Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Pour tester l’interaction entre deux protéines, les deux gènes d’intérêt doivent être clonés dans notre BF et nos vecteurs à l’aide de la technique de l’attente de passerelle. Ces constructions sont transformées en aerium GV 3 1 0 1. Les cultures bactériennes GV 3 1 0 1 contenant à construire seront mélangées et co-infiltrées dans les feuilles.

Si les deux protéines candidates interagissent l’une avec l’autre, le signal YFP peut être observé à l’aide de la focale de résultat Mexique. L’objectif principal de la technique BFC est de tester l’interaction entre deux protéines. In vavo, nous avons créé une série de VOC et de deux vecteurs hybrides compatibles avec les passerelles qui fournissent aux chercheurs des outils faciles à utiliser pour effectuer à la fois des tests BFC et ISTO deux hybrides.

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer la facilité d’utilisation de notre système BFC. Pour tester la protéine, les interactions protéiques de manière non égale transcendent le système d’expression. Tout d’abord, vous devez préparer la culture bactérienne GV 3 1 0 1.

Vous devez choisir une seule colonie dans votre assiette et inoculer dans cinq mâles du milieu YEB avec des antibiotiques appropriés. Ensuite, vous devez secouer cette culture pendant la nuit à 28 degrés. La vitesse est de 200 courses par minute.

Les cultures bactériennes doivent être prêtes le lendemain matin. Assurez-vous que la bactérie D s’est trop développée. Sortez les cultures de l’incubateur et transférez un mâle de chaque culture dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 mâle.

Placez les tubes de centrifugation dans une centrifugeuse de bureau. Faites tourner les bactéries à 1000 G pendant 10 minutes à température ambiante, jetez le filet. Ensuite, observez le pénate en ajoutant un repas de milieu d’infiltration et la réévaluation par caresses plusieurs fois.

Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Ceci est important car cela aide à éliminer la trace d’antibiotiques dans le milieu bactérien, qui vous font planter des joints après infiltration. Après le lavage final, resus suspend la palette dans 0,5 moyen d’infiltration mâle mesure jusqu’à 600 de ces suspensions bactériennes à l’aide d’un spectrophotomètre utilisant le milieu d’infiltration comme contrôle de banque.

Après la mesure du diamètre extérieur, vous devez ajuster le diamètre extérieur à l’aide d’un moyen d’infiltration. La DO finale doit être comprise entre 1 et 1,2. Vous devez préparer toutes les suspensions bactériennes avant de passer à l’étape suivante.

Transférez une quantité égale de suspensions bactériennes correspondant à vos deux protéines candidates et mélangez-les dans un nouveau tube mâle de 1,5 Le mélange de bactéries négatives est maintenant lié à l’infiltrat. Préparez toutes les combinaisons et n’oubliez pas d’inclure un contrôle négatif. Vous devez utiliser un code de cinq à six semaines et les plantes de la meilleure manière pour l’infiltration.

Vous pouvez retirer les plantes de la salle de culture et les placer sur We night pendant une heure avant l’infiltration pour ouvrir l’attaque de la tempête. Cela facilitera le processus d’infiltration. Prélevez environ 100 microlitres de bactéries en suspension Resus.

Mélanger près d’une seringue mâle à bout glissé sans l’aiguille. Placez l’extrémité de la seringue contre le dessous de la feuille. Soutenez la partie supérieure du genou avec votre doigt.

Appuyez généralement sur le piston. Vous devriez être en mesure de voir le liquide se diffuser à travers la feuille tout en ressentant le Meso plus mince Les espaces d’air après infiltration permettent l’aéro infiltré avec un marqueur. Sinon, après deux jours, vous ne serez pas en mesure d’identifier l’infiltré A.Si vous devez infiltrer avec un mélange bactérien différent, assurez-vous de vaporiser votre gant avec de l’éthanol à 50 % ou de changer vos gants G entre les infiltrations.

Essayez de laisser un espace d’un mètre entre les infiltrations pour éviter la contamination croisée. Les signaux PFA doivent être surveillés toutes les 24 heures à partir de l’infiltration jusqu’à cinq jours. Vous pouvez utiliser deux manchons de couverture de tailles différentes pour contenir l’échantillon.

Tout d’abord, mettez une goutte de mini eau sur un manchon de couvercle à encoche. Coupez ensuite un petit morceau de tissu de couteau dans la zone infiltrée. Essayez d’éviter la nausée Veine dans l’échantillon.

Mettez le tissu du couteau coupé dans l’eau sur la diapositive Sous-déposez, couvrez-le à l’aide d’un manchon de courant plus petit et appuyez doucement. Maintenant, l’échantillon peut être observé dans le cadre du Mexique. Ici, nous utilisons ce NACA T CSS P deux confocales Mexique pour visualiser le signal BIFC.

Même le parfum mexicain régulier peut être utilisé. Confocal fournit de meilleures images et détecte les signaux faibles. Vous pouvez utiliser le paramètre YFP pour détecter les signaux VFC dans ce système NCA P deux.

Vous pouvez simplement double-cliquer sur ce préréglage YFP ici, qui activera automatiquement l’excitation et définira la plage de détection d’émission. Si vous utilisez un système différent, veuillez vous référer au manuel pour régler correctement les paramètres. Nous espérons qu’après avoir regardé cette vidéo, vous serez en mesure d’effectuer le BFCE pour tester les interactions protéiques à l’aide du système d’expression unbe MI Transcend.

Vous pouvez également appliquer cette procédure aux plants de tabac et d’AY. Nos vecteurs BFC contiennent également respectivement une balise HA et un tag, de sorte que vous pouvez également effectuer une co-IP pour valider les interactions si nécessaire.