Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Cette expérience vise à définir si deux protéines interagissent dans les cellules et à délimiter les aspects des sites de cette interaction. Les premières cellules sont transfectées avec des constructions d’expression codant pour les deux protéines d’intérêt, dont l’une est fusionnée à l’extrémité terminale d’une protéine fluorescente fragmentée et l’autre fusionnée à l’extrémité C complémentaire de la protéine fluorescente fragmentée. Après avoir permis aux cellules transfectées de développer un signal fluorescent en culture, les complexes protéiques sont visualisés par imagerie et immuno-blot.

Ensuite, les images collectées sont exportées vers un logiciel d’imagerie tel que Image J Afin de quantifier l’intensité moyenne de fluorescence par cellule dans une expérience contrôlée, les résultats de BIFC peuvent démontrer les interactions protéiques et la localisation de ces complexes, comme les trois domaines SH de la protéine d’échafaudage qui se croisent et le domaine riche en pros de PI trois KC deux bêta. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la colocalisation, l’immunoprécipitation et l’inquiétude est que la BFC permet la localisation spatialisée d’interactions transitoires plus faibles dans la cellule. Et cette méthode ne nécessite pas de post-traitement d’images étendues comme on le voit avec fret.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la transduction du signal, telles que l’interaction des protéines OD X et Y, et si oui, quels sont les compartiments spécifiques auxquels ces complexes se localisent dans la cellule ? Généralement, les nouveaux venus dans cette méthode auront du mal parce qu’ils n’ont pas choisi la bonne configuration pour exprimer leur biopsie. Protéines d’intérêt marquées Commencez par sélectionner l’un des multiples fluorophores pour les protéines de fusion BIFC.

Considérez que les extrémités terminales aminées et carboxy de Vénus sont capables de former un complexe à 37 degrés Celsius tandis que les fragments Y-F-P-B-I-F-C nécessitent une pré-incubation à 30 degrés Celsius. Concevez des vecteurs d’expression pour l’ajout de marqueurs aux protéines d’intérêt en tenant compte de la façon dont l’attachement des fragments BIFC peut affecter la fonction des protéines d’intérêt. Par exemple, la famille des AR, les GTP a sont modifiés lipidiquement à l’extrémité carboxy et ne peuvent pas être marqués à cette extrémité sans perturber cette modification.

Effectuez toujours des expériences pilotes pour déterminer les conditions de transfection. Surveillez également les cellules par microscopie à fluorescence pour identifier un moment optimal pour le développement du signal. Effectuez ensuite une analyse des fleurs occidentales pour confirmer l’expression égale des constructions.

Il est important de noter qu’il faut procéder à une immunocoloration pour l’HA ou l’étiquette d’indicateur afin de vérifier que l’ajout des fragments BIFC ne modifie pas la localisation cellulaire des protéines d’intérêt pour chaque plaque d’échantillon. 1,3 fois 10 des cinq cellules provoquent chacune sur une plaque de matière à fond de verre et deux puits d’une plaque à six puits et permettent aux cellules de se déposer pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius le lendemain. Préparez les ADN pour la transfection par lipectomie ou autre méthode préférée.

Tout d’abord, diluez l’ADN dans 250 microlitres de DMEM sans sérum comme contrôle de transfection. Ajoutez CFP à un 50, la quantité totale de vos ADN BIFC. Diluez maintenant la lèvre dans 250 microlitres de DMEM sans sérum en utilisant 10 microlitres de lèvre pour un microgramme d’ADN.

Mélangez l’ADN et les dilutions des lèvres incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Rincez les cellules deux fois avec du DMEM chaud sans sérum. Ajoutez deux millilitres de DMEM sans sérum dans chaque plaque inférieure en verre ou puits d’un plat à six puits.

Ensuite, répartissez uniformément chaque mélange de transfection entre un plat à fond de verre et deux puits d’un six. Bien plaquer incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. Enfin, retirez le support de transfection et remplacez-le par un support DMEM plus 10 %FBS complet.

Incuber les cellules pendant le temps déterminé dans les expériences pilotes afin d’obtenir les niveaux d’expression nécessaires des protéines d’intérêt. Examinez les cellules transfectées à l’aide d’un microscope épi-fluorescent pour vous assurer que le témoin positif est fluorescent. Rincez les cellules trois fois avec du PBS pour l’imagerie de cellules vivantes.

Placez les cellules dans un support sans matrices indicatrices. Pour l’imagerie de cellules fixes. Ajoutez 2 % de para formaldéhyde et placez sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, rincez les cellules trois fois avec du PBS maintenant recouvert d’un millilitre de PBS et stockez-les dans l’obscurité à quatre degrés Celsius, puis placez immédiatement les cellules dans le plat à six puits. Pour les analyses par Western blot, il est important que toutes les cellules soient préparées en même temps afin que les cellules lys soient représentatives des cellules image. Effectuez un western blot pour vous assurer que les protéines de marquage sont exprimées à des niveaux équivalents.

Lors de l’imagerie de cellules avec un microscope confocal, il est important de maintenir des paramètres constants tout au long de l’expérience afin que la fluorescence soit comparable entre les échantillons. Assurez-vous d’imager les cellules individuelles où les pixels ne sont pas saturés. Étant donné que la CFP a été incluse comme contrôle de transfection, sélectionnez uniquement des cellules positives CFP pour l’analyse des signaux BIFC.

Quantifiez la fluorescence à l’aide d’un logiciel d’imagerie tel que image J.Ouvrez les fichiers d’image dans Image J.Go pour analyser les mesures définies. Cochez les cases de la zone et de la valeur de gris moyenne dans la zone des mesures. Notez que dans cet exemple, les images veineuses ont été pseudo colorées en vert et les images CFP, pseudo colorées en rouge.

À l’aide de l’outil de sélection à main levée, tracez un contour autour du bord de la cellule entière dans le canal CFP en laissant ce contour en place. Passez au canal YFP. Allez analyser, mesurer la valeur moyenne du gris reflète l’intensité moyenne de fluorescence par cellule pour chaque image.

Tracez un cercle dans le canal YFP dans une zone qui ne contient pas de cellule. Prenez une mesure pour cette zone comme arrière-plan. Soustrayez l’arrière-plan de chaque image.

Enfin, pour calculer l’intensité moyenne de fluorescence pour une population de cellules, faites la moyenne de la valeur de grade moins le bruit de fond pour toutes les cellules imagées dans un échantillon. Idéalement, quantifiez 60 cellules sur trois expériences. La protéine d’échafaudage multi-domaines qui se croise régule la survie neuronale par la régulation d’une nouvelle PI de classe deux, trois kinase, PI trois, KC, deux bêta qui se croisent, SH, trois domaines interagissent avec la région amino terminale riche en proline de PI trois, KC deux, la transfection bêta de VN marquée en intersection avec VC marquée PI trois, KC deux bêta, entraîne un signal fluorescent dans le canal YFP, qui est pseudo coloré en vert indiquant une formation complexe.

CFP pseudo coloré ici en rouge est utilisé comme contrôle pour marquer les mutations des cellules transfectées dans le domaine riche en proline de PI trois KC deux bêta, qui perturbent la co-précipitation de l’intersection et PI trois KC deux bêta diminuent le signal BIFC. Cette différence de signal BIFC n’est pas due à des différences d’expression du type sauvage et des protéines PA PI trois K Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est bien faite. Lors de l’exécution de cette procédure, vous devez vous rappeler d’exécuter les contrôles appropriés et de vérifier l’expression des protéines pour vous assurer que les différences dans le signal BC sont dues à des différences de formation complexe et non à l’expression suivant cette procédure.

D’autres techniques comme le plasma de surface sur les résidents peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que : quelles sont les différentes affinités de ces complexes les uns pour les autres ?