Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire pour isoler deux protéines en interaction

Pour détecter et isoler une paire de protéines spécifiques en interaction à l’aide de la purification par affinité de complémentation bimoléculaire, ajoutez une paire de plasmides de complémentation de fluorescence bimoléculaire et d’agent de transfection dans une plaque de culture contenant des cellules de mammifères.

Un plasmide code pour une protéine en interaction – la protéine d’appât – fusionnée à un fragment de protéine fluorescente rapporteur. L’autre plasmide code pour l’autre protéine de liaison – la protéine de proie – fusionnée au fragment complémentaire de la protéine fluorescente.

couver. L’agent de transfection facilite l’absorption cellulaire plasmidique. Les cellules transfectées avec succès expriment des protéines localisées dans la membrane cellulaire.

Les interactions entre les protéines appâts-proies rapprochent les fragments de protéines fluorescentes. Cela provoque la fusion et le repliement des fragments, formant la protéine fluorescente fonctionnelle, dont la fluorescence peut être visualisée au microscope à fluorescence.

Remplacez le milieu par un tampon de lyse contenant un détergent non ionique pour perturber les membranes cellulaires, libérant ainsi les protéines de fusion. Prélevez le lysat cellulaire dans un tube. Centrifugeuse.

Transférez le surnageant contenant la protéine de fusion dans un tube frais. Ajoutez des billes d’agarose conjuguées à l’anticorps à domaine unique ciblant la protéine fluorescente, le nanocorps, qui reconnaît et se lie à un épitope tridimensionnel sur la protéine fluorescente repliée.

centrifugeuse. Remettre en suspension les billes d’agarose liées aux protéines de fusion dans le tampon. Chaleur pour dissocier les protéines de fusion des billes d’agarose. Effectuer SDS-PAGE pour séparer les protéines individuelles, suivi d’un transfert western avec des anticorps spécifiques des fragments de protéine fluorescente.

Seules les protéines en interaction marquées avec des fragments fluorescents sont détectées, confirmant leur isolement.

Tout d’abord, ensemencez HEK293T cellules dans des boîtes de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM. Ensuite, diluez 2,5 microgrammes de chaque vecteur de complémentation de fluorescence bimoléculaire dans 500 microlitres de tampon de transfection.

Ajoutez 10 microlitres de réactif de transfection et agitez le mélange pendant 10 secondes. Ensuite, centrifugez brièvement les échantillons et incubez-les à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez le mélange de transfection d’ADN goutte à goutte dans le plat. Ensuite, incubez les échantillons pendant 8 à 24 heures.

Préparez le tampon de lyse cellulaire et le tampon de lyse cellulaire complété comme indiqué dans le protocole texte. Ensuite, lavez deux fois les cellules avec du PBS glacé. Aspirez le PBS et ajoutez 1 millilitre de tampon de lyse cellulaire complété par de la glace.

Ensuite, placez le plat sur de la glace et incubez pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pour retirer les cellules et les transférer dans un tube de microcentrifugation réfrigéré. Centrifugez le tube à 18 000 fois la gravité pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, transférez le surnageant transparent dans un tube de microcentrifugation frais.

Lavez un volume approprié de billes d’agarose dans 1 millilitre de PBS. Ensuite, centrifugez les billes à 300 fois la gravité et retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de billes d’agarose à chaque échantillon et incubez à 4 degrés Celsius pendant deux heures avec une rotation de bout en bout.

Centrifugez les billes à 300 fois la gravité et lavez-les trois fois dans un tampon de lyse cellulaire. Ensuite, mettez en suspension les billes lavées dans 50 microlitres de tampon d’échantillon dilué. Enfin, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant deux à trois minutes.