec le fragment N-terminal du dérivé YFP, Venus fusionné à la protéine ACAP LBC pleine longueur, et le fragment C-terminal de Venus fusionné à l'un des éléments suivants : la PDE E 43 pleine longueur, la région conservée en amont une (UCR une) de la PDE E 43, ou la région conservée en amont deux plus la région catalytique (UCR R deux plus CAT) de la PDE 43. La veille du transfectage, dans des plaques de culture tissulaire à six puits, semer 1,2 × 10⁵ cellules HEC 293 T par puits dans deux millilitres de milieu de croissance complet. Semer trois puits témoins ainsi que trois puits pour chacun des tests.Incuber les Cotran à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, préparer la transfection des constructions d'ADN plasmidique BC et du vecteur CFP, qui est co-transfecté avec les constructions BS C comme marqueur. Pour chaque condition, ajouter la quantité appropriée d'ADN à 250 microlitres de milieu Optum M1 sans sérum.Dans un tube stérile, un tube suffit pour transfecter trois puits. Ajouter ensuite trois microlitres du réactif Transit LT1 pour chaque microgramme au mélange d'ADN dilué et pipeter doucement pour homogénéiser. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajouter goutte à goutte 250 microlitres du mélange de transfection aux cellules, puis incuber à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Après la transfection, vérifier la fluorescence au microscope à fluorescence épiscopique : les cellules doivent exprimer une fluorescence jaune pour le signal BC et une fluorescence CFP pour le contrôle de l'efficacité de transfection. Pour préparer les cellules en vue d'une analyse par cytométrie en flux, les laver d'abord avec deux millilitres de PBS glacé, puis détacher les cellules en ajoutant 250 microlitres de trypsine 0,05 % et incuber deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, utiliser un microscope pour vérifier le détachement des cellules.Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec un millilitre de DMEM. Ensuite, transférez un millilitre de cellules dans un tube de microcentrifugation, puis transférez 0,25 millilitre de cellules dans un second tube de microcentrifugation. Faites centrifuger les tubes à 500 cheeses pendant cinq minutes.L'échantillon de 250 microlitres sera davantage traité pour la cytométrie en flux. Mettez l'échantillon d'un millilitre de côté sur de la glace pour l'analyse sanguine occidentale, qui doit être réalisée en parallèle après la centrifugation Resus. Suspendez les cellules dans 250 microlitres de tampon fax et placez-les sur de la glace. Les cellules peuvent également être fixées dans du paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS. Si l'analyse par cytométrie en flux n'est pas immédiate, la cytométrie en flux est réalisée à l'aide d'un Beckman Coulter Cyan ADP équipé de lasers à état solide de 488 nanomètres, 405 nanomètres et 642 nanomètres. Le logiciel Summit est utilisé pour l'acquisition et l'analyse, après étalonnage du cytomètre en flux à l'aide de billes standards. Représentez la diffusion directe (FSC) en fonction de la diffusion latérale (SSC) sur une échelle linéaire et sélectionnez la population de cellules vivantes.Ensuite, tracer le SSC en fonction de la largeur d'impulsion de tension et du gait sur la population de cellules vivantes non agrégées. Puis, tracer le FSC à échelle linéaire en fonction de la fluorescence CFP à 405 FL6 sur cet instrument à échelle logarithmique, et du gait sur les cellules vivantes CFP positives non agrégées. Enfin, tracer le FSC à échelle linéaire en fonction de la fluorescence YFP à 488 nanomètres FL1 sur cet instrument à échelle logarithmique afin de visualiser l'intensité de BC.Ensuite, exécutez l'échantillon double négatif YFP-CFP et ajustez la tension du tube photomultiplicateur (PMT) du canal FL un et du canal FL six de l'analyseur FSC-SSC afin de définir le seuil pour chaque signal. Ensuite, exécutez les échantillons uniques positifs pour YFP et CFP afin d'effectuer ultérieurement la compensation hors ligne. Veillez à acquérir au moins 10 000 événements dans la fenêtre de sélection.Enfin, collectez les données pour les échantillons expérimentaux après la collecte de données. Configurez le protocole d'analyse conformément à l'acquisition, en propageant le seuil un dans le diagramme en points FS CSC pour les cellules vivantes. Seuil deux dans le diagramme en points d'impulsion FSC du seuil un pour les cellules vivantes non agrégées et seuil trois dans le diagramme en points ccfp FSC du seuil deux pour les cellules vivantes positives à ccfp non agrégées.Après compensation du signal YFP et CCFP sur le diagramme de dispersion Yfp CFP à l’aide des cellules unipositives pour YFP et CFP, nous déterminons les seuils de démarcation pour les cellules positives à CFP et YFP. Exportez l’intensité moyenne de fluorescence YFP ou MFI des cellules positives à CFP vers Excel pour le tracé des données, puis normalisez dans Excel l’intensité de fluorescence moyenne YFP au niveau d’expression de ACAP LBC PDE E 43 et au témoin de chargement alpha-tubuline, tel qu’évalué par immunotransfert, afin de déterminer la plage linéaire de l’intensité moyenne de fluorescence YFP. CFP a été co-transfecté avec VN ACAP L BBC et des quantités variables de VC PDE E 43 dans des cellules HEC 2 93, et l’interaction a été évaluée par cytométrie en flux bifluorescente comme décrit dans cette vidéo ; ce graphique montre la variation relative du niveau d’expression de VC PDE E 43 en fonction de la quantité de VC PDE E 43 transfectée.L'intensité moyenne de fluorescence de Venus dans les cellules positives pour le CFP, indiquée par les carrés bleus, était corrélée à l'expression de VCDE 43 et concordait avec les niveaux d'expression déterminés par analyse d'image d'un immunoblot, représentés par les triangles rouges. Une intensité moyenne de fluorescence similaire pour le CFP a été observée parmi les échantillons, comme indiqué par les carrés verts, et a été utilisée comme contrôle négatif afin de limiter les variations cellulaires. Ces résultats valident l'utilisation de la cytométrie en flux pour quantifier l'interaction ACAB LB C PDE 43 en mesurant l'intensité moyenne de fluorescence de BS e, tout en déterminant simultanément la quantité appropriée de constructions BIC utilisées pour le criblage afin de cartographier les sites de liaison de ACAP LBC au sein de PDE E 43. L'analyse BIC de l'interaction entre ACAP LBC et la forme pleine longueur de PDE E 43 (fl).La région UCR une de la PDE 43 et les régions UCR deux et CAT de la PDE 43 ont été évaluées à l’aide de cette méthode, comme indiqué ici. L’expression de vn ACAP LBC et de VC PDE 43 UCR deux plus CAT entraîne un signal BC plus faible par rapport à VC PDE 43 FL, tandis qu’une expression protéique similaire a été observée dans tous les échantillons en flux, et la fluorescence moyenne a été normalisée aux niveaux d’expression relatifs de ACAP LBC PDE 43 et de l’alpha-tubuline. Ainsi, le B-C-M-F-I normalisé indique qu’il n’y a aucune différence d’intensité de fluorescence entre ACAP LBC PDE 43 FL et ACAP LBC PDE 43 UCR R un, mais un signal nettement plus faible pour l’interaction ACAP LBC PDE 43 UCR deux plus CAT.Ces résultats suggèrent qu'il existe plusieurs régions dans la PDE 43 qui interagissent avec le LBC d'ACAP, et que l'UCR R de la PDE 43 est la région principale d'interaction avec le LBC d'ACAP. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier l'interaction entre protéines par analyse en cytométrie en flux du BP C. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de déterminer la quantité adéquate de vecteur BP C à utiliser afin d'obtenir une expression protéique similaire et une réponse linéaire du BP C. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'utilisation de peptides ou le risque, peuvent être réalisées afin de déterminer quels acides aminés présents dans la PDE 40 D trois sont responsables de.Ses interactions entre l'ACAP et les globules rouges.

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