Name: Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez la technique BiFC pour visualiser les interactions protéiques en temps réel dans les plantes. Ce protocole utilise le clonage Gateway et la transformation par Agrobacterium pour reconstituer le signal YFP.

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Nous remercions Vi Nguyen pour la lecture du manuscrit et de l&#39;assistance du laboratoire général.

1. Préparation de la culture d'Agrobacterium <ol><li> Souche d'Agrobacterium GV3101 préalablement transformées avec Gateway compatibles BiFC vecteur pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN, contenant chacune une construction de fusion de l'IGE. </li><li> Inoculer un 5-ml YEB (5g L Extrait de bœuf -1, 1g L extrait de levure -1, 5g L -1 peptonée, 5g L -1 de saccharose, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) culture de la protéine de fusion BiFC construit transformée par Agrobacterium avec la sélection appropriée des antibiotiques. Cultivez la culture nuit à 28 ° C en agitant à 200 rpm. </li><li> Retirer 1 ml de culture dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml. </li><li> Cellules Pellet à 1000 g pendant 10 min à température ambiante, éliminer le surnageant. </li><li> Laver le culot en ajoutant 1 ml de milieu d'infiltration (5 g L -1 D-glucose, 50 mM de MES (Sigma), 2 mM de Na 3 PO 4, 0,1 mM acétosyringone) 11. Resuspendre le culot par pipetage, les cellules granulés de nouveau à 1000 g pendant 10 min. </li><li> Répéter l'étape de lavage deux fois plus. </li><li> Reprendre le culot dans 0,5 ml de l'infiltration des médias. </li><li> Mesurer l'absorbance à 600 nm et ajuster finale DO 600 de 1,0 à 1,2. </li><li> Aliquoter une quantité égale de suspension d'Agrobacterium de chaque construction dans un nouveau tube de 1,5 ml, vortex pendant 10 sec. Pour une infiltration simple, 100 ul de chaque construction est plus que suffisant. </li><li> Le mélange d'Agrobacterium est maintenant prêt pour l'infiltration. </li></ol> 2. L'infiltration <ol start="11"><li> N. benthamiana sont cultivés à 21 ° C, avec 16 h de lumière &amp;-8-H cycles sombre. Cinq à six semaines des plantes, âgé doit être utilisé pour l'infiltration. </li><li> Retirez les plantes de la salle de la croissance et la placer sous la lumière blanche pour 1 h avant infiltratring permettant les stomates pour ouvrir complètement. </li><li> Dresser le mélange en suspension d'Agrobacterium dans un 1 ml glissement bout de la seringue tuberculine sans aiguille. </li><li> Placez l'extrémité de la seringue contre le dessous de la feuille et doucement appuyer sur le piston tout en soutenant directement la face supérieure de la feuille avec un seul doigt. Le liquide se diffuse à travers la feuille car elle remplit les espaces aériens mesophyllar. </li><li> Étiquette de la zone infiltrée avec un marqueur pour l'identification future. </li><li> Lorsque l'infiltration avec des constructions différentes, assurez-vous soit à modifier vos gants ou les nettoyer avec de l'éthanol 70% entre les infiltrations. Si possible, laisser un espace nervure médiane entre différents échantillons afin de prévenir la contamination croisée. </li><li> Placez les plantes dans une armoire de la croissance dans des conditions normales de croissance. </li></ol> 3. Observation du signal reconstitué YFP <ol start="18"><li> Un segment d'accise 5mm x 5mm de tissus foliaires au sein de la zone infiltrée </li><li> Mont de l'échantillon, dans l'eau, sur une lame de microscope en verre, couvrir l'échantillon avec une lamelle et examiner les interactions à l'aide d'un microscope confocal ou fluorescence. </li><li> Expression doit être surveillée toutes les 24 heures à partir du moment de l'infiltration jusqu'à 5 jours plus tard que sur l'expression / la traite peuvent conduire à des protéines de fusion fluorescentes affichant plusieurs endroits différents sur un parcours de temps. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Un exemple de l'interaction protéine-protéine testée par un test BiFC est montré dans la figure 1. AtTHP1 et AtSAC3A sont censés être des composants de l'homologue d'Arabidopsis de levure TREX-2 complexes. Ils peuvent interagir avec un AtNUP1 nuclearporin et de faciliter l'exportation 10 ARNm. AtTHP1 et AtSAC3A ont été clonées dans pEarlyGate201-YC tandis AtNUP1 a été cloné dans pEarlyGate202-YN. Les constructions ont été ensuite transformée en GV3101. Les trois constructions ont été jumelés avec 3 combinaisons possibles (+ AtTHP1 AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) pour l'infiltration. Le signal reconstitué YFP a été observée sous une LCSM 48 heures après l'infiltration. Les signaux ont été observés dans les cellules épidermiques et localisé dans la périphérie nucléaire ou du plasma nucléaire, ce qui est cohérent avec la localisation sub-cellulaire de ces protéines. Les contrôles négatifs n'ont montré aucun signal de la YFP. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Arabidopsis TREX-2 composants complexes exportations ARNm interagissent les uns avec les autres. N. benthamiana feuilles, co-transformé avec des constructions des IGE fusionnée à pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN (comme indiqué), ont été imagées 48-72 h après l'infiltration, en utilisant un Leica TCS SP2 confocol microscope. Les images sont montré que YFP confocale fusionné et champ lumineux des images de l'épiderme N. benthamiana cellules de la feuille

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Test BiFC est un outil puissant pour étudier les interactions entre protéines. Contrairement à l&#39;analyse traditionnelle Y2H, BiFC non seulement permet la visualisation des interactions protéine-protéine, mais fournit également plus d&#39;informations sur le complexe protéique, comme localisation sub-cellulaire. En outre, il est possible de détecter des interactions indirectes tant que les deux protéines candidat peut être amené suffisamment près par un troisième partenaire. Comme toute technologie, BiFC a ses limite...

<table><tbody><tr><td>Acétosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Seringue tuberculine de 1 mL à embout lisse</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire compatible (bifc) système

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Nous avons développé une technique BiFC pour tester l&#39;interaction entre deux protéines in vivo. Ceci est accompli par fractionnement d&#39;une protéine fluorescente jaune (YFP) en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d&#39;un gène d&#39;intérêt. Ces constructions peuvent alors être co-transformé en Nicotiana benthamiana par transformation Agrobacterium, permettant l&#39;expression de protéines de fusion de transit. La reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l&#39;enquête 1-7. Pour tester et valider les interactions protéine-protéine, BiFC peut être utilisé avec deux hybrides de levure (Y2H) dosage. Ceci peut détecter les interactions indirectes qui peuvent être négligés dans le Y2H. La technologie Gateway est une plate-forme universelle qui permet aux chercheurs de faire la navette le gène d&#39;intérêt (GOI) en tant qu&#39;expression de nombreux systèmes et l&#39;analyse fonctionnelle que 8,9 possible. Tant l&#39;orientation et de cadre de lecture peut être maintenue sans l&#39;aide d&#39;enzymes de restriction ou la ligature de rendre l&#39;expression prêts clones. En conséquence, on peut éliminer toutes les étapes de re-séquençage à assurer des résultats constants au cours des expériences. Nous avons créé une série de vecteurs et de la passerelle BiFC Y2H compatibles qui permettent aux chercheurs facile à utiliser des outils pour effectuer des essais et des deux BiFC Y2H 10. Ici, nous démontrons la facilité d&#39;utilisation de notre système BiFC de tester les interactions entre protéines dans N. benthamiana.

Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d&#39;un gène d&#39;intérêt par l&#39;intermédiaire du système de passerelle, permettant l&#39;expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l&#39;enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Nous avons développé une technique de BiFC pour tester l'interaction entre deux protéines in vivo. Ceci est réalisé en scindant une protéine fluorescente jaune...

Pour tester l'interaction entre deux protéines, les deux gènes d'intérêt doivent être clonés dans nos vecteurs BF et en utilisant la technique d'insertion Gateway. Ces constructions sont transformées dans la souche bactérienne Agrobacterium GV3101. Les cultures bactériennes GV3101 contenant chaque construction seront mélangées et co-infiltrées dans les feuilles.Si les deux protéines candidates interagissent l'une avec l'autre, le signal YFP peut être observé à l'aide d'un microscope à fluorescence. Le but principal de la technique BFC est de tester l'interaction entre deux protéines. In vivo, nous avons créé une série de vecteurs BFC et de type double hybride compatibles avec le système Gateway, qui fournissent aux chercheurs des outils faciles à utiliser pour réaliser des tests double hybride BFC et ISTO.Dans cette vidéo, nous allons démontrer la facilité d'utilisation de notre système BFC. Pour tester les interactions entre protéines d'une manière indépendante du système d'expression, vous devez d'abord préparer la culture bactérienne GV3101.Vous devez prélever une colonie unique à partir de votre boîte et l'ensemencer dans cinq millilitres de milieu YEB contenant les antibiotiqu

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Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire...

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Les interactions protéine-protéine sont visualisées dans les cellules avec une résolution spatiale nanométrique en combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM). L’utilisation de BiFC-PALM pour l’imagerie des interactions Ras-Raf dans les cellules U2OS permet de visualiser le regroupement à l’échelle nanométrique et la diffusion de complexes Ras-Raf individuels.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Nous présentons ici une méthode pour visualiser la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques à l’aide de protéines marquées par fluorescence par le test FRET-FLIM basé sur BiFC. Cette méthode est précieuse pour étudier les complexes d’interaction protéine-protéine in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour réaliser l’expérience de marquage de proximité (PL) chez le concombre (Cucumis sativus L.) en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2)-AirID comme modèle. La méthode décrit la construction d’un vecteur, la transformation d’une construction par agroinfiltration, l’infiltration de biotine, l’extraction de protéines et la purification de protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité.

Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

Découvrez la technique BiFC pour visualiser les interactions protéiques en temps réel dans les plantes. Ce protocole utilise le clonage Gateway et la transformation par Agrobacterium pour reconstituer le signal YFP.

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