Mesure de la force lors de la contraction d'évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la génération de force lors d’une contraction maximale du poisson zèbre, de la larve, du muscle du tronc. Ceci est accompli en faisant d’abord des boucles de suture qui seront utilisées pour maintenir les larves en place pendant les mesures de force. Ensuite, les larves anesthésiées sont positionnées à l’intérieur de la chambre expérimentale.

Une fois en place, la force est enregistrée lors d’une contraction maximale de la contraction. La dernière étape consiste à mesurer les dimensions de la musculature du tronc afin que la force maximale puisse être normalisée en fonction de la section transversale du muscle. En fin de compte, la mesure de la génération de force pendant la contraction est utilisée pour montrer les changements dans la fonction musculaire et la santé musculaire globale.

Bien que nous démontrions cette méthode en utilisant des larves de poisson-zèbre de type sauvage, elle peut également être utilisée avec des larves génétiquement modifiées ou avec des larves traitées avec des médicaments ou des toxiques. La méthode peut ensuite être utilisée pour caractériser des modèles de maladies musculaires et évaluer des traitements ou pour étudier le développement musculaire, les blessures ou la toxicité chimique. La première étape consiste à préparer les anses de suture qui serviront à maintenir les larves en place.

Lors des tests de force, utilisez des pinces pour séparer la suture non stérile en trois brins. Une fois séparés, commencez à faire un double nœud plat dans l’un des brins, mais arrêtez-vous avant de serrer complètement le nœud pour faire une petite boucle. Au lieu de cela, pour terminer la boucle, utilisez des ciseaux pour couper l’excès de suture des queues.

Placez la boucle sur le côté autocollant d’un post-it pour une utilisation ultérieure. Faites deux boucles de suture pour chaque larve qui sera testée. Tout d’abord, placez l’appareil de test sur la platine d’un stéréomicroscope.

Ensuite, connectez les câbles du capteur de force et du contrôleur de longueur à l’appareil d’essai. Allumez le capteur de force et le contrôleur de longueur et basculez l’interrupteur situé à l’avant du contrôleur de longueur. Cela rend la longueur du tube du contrôleur pontée avec un transfert jetable. Pipette.

Remplissez la chambre d’expérimentation avec la solution d’essai. Utilisez une pince pour saisir une boucle de suture par l’une des queues comme préhension. La boucle sur la partie incurvée peut plier la suture et la faire casser lors des étapes suivantes.

Accrochez une boucle sur le tube du transducteur de force et une autre sur le contrôleur de longueur Avec une pipette de transfert jetable, transférez une larve de poisson-zèbre dans une petite boîte de Pétri remplie de solution de test. Une fois que l’anesthésique a fait effet, poussez doucement la queue pour vérifier qu’il y a un manque de toucher évoqué la nage. Ensuite, utilisez une pipette en verre pour transférer les larves dans la chambre d’expérimentation à l’aide d’une pince.

Guidez doucement la partie antérieure de la larve à travers l’anse de suture sur le tube du transducteur de force, en saisissant les deux queues de l’anse de suture. Tirez-les simultanément pour resserrer la boucle postérieure au sac de chêne ou à la vessie natatoire avec une pince. Tenez une queue de suture et tirez, ce qui fait pivoter les larves à 90 degrés autour du tube jusqu’à ce que le côté latéral de la larve soit tourné vers le haut.

À l’aide du dispositif de positionnement X, Y, Z fixé au contrôleur de longueur, déplacez le tube du contrôleur de longueur le long de l’axe des x et sous le tronc et la queue des larves. Laissez de l’espace entre les extrémités du tube de commande de longueur et le tube du capteur de force. Ensuite, guidez la boucle de suture sur la queue des larves et serrez la boucle de suture.

Comme démontré précédemment, vous devrez peut-être faire pivoter la partie postérieure des larves de manière à ce que le côté latéral soit orienté vers le haut. Une fois en place, coupez les queues de la boucle de suture. Utilisez les dispositifs de positionnement XY, Z pour abaisser lentement les tubes jusqu’à ce qu’ils touchent juste le fond de la chambre.

Soulevez ensuite les larves à une distance appropriée du fond de la chambre. Celui-ci doit se trouver à la distance de travail d’un objectif de microscope inversé utilisé ultérieurement. Enfin, ajustez la longueur du tube du contrôleur pour aligner l’axe long de la larve avec l’axe long du tube du transducteur de force.

Pour commencer, déplacez l’appareil de test sur la platine d’un microscope inversé. Ensuite, connectez le circulateur à bain-marie, le thermomètre et le contrôleur de température à l’appareil de test. Allumez les composants nécessaires et ajustez le réglage du régulateur de température à la valeur souhaitée.

Connectez les câbles du stimulateur à l’appareil de test. Mettez le stimulateur sous tension, mais ne stimulez pas les larves à ce stade. Pour vérifier que les larves sont parallèles au fond de la chambre, regardez la partie des larves entre les extrémités des tubes.

S’ils sont parallèles, les deux extrémités des larves seront mises au point si nécessaire. Ajustez le tube du transducteur de force jusqu’à ce que les deux extrémités soient nettes et que la larve soit parallèle. Activez le système de longueur de sarcomère vidéo et faites pivoter la caméra vidéo de manière à ce que les stries soient parallèles aux côtés de l’image vidéo.

L’espacement des stries est utilisé comme indicateur de la longueur du sarcomère. Ajustez le microscope pour qu’il se concentre sur les fibres périphériques et notez la longueur de sarcomère indiquée. Si nécessaire, ajustez le contrôleur de longueur pour raccourcir les larves jusqu’à ce que la longueur du sarcomère soit moins qu’optimale pour optimiser la force de contraction.

Tout d’abord, réglez le courant de sortie sur le stimulateur à faible amplitude, puis programmez un logiciel spécialisé pour délivrer des impulsions de courant d’une durée de 0,2 milliseconde. Délivrez la première impulsion et utilisez l’oscilloscope pour mesurer la force de contraction maximale.

Augmentez le courant par incréments de 50 milliampères et mesurez la force de contraction maximale à chaque nouveau niveau de courant. Attendez 30 secondes entre les contractions pour éviter la fatigue lorsque le courant de stimulation augmente. La force de contraction maximale augmente généralement jusqu’à un maximum, puis diminue progressivement le courant auquel la larve se produit.

La force la plus importante est le courant de stimulation optimal une fois identifié, réglez l’amplitude du courant sur le courant de stimulation optimal et ajustez la longueur des larves afin de provoquer une force de contraction maximale. Enfin, suscitez une contraction des muscles larvaires. Utilisez l’oscilloscope pour enregistrer la réponse de la force et sauvegarder l’enregistrement pour une analyse ultérieure.

Pour mesurer les dimensions de la musculature, rapprochez l’appareil de test du stéréomicroscope. À l’aide de l’échelle IP, mesurez la hauteur de la musculature vue de côté. Prenez les mesures à un point de repère anatomique.

Par exemple, l’ouverture urogénitale est marquée ici en rouge. Ensuite, en prenant soin de ne pas modifier la longueur des larves. Faites pivoter les larves de 90 degrés à l’aide des queues en boucle de suture afin de voir les larves depuis le bas.

Mesurez la largeur de la musculature vue du bas. Enfin, coupez les boucles de suture avec une micro lame pour libérer les larves de l’équipement de test chez les larves de poisson-zèbre sauvage en bonne santé, les fibres musculaires doivent être parallèles les unes aux autres sans grands espaces entre elles et avoir des stries évidentes Les larves de poisson-zèbre de type sauvage qui ne présentent pas ces caractéristiques ou avec des dommages évidents tels que des fibres détachées comme on le voit ici doivent être jetées ici. La force de contraction maximale en fonction du courant de stimulation est tracée pour une seule larve de poisson-zèbre.

Le courant de stimulation optimal est généralement compris entre 400 et 600 milliampères. Une réponse de force représentative recueillie lors d’une contraction maximale d’une seule larve est illustrée ici. Ici. Les valeurs de force maximale des larves de type sauvage de différents âges varient de 0,9 à 1,7.

Milli newtons avec les larves plus âgées générant plus de force que les larves plus jeunes. Les larves plus âgées génèrent plus de force que les larves plus jeunes, même après que les forces maximales ont été normalisées dans la zone musculaire de la section transversale. Lors de cette procédure, il est important de serrer suffisamment les boucles de suture pour que les larves ne puissent pas pivoter facilement autour du transducteur de force et des tubes du contrôleur de longueur.

Si les boucles de suture sont trop lâches, la force générée par la larve ne sera pas entièrement transmise au transducteur de force et la force de contraction maximale sera sous-estimée.