Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les performances et la fonction musculaires chez le poisson-zèbre à l’aide d’une réponse évoquée par le toucher et de tests de nage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la recherche neuromusculaire telles que l’identification de performances musculaires altérées ou de défauts neurodégénératifs dans des modèles de poissons zèbres. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode automatisée à haut débit pour évaluer les performances musculaires dans des modèles de poissons zèbres.

Pour effectuer le test, placez une boîte de Pétri remplie d’environ 25 millilitres de milieu embryonnaire sur une scène éclairée à température contrôlée réglée à environ 28 degrés Celsius. Montez la caméra haute vitesse au-dessus de l’antenne. Lancez le logiciel d’enregistrement vidéo et réglez la vitesse de capture sur 1 000 images par seconde pour garantir des vitesses de nage rapides.

Placez l’embryon au centre de la boîte de Pétri bien visible dans le champ de vision. Appuyez sur Enregistrer, puis délivrez un stimulus mécanosensoriel en touchant doucement l’embryon avec une aiguille émoussée sur le dessus de la tête. Arrêtez l’enregistrement une fois que l’embryon est sorti du champ de vision ou qu’il est retourné au repos.

Répétez le test des mêmes larves principalement pour l’habituation ou favoriser la faiblesse musculaire dans certains modèles malades, ce qui entraîne une réponse réduite au stimulus tactile, par conséquent, chaque embryon ne doit être testé qu’une seule fois. Pour quantifier le comportement de nage, lancez le logiciel et sélectionnez la locomotion de la larve unique avec notre module de soustraction d’arrière-plan pour ouvrir le fichier vidéo AVI. Sélectionnez l’outil à main levée ou polygone dans la barre de menu et sélectionnez la région du film qui englobe à la fois la position d’origine du poisson et la zone vers laquelle il nage, tout en excluant la sonde utilisée pour délivrer le stimulus mécanosensoriel.

Cliquez sur Tester dans la barre de menu et sélectionnez Exécuter. À l’invite, enregistrez le fichier d’analyse des données brutes au format PHR à l’emplacement souhaité. Cliquez ensuite sur Démarrer pour commencer l’analyse.

Une fois que le poisson est sorti du champ de vision ou que le clip vidéo est terminé, terminez l’analyse en cliquant sur Arrêter sous le menu Expérience et une fenêtre affichant les résultats apparaîtra. Faites défiler vers la droite de la fenêtre pour obtenir la valeur d’accélération maximale. Exportez les données en cliquant sur le bouton Exporter les résultats instantanés dans le menu déroulant Résultats.

Sélectionnez le fichier d’analyse des données brutes approprié et cliquez pour l’ouvrir. Cela enregistrera un fichier texte dans le dossier de destination qui peut être ouvert dans un tableur. Placez les larves d’essai dans une plaque de 48 puits, une par puits.

Ensuite, remplissez les puits d’eau juste en dessous du haut du puits en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles. Conservez les assiettes à 28 degrés Celsius pendant une heure. Placez la plaque dans une chambre d’enregistrement équipée d’une caméra numérique infrarouge capable de détecter les larves dans l’obscurité.

Les rythmes circadiens et les stimuli environnementaux externes peuvent affecter de manière significative le comportement de nage du poisson-zèbre. L’heure du jour et les conditions d’éclairage doivent être normalisées et la température de l’eau doit être strictement réglementée. Lancez le logiciel et sélectionnez le module de suivi.

Sous Fichier, cliquez sur Générer un nouveau protocole et modifiez le nombre de puits utilisés pour l’expérience qui dans cet exemple est de 48. Ensuite, cliquez sur Paramètres et sélectionnez Paramètres de protocole, puis Temps pour définir la durée de l’expérience et la période d’intégration sur 10 minutes. Toujours dans Paramètres de protocole, cliquez sur Options et assurez-vous que la case numéroscope est cochée.

Pour définir les zones d’enregistrement, mettez en surbrillance toute la grille et double-cliquez sur l’un des puits. Cliquez sur le bouton Dessiner des zones et dessinez autour des puits en haut à gauche, en haut à droite et en bas à gauche, puis cliquez sur Créer. Le logiciel déterminera ensuite la position de chaque puits.

À ce stade, dessinez également dans la barre d’échelle et cliquez sur Appliquer au groupe. Une fois terminé, cliquez sur le bouton Dessiner des zones. Ensuite, sélectionnez la couleur du poisson qui, dans ce cas, est le noir et faites glisser la barre de seuil de détection à un niveau où seuls les mouvements du poisson sont mis en évidence sans arrière-plan.

Entrez les seuils de mouvement pour détecter l’inactivité et les petits mouvements agrandis. Dans cet exemple, un seuil d’inactivité de six millimètres par seconde et un seuil de rafale d’activité de 30 millimètres par seconde ont été utilisés. Cliquez sur le menu Paramètres, puis sur les paramètres de conduite de la lumière et réglez l’intensité lumineuse de la chambre sur 0 %Fermez la porte de la chambre d’enregistrement et commencez l’enregistrement vidéo.

L’expérience sera terminée en 10 minutes, comme indiqué par la minuterie à l’écran. Une fois terminé, cliquez sur le menu déroulant Expérience et sélectionnez Arrêter. Une boîte de dialogue avec les résultats s’affiche.

Pour examiner les résultats à l’aide d’Excel, cliquez sur Ouvrir le dossier contenant et ouvrez le fichier qui apparaît dans le dossier résultant. Enfin, la vidéo peut être rejouée pour vérifier si les valeurs de locomotion enregistrées représentent fidèlement les mouvements de nage du poisson. Cela peut être réalisé en comparant le mouvement observé dans le fichier vidéo au profil de locomotion généré par le logiciel.

Des images instantanées d’un embryon de poisson-zèbre prises lors d’un essai d’évocation tactile montrent le mouvement typique d’un individu au cours des 0,2 premières secondes suivant l’application du stimulus. Ici, la figure montre un profil d’accélération pour les premières 0,2 secondes de la réponse d’évasion en nage en rafale chez les individus de type sauvage par rapport aux individus myopathiques. L’accélération a atteint un pic dans les deux souches dans cette fenêtre de temps et l’accélération maximale maximale est proportionnelle à la capacité de génération de force du muscle squelettique.

Les valeurs maximales d’accélération ont été moyennées pour le type sauvage et les souches myopathiques. Le poisson myopathique a montré une diminution significative de l’accélération maximale, indiquant une réduction de la fonction musculaire. Des tests de locomotion de 10 minutes d’embryons ont enregistré les modèles et les types de mouvements des embryons de type sauvage et myopathiques et ont généré des représentations schématiques des mouvements de nage.

Les périodes de mouvement lent représentées par des lignes vertes et les périodes de mouvement rapide représentées par des lignes rouges ont été cartographiées, ainsi que les périodes d’inactivité représentées par des lignes noires. Les individus de type sauvage ont montré des niveaux d’activité élevés avec relativement aucune période d’inactivité, contrairement aux individus myopathiques qui étaient moins actifs pendant la période d’essai. Cela s’est traduit par des différences significatives dans le nombre moyen de mouvements et la distance parcourue par les poissons de type sauvage par rapport aux poissons myopathes.

Une fois maîtrisé, le test de réponse évoquée par le toucher peut être effectué en 15 minutes pour 15 poissons et les tests de locomotion peuvent être réalisés en environ 10 minutes pour un maximum de 48 poissons. Lors de cette procédure, il est important de manipuler soigneusement les embryons car cela peut affecter leur activité. Suite à cette procédure, d’autres techniques telles que l’immunomarquage ou la microscopie électronique peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires liées à la pathologie musculaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les performances musculaires au début du développement du poisson-zèbre.