Name: Bimoléculaire complémentation de fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) pour visualiser les interactions protéine-protéine et leur localisation subcellulaire dans des cellules vivantes. Cette méthode permet de détecter des interactions faibles ou transitoires avec une résolution spatiale précise.

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Le ITSN, PI3K-C2β, et les vecteurs de contrôle utilisés dans ce protocole sont disponibles auprès des auteurs sur demande, pour des fins non commerciales seulement. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Chang-Hu Deng a bien voulu fournir des conseils et des réactifs utilisés dans l&#39;établissement du protocole de BiFC dans le laboratoire O&#39;Bryan. KAW a été soutenu par un financement de la Fondation Lejeune-Jérôme. Le travail dans le laboratoire O&#39;Bryan est soutenu par des subventions du NIH (HL090651), le DOD (PR080428), la Fondation Saint-Baldrick, et la Fondation Jérôme Lejeune.

A. BiFC étalonnage <ol><li> Choisissez un fluorophore. Il ya des fluorophores multiples, tels que la YFP et Vénus, qui fonctionnent bien comme des partenaires de fusion BiFC (tableau 1). Extrémités amino-et carboxy-terminale de Vénus sont en mesure de former un complexe à 37 ° C, tandis que les fragments YFP BiFC nécessitent une pré-incubation à 30 ° C afin de faciliter la formation de deux fluorophores. Cette incubation à basse température peut modifier certains processus cellulaires et devraient être pris en compte lors du choix des fragments. Vecteurs pour la fusion de Vénus à l'extrémité carboxy-terminale de protéines sont disponibles à partir Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 et pBiFC-VC155) avec constructions supplémentaires pour servir de témoins, par exemple, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> et pBiFC-bFosVC155 2. Vecteurs supplémentaires, y compris amino-terminale vecteurs Vénus (pFLAG-VN173 et Pha-VC155), sont disponibles sur le site suivant: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ HU1 /</a> . </li><li> Tag de la protéine d'intérêt. Les fragments BiFC sont fusionnées à l'extrémité amino-ou carboxy-terminale des protéines candidates. Certaines protéines ne peuvent pas permettre de marquage à chaque extrémité en raison de la perturbation de la fonction des protéines. Par exemple, de nombreux membres de la superfamille des Ras GTPases sont des lipides modifiés à l'extrémité carboxy-terminale de fixation empêchant ainsi des fragments BiFC à cette fin. Ainsi, il est important d'avoir une certaine idée de la façon dont l'attachement des fragments BiFC peut affecter la fonction des protéines d'intérêt. Si on voit mal comment le marquage d'une protéine aura une incidence sur ses combinaisons multiples fonctions doivent être testés. En plus de le fragment BiFC, un linker peptidique peut être inclus pour augmenter la flexibilité entre le fluorophore fragmenté et les protéines candidates. Alors que les sites de clonage multiple (MCS) dans les vecteurs BiFC encoder courte s'étend des acides aminés qui peuvent fournir suffisamment de souplesse, le RSIAT, KQKVMNH et linkers RPACKIPNDLKQKVMNH ont été utilisés avec succès dans des expériences BiFC 3,9 </li><li> Déterminer les conditions de transfection. Avant de tester des mutants multiples, un peu d'expériences de contrôle doit être effectué. Les deux premières combinaisons BiFC qui devrait être tenté sont deux protéines de type sauvage qui sont connus pour interagir et d'un type sauvage et mutantes qui n'ont pas d'interaction. L'utilisation de ces deux combinaisons, différentes quantités d'ADN et des temps de transfection doivent être testés afin de déterminer les conditions optimales pour la détection d'un signal BiFC pour les protéines candidates. Nous vous suggérons de tester 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug de chaque construction BiFC pour un seul puits d'un plat à 6 puits. Le jour après la transfection des cellules suivre par microscopie à fluorescence pour déterminer le temps optimal pour le développement de signal. Le <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> et pBiFC-bFosVC155 deux constructions sont utiles pour les contrôles positifs BiFC et sont disponibles à partir Addgene (voir ci-dessus). En outre, l'analyse par Western blot doit être effectuée pour confirmer l'expression égale des constructions. Les conditions devraient être choisis de telle sorte que un signal fluorescent est observée entre les deux protéines de type sauvage, mais peu ou pas de signal est observé entre le type sauvage et de protéines mutantes. Enfin, il est préférable de garder l'expression des protéines aussi bas que possible afin d'éviter toute interaction non-spécifique. </li><li> Déterminer si l'ajout de fragments BiFC modifie la localisation des protéines d'intérêt. Chaque construction BiFC contient soit une HA ou tag épitope FLAG. Immunocoloration transefected cellules à la fois pour l'HA ou tag épitope FLAG ainsi aussi bien la protéine endogène (si possible) afin de déterminer si la balise BiFC affecte la localisation des protéines d'intérêt. </li></ol> Placage B. Transfection de cellules <ol><li> Les cellules COS (1.3x10 5) sont plaqués sur un seul de chaque fond de verre Matek plaque et deux puits d'une plaque à 6 puits par échantillon. Laisser les cellules sédimenter une nuit à 37 ° C. Types de cellules de remplacement qui sont plus pertinents pour les protéines d'intérêt candidat peut également être utilisé. </li><li> Préparer ADN pour la transfection. Nous utilisent généralement Lipofectamine (Invitrogen) pour transfections COS. Toutefois, d'autres réactifs peuvent être plus appropriés pour la lignée cellulaire d'intérêt. Depuis le mélange de transfection sera réparti entre un plat à fond de verre et de deux puits d'une plaque de 6 puits, utiliser la quantité appropriée de l'ADN pour rendre compte de cette division. Diluer l'ADN dans des 250uL sans sérum (SF) DMEM. Ajouter PCP à 1 / 5 du montant du total des ADN BiFC comme un contrôle de la transfection. Pour la quantification BiFC, seules les cellules qui sont positifs pour la PCP seront analysés pour déterminer la présence d'un signal BiFC. Notez que les spectres de la PCP se chevauchent avec certains des paires BiFC dans le tableau 1, par conséquent un contrôle de transfection alternatifpeut-être nécessaire. Diluer Lipofectamine dans 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug de l'ADN). Mélanger l'ADN et des dilutions Lipofectamine. Incuber à température ambiante pendant 20min. Note: La lipofectamine: ratio de l'ADN peut varier selon le type de cellule. Utilisez la méthode appropriée pour la transfection de la lignée cellulaire d'intérêt. </li><li> Rincer les cellules chaudes 2x avec SF DMEM. Ajouter 2 ml de DMEM SF à chaque plaque à fond de verre ou bien d'un plat à 6 puits. </li><li> Fendez chaque mélange de transfection uniformément entre un plat à fond de verre et de deux puits d'un plat à 6 puits. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5h. </li><li> Retirez le support de transfection et la remplacer par des médias complète (DMEM 10% FBS). </li><li> Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C. La longueur de la transfection après incubation varie selon les niveaux d'expression des protéines d'intérêt. Une incubation prolongée peut entraîner la non-spécifiques d'interaction donc cette étape devra être déterminée empiriquement. </li></ol> C. Préparation des cellules pour l'imagerie <ol><li> Les cellules sont d'abord examinés sous un microscope à épifluorescence pour s'assurer que le contrôle positif est fluorescent. Si non, il peut être nécessaire de laisser le temps cellules supplémentaires à 37 ° C jusqu'à ce que le signal est observé. </li><li> Rincer les cellules 3x avec PBS (pH 7,4). Pour les cellules dans le plat à fond de verre ajoutent paraformaldéhyde à 2% (pH 7,4). Fixer les cellules pendant 10 minutes sur la glace. Rincer les cellules 3x avec PBS (pH 7,4). Cellules Conserver à 4 ° C couvert de 1ml de PBS (pH 7,4). Les cellules n'ont pas à être fixé pour l'imagerie, mais une fois que les fragments BiFC réformer un fluorophore intact, il est irréversible empêchant ainsi l'analyse des interactions dynamiques 3. Aussi, gardez à l'esprit que les cellules non fixée continuera à développer de signal. Lyse des cellules dans le plat à 6 puits et se préparer pour les lysats analyse Western blot. Il est important que toutes les cellules sont préparées en même temps, de sorte que les cellules lysées sont représentatifs des cellules imagée. </li></ol> D. Cellules Imaging <ol><li> L'intensité de fluorescence sera calculé par cellule. Soyez sûr de cellules d'image individuelle. </li><li> PCP a été incluse comme un contrôle transfection et seulement PCP cellules positives sont sélectionnés pour l'analyse des signaux BiFC. Nous faisons l'hypothèse que si la cellule est transfectée avec PCP, il est également transfectées avec les constructions BiFC. Cette approche garantit que les cellules imagé qui manquent un signal BiFC sont négatifs en raison d'un manque d'interaction entre les protéines d'intérêt et non en raison de l'absence d'un ou de deux vecteurs d'expression BiFC dans cette cellule. </li><li> Nous utilisons un Zeiss LSM 510 microscope confocal pour l'imagerie cellulaire. Lors de l'utilisation de ce microscope, il est important de garder le zoom, sténopé, gain du détecteur, un amplificateur de décalage, taille d'image, vitesse de balayage, la moyenne de numérisation et de laser de puissance constante. Lorsque vous utilisez un système d'imagerie, il est important de garder les paramètres de constante, de sorte que la fluorescence est comparable entre les échantillons. Aussi, lors de la quantification de fluorescence, il est important que les pixels ne sont pas saturés. </li></ol> E. La quantification de fluorescence <ol><li> Fluorescence peuvent être quantifiés en utilisant n'importe quel logiciel d'imagerie. Nous utilisons ImageJ qui est disponible gratuitement à partir du NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Ouvrez les fichiers image dans ImageJ. Aller à la Mensurations AnalyzeSet. Cochez les cases pour la région et de moyenne valeur de gris dans la boîte de mesures. </li><li> Utiliser l'outil "sélection de la main libre», tracez un contour autour du bord de la cellule entière dans le canal PCP. </li><li> Laissant ce schéma en place, passage à la chaîne YFP. Aller à la AnalyzeMeasure. La valeur moyenne Gray est la somme des valeurs de gris de l'ensemble des pixels de la sélection, divisé par le nombre de pixel (ie, l'intensité moyenne de fluorescence par zone de la cellule). </li><li> Pour chaque image, dessinez un cercle dans le canal de la YFP dans une zone qui ne contient pas une cellule. Prendre une mesure pour ce domaine comme arrière-plan. Soustraire le fond de chaque image. </li><li> Moyenne de la valeur de gris moyen, moins le fond de toutes les cellules dans un échantillon imagé. Ce sera l'intensité moyenne de fluorescence pour une population de cellules. Nous suggérons d'environ 60 cellules sur trois expériences être quantifiés. </li></ol> F. Résultats du représentant: Notre laboratoire se concentre sur les protéines d'échafaudage multi-domaine, intersectine (ITSN) qui interagit avec de nombreuses protéines de réguler de multiples voies de signalisation biochimiques et 10,11,12,13,14. ITSN contient deux Eps15 homologie (EH) domaines, une région coiled-enroulé, et cinq d'homologie Src 3 (SH3) domaines. Le plus isoforme de ITSN contient également une homologie Dbl (DH) et pleckstrine homologie (PH) domaines qui agissent de concert comme un facteur d'échange nucléotidique guanine pour Cdc42 15. Cette structure modulaire favorise protéines: les interactions entre protéines et rend ITSN un candidat idéal pour des expériences BiFC. La localisation subcellulaire des ITSN peut modifier ses partenaires de liaison et donc modifier les voies régies par ITSN (unpublished données). Récemment, notre laboratoire a démontré que la survie neuronale ITSN régule grâce à une réglementation d'un roman de la PI3K de classe II, la PI3K-C2β 11. Les amino-terminal pro-riches domaine de la PI3K-C2β contient deux sites de liaison pour ITSN de domaines SH3. L'utilisation de co-immunoprécipitation avec ITSN et les mutants de troncature PI3K-C2β nous avons démontré que SH3A ITSN et domaines SH3C interagir avec la région amino-terminale de la voie PI3K-C2β. Ensuite, nous avons utilisé BiFC de visualiser la localisation subcellulaire de ce complexe. ITSN a été fusionnée à la terminaison amino de Vénus (pFLAG-VN173) et PI3K-C2β construit fusionnés à l'extrémité carboxy terminale de Vénus (PHA-VC155). Comme autre contrôle négatif, un peptide non spécifique a été fusionnée à la PHA-VC155. VN-ITSN et VC-PI3K-C2β formé un complexe avec une distribution BiFC ponctuent (figure 2A, panneaux supérieurs). Des mutations dans le domaine pro-riches de PI3K-C2β qui perturbent la co-précipitation des ITSN et PI3K-C2β diminué le signal BiFC (figure 2A, panneaux inférieurs) 11. Cette différence de signal entre les BiFC ITSN et les deux protéines PI3K-C2β n'était pas due à des différences dans l'expression des protéines (figure 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> . Figure 1 Dans BiFC, un fluorophore (dans ce cas de Vénus) est divisé en aminés (VN) - et carboxy (VC)-terminales. Ces extrémités sont soudées à deux protéines d'intérêt. Lorsque les deux protéines interagissent, les fragments VN et VC réassocier résultant de la reconstitution du fluorophore et la fluorescence sur les sites d'interaction. BiFC est un exemple précis du dosage de complémentation protéique fragment (PCA) utilisé pour mesurer la protéine: les interactions entre protéines 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. ITSN et PI3K-C2β former un complexe BiFC. A. VN-taggés ITSN a été co-transfectées avec VC-taggés PI3K-C3β WT ou un domaine riche en proline mutant (PI3K-C2β-PA). ITSN et WT PI3K-C2β former un complexe (vert). PCP (rouge) a été utilisé comme un contrôle de transfection B. Un Western blot a été réalisée pour démontrer l'expression égale des constructions. Le VC-constructions sont marqués HA marqués. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Il existe de multiples vecteurs qui sont compatibles avec BiFC. YN155: 1-155aa du YFP; YC155: 155-238aa du YFP; YN173: 1-172aa du YFP; YC173, 173-238aa du YFP; VN155: 1-154aa de Vénus; VC155: 155-238 de Vénus; VN173: 1-172aa de Vénus; VC173: 173-238aa de Vénus; CN155 1-154aa du PCP; CC155 155-238aa du PCP, GN173: 1-172aa de la GFP, CitN155: 1-155aa de Citrine, CitC155: 155-238aa des Citrine, CitN173: 1-172aa de Citrine, CitC173: 173-238aa de Citrine, CerN173: 1-172aa de Cerulean 2,3,9.

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</ol>

BiFC est une excellente méthode pour visualiser des protéines: les interactions entre protéines dans des cellules entières et de déterminer la localisation subcellulaire de ces complexes. Les avantages de BiFC sont que seulement les protéines en interaction sont fluorescentes, les interactions transitoires sont stabilisées, et le post-traitement des données d&#39;imagerie est minime. Deux inconvénients de cette méthode sont le temps de maturation pour le fluorophore et l&#39;irréversibilité des complexes fluorophore. Da...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond en verre avec puits microscopiques</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

bimoléculaire complémentation de fluorescence

Bimolecular Fluorescence Complementation

Définition de la distribution subcellulaire des complexes de signalisation est impératif de comprendre la sortie de ce complexe. Les méthodes conventionnelles telles que immunoprécipitation ne fournissent pas d&#39;informations sur la localisation spatiale des complexes. En revanche, BiFC surveille l&#39;interaction et la compartimentation subcellulaire des complexes protéiques. Dans cette méthode, une protéine fluororescent est divisé en amino-et carboxy-terminale non fluorescent fragments qui sont ensuite fusionnées à deux protéines d&#39;intérêt. Interaction des résultats des protéines dans la reconstitution du fluorophore (figure 1) 1,2. Une limitation de BiFC n&#39;est qu&#39;une fois que le fluorophore fragmenté est reconstitué le complexe est irréversible 3. Cette limitation est avantageuse dans la détection des interactions transitoires ou faible, mais s&#39;oppose à une analyse cinétique de la dynamique complexe. Une mise en garde supplémentaire est que le flourophore reconstituée nécessite 30min à mûrir et à fluorescence, à nouveau obstacle à l&#39;observation des interactions en temps réel 4. BiFC est un exemple précis du dosage de complémentation protéique fragment (PCA) qui emploie des protéines telles que le vert journaliste de variants de la protéine fluorescente (BiFC), la dihydrofolate réductase, b-lactamase, et la luciférase pour mesurer des protéines: les interactions entre protéines 5,6. Les méthodes alternatives à l&#39;étude des protéines: les interactions entre protéines dans les cellules comprennent la fluorescence de co-localisation et de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 7. Pour la co-localisation, deux protéines sont individuellement marqués soit directement avec un fluorophore ou par immunofluorescence indirecte. Cependant, cette approche conduit à fond élevé de non-interaction des protéines ce qui rend difficile d&#39;interpréter la co-localisation des données. En outre, en raison de la limite de résolution de la microscopie confocale, deux protéines peuvent apparaître co-localisées, sans nécessairement interagir. Avec BiFC, la fluorescence n&#39;est observée lorsque les deux protéines d&#39;intérêt interagissent. FRET est une autre excellente méthode pour étudier les protéines: les interactions entre protéines, mais peut être techniquement difficile. FRET expériences exigent des donneurs et accepteurs d&#39;être d&#39;une luminosité similaire et la stœchiométrie dans la cellule. En outre, on doit tenir compte de saigner à travers les bailleurs de fonds dans le canal de l&#39;accepteur et vice versa. Contrairement FRET, BiFC a peu de fond de fluorescence, de post-traitement peu de données d&#39;image, ne nécessite pas de surexpression élevé, et peut détecter des interactions faibles ou transitoires. Transfert d&#39;énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode similaire à l&#39;exception de FRET le donateur est une enzyme (luciférase, par exemple) qui catalyse un substrat de devenir bioluminescents donc passionnante un accepteur. BRET manque les problèmes techniques de saigner à travers et la fluorescence de fond élevé, mais n&#39;a pas la capacité de fournir des informations spatiales en raison du manque de substrat à la localisation des compartiments spécifiques 8. Globalement, BiFC est une excellente méthode pour visualiser la localisation subcellulaire des complexes de protéines afin de mieux comprendre la signalisation compartimentée.

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Définir la distribution subcellulaire des complexes de signalisation est impératif pour comprendre le signal produit par ce complexe. Les méthodes conventionnelles telles que...

Cette expérience vise à déterminer si deux protéines interagissent dans les cellules et à préciser certaines caractéristiques des sites de cette interaction. Tout d'abord, les cellules sont transfectées avec des constructions d'expression codant pour les deux protéines d'intérêt, dont l'une est fusionnée à l'extrémité terminale d'une protéine fluorescente fragmentée et l'autre à l'extrémité C complémentaire de la même protéine fluorescente fragmentée. Après avoir permis aux cellules transfectées de développer un signal fluorescent en culture, les complexes protéiques sont visualisés par imagerie et immunoblotting.Ensuite, les images recueillies sont exportées vers un logiciel d'analyse d'images tel qu'Image J afin de quantifier l'intensité moyenne de fluorescence par cellule. Dans une expérience contrôlée, les résultats de BIFC peuvent démontrer les interactions entre protéines ainsi que la localisation de ces complexes, comme les domaines SH3 de la protéine échafaudante intersectant et le domaine riche en proline de PI3KC2β. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la colocalisation, l'immunoprécipitation et le FRET est que la BIFC pe

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Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire...

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Cette vidéo décrit BiFC-PALM ― une combinaison de microscopie de localisation photoactivée et de complémentation de fluorescence bimoléculaire ― pour évaluer les interactions protéine-protéine. BiFC implique la fusion de deux fragments de protéines fluorescentes avec deux protéines d’intérêt en interaction. Lorsque les deux protéines interagissent, les fragments sont rapprochés, ce qui permet aux deux parties de se réunir et de reconstituer une protéine fluorescente fonctionnelle. La...

Microscopie de localisation photoactivée couplée à la fluorescence bimoléculaire

Dans cette vidéo, nous avons démontré la purification par affinité de complémentation bimoléculaire, BiCAP, pour détecter et isoler des dimères protéiques spécifiques à l’aide d’anticorps à domaine unique spécifiques à la conformation.

Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire pour isoler deux protéines en interaction

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

Les interactions protéine-protéine sont visualisées dans les cellules avec une résolution spatiale nanométrique en combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM). L’utilisation de BiFC-PALM pour l’imagerie des interactions Ras-Raf dans les cellules U2OS permet de visualiser le regroupement à l’échelle nanométrique et la diffusion de complexes Ras-Raf individuels.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Nous présentons ici une méthode pour visualiser la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques à l’aide de protéines marquées par fluorescence par le test FRET-FLIM basé sur BiFC. Cette méthode est précieuse pour étudier les complexes d’interaction protéine-protéine in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Découvrez la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) pour visualiser les interactions protéine-protéine et leur localisation subcellulaire dans des cellules vivantes. Cette méthode permet de détecter des interactions faibles ou transitoires avec une résolution spatiale précise.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

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