L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine

L'objectif général de cette procédure est de cartographier les sites d'interaction entre ACAP LBC et PDE quatre D trois. Pour ce faire, on mesure l'intensité moyenne de fluorescence de la complémentation de la fluorescence biomoléculaire ou de BC par cytométrie en flux. Les cellules sont transfectées avec des fragments d'ACAP LBC et de PDE quatre D trois fusionnés à la portion N-terminale ou C-terminale de la protéine rapporteur fluorescente.

La cytométrie en flux Venus est ensuite réalisée pour évaluer la fluorescence si les fragments protéiques interagissent, entraînant la complétion de Venus et l'émission de fluorescence. Si les fragments protéiques n'interagissent pas, aucune fluorescence n'est détectée. Une analyse complémentaire du sang par immunotransfert est effectuée afin de déterminer les niveaux relatifs d'expression protéique.

La force des interactions entre protéines est ensuite calculée en normalisant l'intensité moyenne de fluorescence de YFP par rapport aux niveaux d'expression protéique. Les données obtenues indiquent que la liaison de la PDE 43 à l'ACAP LBC est médiée par plusieurs régions au sein de la PDE 43, principalement par la région conservée en amont un ou UCR un. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la co-immunoprécipitation et le BP C utilisant un microscope résident dans sa simplicité relative, sa sensibilité et sa capacité à faciliter le criblage rapide d'un grand nombre de cellules.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre protéines, elle peut également être utilisée pour rechercher des facteurs régulant ces interactions protéine-protéine dans le cadre de la découverte de médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il est nécessaire de déterminer une réponse B linéaire. L'expression du construit doit être similaire afin que les résultats obtenus avec différents fragments protéiques puissent être comparés entre eux.

Dans les expériences décrites ici, les cellules sont cotransfectées avec le fragment N-terminal du dérivé YFP, Venus fusionné à la protéine ACAP LBC pleine longueur, et le fragment C-terminal de Venus fusionné à l'un des éléments suivants : la PDE E 43 pleine longueur, la région conservée en amont une (UCR une) de la PDE E 43, ou la région conservée en amont deux plus la région catalytique (UCR R deux plus CAT) de la PDE 43. La veille du transfectage, dans des plaques de culture tissulaire à six puits, semer 1,2 × 10⁵ cellules HEC 293 T par puits dans deux millilitres de milieu de croissance complet. Semer trois puits témoins ainsi que trois puits pour chacun des tests.

Incuber les Cotran à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, préparer la transfection des constructions d'ADN plasmidique BC et du vecteur CFP, qui est co-transfecté avec les constructions BS C comme marqueur. Pour chaque condition, ajouter la quantité appropriée d'ADN à 250 microlitres de milieu Optum M1 sans sérum.

Dans un tube stérile, un tube suffit pour transfecter trois puits. Ajouter ensuite trois microlitres du réactif Transit LT1 pour chaque microgramme au mélange d'ADN dilué et pipeter doucement pour homogénéiser. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajouter goutte à goutte 250 microlitres du mélange de transfection aux cellules, puis incuber à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après la transfection, vérifier la fluorescence au microscope à fluorescence épiscopique : les cellules doivent exprimer une fluorescence jaune pour le signal BC et une fluorescence CFP pour le contrôle de l'efficacité de transfection. Pour préparer les cellules en vue d'une analyse par cytométrie en flux, les laver d'abord avec deux millilitres de PBS glacé, puis détacher les cellules en ajoutant 250 microlitres de trypsine 0,05 % et incuber deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, utiliser un microscope pour vérifier le détachement des cellules.

Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec un millilitre de DMEM. Ensuite, transférez un millilitre de cellules dans un tube de microcentrifugation, puis transférez 0,25 millilitre de cellules dans un second tube de microcentrifugation. Faites centrifuger les tubes à 500 cheeses pendant cinq minutes.

L'échantillon de 250 microlitres sera davantage traité pour la cytométrie en flux. Mettez l'échantillon d'un millilitre de côté sur de la glace pour l'analyse sanguine occidentale, qui doit être réalisée en parallèle après la centrifugation Resus. Suspendez les cellules dans 250 microlitres de tampon fax et placez-les sur de la glace. Les cellules peuvent également être fixées dans du paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS. Si l'analyse par cytométrie en flux n'est pas immédiate, la cytométrie en flux est réalisée à l'aide d'un Beckman Coulter Cyan ADP équipé de lasers à état solide de 488 nanomètres, 405 nanomètres et 642 nanomètres. Le logiciel Summit est utilisé pour l'acquisition et l'analyse, après étalonnage du cytomètre en flux à l'aide de billes standards. Représentez la diffusion directe (FSC) en fonction de la diffusion latérale (SSC) sur une échelle linéaire et sélectionnez la population de cellules vivantes.

Ensuite, tracer le SSC en fonction de la largeur d'impulsion de tension et du gait sur la population de cellules vivantes non agrégées. Puis, tracer le FSC à échelle linéaire en fonction de la fluorescence CFP à 405 FL6 sur cet instrument à échelle logarithmique, et du gait sur les cellules vivantes CFP positives non agrégées. Enfin, tracer le FSC à échelle linéaire en fonction de la fluorescence YFP à 488 nanomètres FL1 sur cet instrument à échelle logarithmique afin de visualiser l'intensité de BC.

Ensuite, exécutez l'échantillon double négatif YFP-CFP et ajustez la tension du tube photomultiplicateur (PMT) du canal FL un et du canal FL six de l'analyseur FSC-SSC afin de définir le seuil pour chaque signal. Ensuite, exécutez les échantillons uniques positifs pour YFP et CFP afin d'effectuer ultérieurement la compensation hors ligne. Veillez à acquérir au moins 10 000 événements dans la fenêtre de sélection.

Enfin, collectez les données pour les échantillons expérimentaux après la collecte de données. Configurez le protocole d'analyse conformément à l'acquisition, en propageant le seuil un dans le diagramme en points FS CSC pour les cellules vivantes. Seuil deux dans le diagramme en points d'impulsion FSC du seuil un pour les cellules vivantes non agrégées et seuil trois dans le diagramme en points ccfp FSC du seuil deux pour les cellules vivantes positives à ccfp non agrégées.

Après compensation du signal YFP et CCFP sur le diagramme de dispersion Yfp CFP à l’aide des cellules unipositives pour YFP et CFP, nous déterminons les seuils de démarcation pour les cellules positives à CFP et YFP. Exportez l’intensité moyenne de fluorescence YFP ou MFI des cellules positives à CFP vers Excel pour le tracé des données, puis normalisez dans Excel l’intensité de fluorescence moyenne YFP au niveau d’expression de ACAP LBC PDE E 43 et au témoin de chargement alpha-tubuline, tel qu’évalué par immunotransfert, afin de déterminer la plage linéaire de l’intensité moyenne de fluorescence YFP. CFP a été co-transfecté avec VN ACAP L BBC et des quantités variables de VC PDE E 43 dans des cellules HEC 2 93, et l’interaction a été évaluée par cytométrie en flux bifluorescente comme décrit dans cette vidéo ; ce graphique montre la variation relative du niveau d’expression de VC PDE E 43 en fonction de la quantité de VC PDE E 43 transfectée.

L'intensité moyenne de fluorescence de Venus dans les cellules positives pour le CFP, indiquée par les carrés bleus, était corrélée à l'expression de VCDE 43 et concordait avec les niveaux d'expression déterminés par analyse d'image d'un immunoblot, représentés par les triangles rouges. Une intensité moyenne de fluorescence similaire pour le CFP a été observée parmi les échantillons, comme indiqué par les carrés verts, et a été utilisée comme contrôle négatif afin de limiter les variations cellulaires. Ces résultats valident l'utilisation de la cytométrie en flux pour quantifier l'interaction ACAB LB C PDE 43 en mesurant l'intensité moyenne de fluorescence de BS e, tout en déterminant simultanément la quantité appropriée de constructions BIC utilisées pour le criblage afin de cartographier les sites de liaison de ACAP LBC au sein de PDE E 43. L'analyse BIC de l'interaction entre ACAP LBC et la forme pleine longueur de PDE E 43 (fl).

La région UCR une de la PDE 43 et les régions UCR deux et CAT de la PDE 43 ont été évaluées à l’aide de cette méthode, comme indiqué ici. L’expression de vn ACAP LBC et de VC PDE 43 UCR deux plus CAT entraîne un signal BC plus faible par rapport à VC PDE 43 FL, tandis qu’une expression protéique similaire a été observée dans tous les échantillons en flux, et la fluorescence moyenne a été normalisée aux niveaux d’expression relatifs de ACAP LBC PDE 43 et de l’alpha-tubuline. Ainsi, le B-C-M-F-I normalisé indique qu’il n’y a aucune différence d’intensité de fluorescence entre ACAP LBC PDE 43 FL et ACAP LBC PDE 43 UCR R un, mais un signal nettement plus faible pour l’interaction ACAP LBC PDE 43 UCR deux plus CAT.

Ces résultats suggèrent qu'il existe plusieurs régions dans la PDE 43 qui interagissent avec le LBC d'ACAP, et que l'UCR R de la PDE 43 est la région principale d'interaction avec le LBC d'ACAP. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier l'interaction entre protéines par analyse en cytométrie en flux du BP C. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de déterminer la quantité adéquate de vecteur BP C à utiliser afin d'obtenir une expression protéique similaire et une réponse linéaire du BP C. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'utilisation de peptides ou le risque, peuvent être réalisées afin de déterminer quels acides aminés présents dans la PDE 40 D trois sont responsables de.

Ses interactions entre l'ACAP et les globules rouges.