L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine

L’objectif global de cette procédure est de cartographier les sites d’interaction de l’ACAP LBC avec les EDP quatre, D, trois. En mesurant l’intensité moyenne de fluorescence de la biomolécule, de la fluorescence, de la complémentation ou de la BC à l’aide de la cytométrie en flux. Pour ce faire, les cellules sont transfectées avec ACAP LBC et PDE quatre D trois fragments fusionnés à la partie terminale N ou C de la protéine rapporteure fluorescente.

La cytométrie en flux de Vénus est ensuite effectuée pour évaluer la fluorescence si les fragments de protéine interagissent avec Vénus et la fluorescence. Si les fragments de protéines n’interagissent pas, aucune fluorescence n’est détectée. Des analyses sanguines occidentales gratuites sont effectuées pour déterminer les niveaux d’expression relatifs des protéines.

L’intensité des interactions protéine-protéine est ensuite calculée en normalisant l’intensité moyenne de fluorescence YFP avec les niveaux d’expression protéique. Les données résultantes indiquent que la liaison de PDE 43 à l’ACAP LBC est médiée par plusieurs régions au sein de PDE 43, principalement par le biais de la première région conservée en amont ou UCR un. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la co-immunoprécipitation et la BP C au microscope sont qu’elle est relativement simple, sensible et qu’elle facilite le dépistage rapide d’un grand nombre de cellules.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions protéine-protéine, elle peut également être utilisée pour dépister les facteurs qui régulent les interactions protéine-protéine pour la découverte de médicaments. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce qu’une réponse B linéaire doit être déterminée. L’expression d’une construction doit être similaire afin que les différents fragments de protéines puissent être comparés les uns aux autres.

Dans les expériences décrites ici, les cellules sont transfectées avec le fragment terminal N du dérivé YFP, Vénus fusionnée avec l’ACAP LBC pleine longueur et le fragment terminal C de Vénus fusionné avec l’un des PDE E 43 de pleine longueur, la région conservée en amont un UCR un de la PDE E 43 ou la région conservée en amont deux plus la région catalytique UCR R deux plus CAT de la PDE 43 la veille de la transfection en Six. Eh bien, les plaques de culture tissulaire ensemencent 1,2 fois 10 au cinquième HEC 2 9 3 cellules T par puits dans deux millilitres de croissance complète. Semences moyennes, trois puits témoins et trois puits pour chacun des essais.

Cotran incube à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, préparez-vous à la transfection des constructions d’ADN plasmatique BC et du vecteur CFP, qui est transfecté par cot avec des constructions BS C comme marqueur. Pour chaque condition, ajoutez la quantité appropriée d’ADN à 250 microlitres de milieu sans sérum Optum M1.

Dans un tube stérile, un tube suffit pour transfecter trois puits. Ajoutez ensuite trois microlitres de transit LT, un réactif pour chaque microgramme au mélange d’ADN dilué et pipetez doucement pour mélanger, incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation à 250 microlitres de mélange de transfection, incubez goutte à goutte dans les cellules, puis incubez à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, 24 heures.

Fluorescence de contrôle post-transfection sous un microscope à épifluorescence, les cellules doivent exprimer une fluorescence jaune pour le signal BC et une fluorescence CFP pour signaler l’efficacité de la transfection. Pour préparer les cellules à l’analyse cytométrique en flux, lavez-les d’abord avec deux millilitres de PBS glacé, puis détachez les cellules en ajoutant 250 microlitres de trypsine à 0,05 %, incubez pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’un microscope, vérifiez le détachement des cellules.

Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec un millilitre de DMEM. Ensuite, transférez un millilitre de cellules dans un micro-tube de centrifugation, puis transférez 0,25 millilitre de cellules dans un deuxième micro-tube de centrifugation. Faites tourner les tubes à 500 fromages pendant cinq minutes.

L’échantillon de 250 microlitres sera ensuite traité pour la cytométrie en flux. Mettez l’échantillon d’un millilitre de côté sur de la glace pour l’analyse de sang occidental, qui doit être effectuée en parallèle après le spin Resus. Suspendez les cellules dans 250 microlitres de tampon de fax et placez-les sur de la glace Les cellules peuvent également être fixées dans 1 % d’aldéhyde paraforme dans PBS Si l’analyse par cytométrie en flux ne sera pas immédiate ici, la cytométrie en flux est effectuée à l’aide d’un Beckman Coulter cyan un DP équipé de lasers à semi-conducteurs de 488 nanomètres, 405 nanomètres et 642 nanomètres Le logiciel Summit est utilisé pour l’acquisition et l’analyse après étalonnage du cytomètre en flux à l’aide de billes standard, tracer la dispersion vers l’avant ou FSC par rapport à la SSC à diffusion latérale sur une échelle linéaire et la marche sur la population de cellules vivantes.

Graphique suivant : SSC en fonction de la largeur d’impulsion de tension et de la démarche sur la population de cellules vivantes non agrégées. Ensuite, tracez le FSC sur une échelle linéaire en fonction de la fluorescence CFP à 405 FL six sur cet instrument sur une échelle logarithmique et la démarche sur les cellules positives CFP vivantes non agrégées. Enfin, tracez la FSC sur une échelle linéaire en fonction de la fluorescence YFP à 488 nanomètres FL un sur cet instrument sur une échelle logarithmique pour visualiser l’intensité BC.

Ensuite, exécutez l’échantillon double négatif Y-F-P-C-F-P et ajustez le tube photomultiplicateur F-S-C-S-S-C FL one et FL six ou la tension PMT pour définir le seuil de chaque signal. Ensuite, exécutez les échantillons positifs uniques YFP et CFP pour une compensation hors ligne future. Assurez-vous d’acquérir au moins 10 000 événements fermés.

Enfin, recueillir des données pour des échantillons expérimentaux après la collecte des données. Configurez le protocole d’analyse selon l’acquisition avec la propagation avec la porte un dans le diagramme à points FS CSC pour les cellules vivantes. Porte deux dans l’impulsion FSC avec graphique à points de la première porte pour les cellules vivantes non agrégées et la porte trois dans le diagramme à points FSC ccfp de la deuxième porte pour les cellules vivantes positives ccfp non agrégées.

Après avoir compensé le signal YFP et CCFP dans le diagramme à points Y fp CFP à l’aide de cellules positives simples YFP et CFP, nous déterminons les lignes limites pour les cellules positives CFP et YFP. Exportez l’intensité moyenne de fluorescence YFP ou MFI des cellules CFP positives pour exceller pour le traçage des données, puis dans Excel normalisez Y-F-P-M-F-I au niveau d’expression de ACAP LBC PDE E 43 et de contrôle de charge alpha tubuline tel que déterminé par western blot pour déterminer la plage linéaire de l’intensité moyenne de fluorescence YFP. La CFP a été transectée par cot avec VN ACAP L BBC et des quantités variables de VC PDE E 43 dans les cellules HEC 2 93 et l’interaction a été évaluée à l’aide de la cytométrie en flux bif comme décrit dans cette vidéo, ce graphique montre le changement de pli relatif dans l’expression de VC PDE E 43 en fonction de VC PDE E 43 transfectée.

L’intensité moyenne de fluorescence de Vénus dans les cellules positives à la CFP indiquée par les carrés bleus était corrélée avec l’expression de VCDE 43 et était cohérente avec les niveaux d’expression déterminés par l’analyse d’image d’un western blot, qui est indiqué par les triangles rouges. Une intensité de fluorescence moyenne CFP similaire a été observée parmi les échantillons, comme l’indiquent les carrés verts, et a été utilisée comme contrôle négatif pour limiter les variations cellulaires. Ces résultats valident l’utilisation de la cytométrie en flux pour quantifier l’interaction ACAB LB C PDE 43 en mesurant l’intensité moyenne de fluorescence de BS e tout en déterminant la quantité appropriée de constructions BIC utilisées pour le dépistage afin de cartographier les sites de liaison ACAP LBC dans PDE E 43 Analyse BIC de l’interaction ACAP LBC avec PDE E 43 fl pleine longueur.

La région DUC une de la PDE 43 et les régions UCR deux et CAT de la PDE 43 ont été évaluées à l’aide de cette méthode, comme on le voit ici. L’expression de vn, ACAP, LBC et VC, PDE 43 UCR deux plus CAT entraîne un signal BC plus faible par rapport à VC, PDE 43, FL et VC PDE 43 UCR, une expression protéique similaire a été observée dans tous les échantillons en flux, et la fluorescence moyenne a été normalisée en fonction des niveaux d’expression relatifs de ACAP, LBC, PDE 43 et alpha tubuline. Par conséquent, le B-C-M-F-I normalisé indique qu’il n’y a pas de différence d’intensité de fluorescence entre ACAP LBC PDE 43 FL et ACAP LBC PDE 43 UCR R un, mais un signal beaucoup plus faible pour ACAP LBC PDE 43 UCR deux plus l’interaction CAT.

Ces résultats suggèrent qu’il existe plusieurs régions dans la PDE 43 qui interagissent avec l’ACAP LBC et que la PDE 43 UCR R one est la principale région d’interaction avec l’ACAP LBC. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier l’interaction protéine, protéine par analyse cytométrique en flux de la BP C. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de déterminer la quantité correcte de construction BP C utilisée pour obtenir une expression protéique similaire et une réponse linéaire BP C. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le peptide ou le risque peuvent être effectuées afin de déterminer quels acides aminés contenus dans la PDE 40 D trois sont responsables.

Ses interactions ACAP RBC.