Name: Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Apprenez à préparer des échantillons fluorescents pour optimiser la microscopie STORM et acquérir des images super-résolues de 30-50 nm. Cette méthode améliore la résolution cinq à dix fois par rapport à la fluorescence classique.

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Nous reconnaissons le financement du programme chimique et biologique de métrologie National Measurement Office du Royaume-Uni. Nous remercions Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi et Eric Rees pour obtenir des conseils et des suggestions techniques. Nous remercions Miklos Erdelyi, Eric Rees et Max Ryadnov des commentaires et des discussions sur ce manuscrit utiles.

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous montrons avec quelques échantillons de test simples et l&#39;orage traitement librement accessible logiciel, il est possible d&#39;optimiser STORM super-resolution imaging. Ces outils et méthodes fourniront des points de départ utiles pour les nouveaux utilisateurs et les moyens pour les utilisateurs expérimentés à accroître la confiance dans leurs microscopes et de leur usage pour étudier les structures biologiques et cellulaires avec des détails sans précédent. En utilisant une combinaison d&#39;échantillons avec des structures connues ou bien comprises et un algorithme qui peut produire un certain nombre de paramètres de qualité d&#39;image utiles, telles que les estimations de précision moyenne, le nombre de localisation et des histogrammes montrant qu&#39;il est possible d&#39;améliorer la qualité de l&#39;image et d&#39;avoir une plus grande confiance dans le processus d&#39;imagerie STORM. Il n&#39;y a pas une approche unique à l&#39;acquisition des données, car il ya un certain nombre de configurations différentes de microscope commerciales et l&#39;auto-construction qui peut être utilisé. En outre, il ya beaucoup de préparation de l&#39;échantillon et de l&#39;image acquisition étapes qui peuvent influEnce l&#39;image finale ayant des outils logiciels et des échantillons de test est donc essentielle à la compréhension et l&#39;optimisation STORM qualité d&#39;image. En outre, ces protocoles peuvent fournir des moyens utiles et moins ambiguës de dépannage des problèmes qui peuvent survenir. Par exemple l&#39;échantillon de dextrane est un moyen très utile pour identifier s&#39;il existe un défaut d&#39;alignement de faisceau laser ou un éclairage irrégulier de l&#39;échantillon. Si l&#39;on craint que le tampon de commutation ne peut être travaille un test visuel très simple pour voir si il ya une «clignotant» aidera. Les filaments d&#39;actine sont un moyen utile de mesurer la résolution en utilisant des comparaisons FWHM tout en soulignant la dérive et une mauvaise localisation des objets. Toutefois, il convient de noter que les méthodes de super-résolution basée à la localisation peuvent être densité fluorophore sensible, nonobstant les autres facteurs, tels que le temps d&#39;exposition, de cadences, des puissances laser et la façon dont l&#39;image est traitée, il est impossible d&#39;assigner une résolution à unenotamment microscope et de supposer que toutes les images auront cette résolution. Ce qui est possible, cependant, est de mesurer les différents aspects de la résolution, tels que des précisions moyen de localisation, numéro de localisation et de la dérive 27. Même si marqueurs de référence ne peuvent pas être intégrés dans toutes les expériences qu&#39;ils peuvent, au moins, être utilisés pour caractériser un système de microscope, de son environnement et de mieux comprendre les considérations opérationnelles telles que combien de temps est nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre thermique après le démarrage. En plus de la correction de la dérive latérale, marqueurs fiduciaires peuvent être utilisés pour caractériser et corriger la dérive axiale, bien que cela nécessite l&#39;utilisation d&#39;une lentille astigmatique et un mécanisme de rétroaction pour corriger la position de l&#39;échantillon, tandis que les images sont en cours d&#39;acquisition 43. Systèmes de super-résolution commerciaux comprennent généralement une sorte de contrôle de la stabilité ou de se concentrer Mécanisme de verrouillage, qui peut être une solution plus pratique pour corriger la dérive de mise au point. Il are alternatives à revêtir de façon non spécifique de la vitre avec le dextrane, par exemple en utilisant des colorants ou d&#39;autres molécules directement conjugués, tels que des anticorps secondaires. Une limitation de ces approches est que le nombre de molécules liées à la vitre n&#39;est pas connue. Structures filamenteuses alternatifs qui ont été utilisés comprennent microtubules 28 et l&#39;ADN 21. Cependant, la combinaison de très petite taille et de réactifs disponibles dans le commerce avantageuses font l&#39;actine une alternative intéressante, en particulier lorsque la distance de séparation de filaments ramifiés ou divergents peut aussi être une mesure utile de la performance du système 27. Il ya de la place pour le développement ultérieur des échantillons, malgré les progrès récents dans ce domaine 28,29,46,47. En particulier, l&#39;imagerie multi-couleur présente un certain nombre de défis dans les 3 principaux aspects de l&#39;imagerie, de l&#39;étiquetage de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de l&#39;image (hardware) et des logiciels (traitement et l&#39;alignement d&#39;image). Il ya un étéun certain nombre de publications traitant de ces aspects 4-6 et il est donc clair que les échantillons et les méthodes d&#39;essai appropriées sont essentielles pour générer et interpréter de façon fiable ces types d&#39;images. En effet, récemment, il a été montré que dSTORM pourrait être utilisé pour prendre deux images couleur, de et à résoudre, la nature hautement symétrique du complexe du pore nucléaire et les auteurs ont suggéré que ce serait un moyen idéal pour évaluer la performance des corrections d&#39;aberration chromatique 45. Une autre approche intéressante est l&#39;utilisation de l&#39;ADN origami pour créer un nanoruler, ce qui crée la possibilité de fluorophores de positionnement à des distances sous-diffraction spécifiques intervalle 46. Cela fournit un moyen de déterminer la résolution et de faire des mesures de distance. Cependant, le but ultime est d&#39;appliquer ces techniques de super-résolution pour échantillons non idéalisées, comme les cellules, qui sont des structures tridimensionnelles complexes. Dans ce cas, une combinaison d&#39;une compréhension plus approfondie de til technique combinée avec des outils logiciels qui aident l&#39;utilisateur dans l&#39;acquisition de données, les traiter de manière appropriée, et fournir des paramètres d&#39;image est susceptible d&#39;être la réponse ultime 28,29,47,48.

Récemment, un éventail de techniques de microscopie optique ont été développés, généralement dénommée super-résolution microscopie ou nanoscopie, permettant ainsi de contourner la limite de diffraction et de générer des images avec des résolutions de 100 nm ou plus 1,2. Depuis l&#39;annonce de la microscopie de super-résolution comme étant la méthode Nature Methods de l&#39;année en 2008, il ya eu beaucoup de développement de microscopes à base de localisation. Par exemple, il existe des applications multi-couleurs 3-6, 7-12 implémentations 3D et les applications de cellules vivantes, même 5,13-17. En outre, comme ces systèmes sont commercialisés et sont en train de faire leur chemin hors des laboratoires d&#39;optique dans les mains des biologistes cellulaires, il est susceptible d&#39;être une nouvelle augmentation de leur utilisation et application aux questions biomédicales. Une branche de cette famille sont les méthodes basées sur la localisation, qui travaillent en mettant en place une molécule par molécule d&#39;image. Jen Pour ce faire, la majorité des molécules fluorescentes dans l&#39;échantillon doit être coupée de telle sorte que seulement quelques molécules séparées spatialement, sont actives à un moment donné. Ces molécules sont ensuite passés rapidement sur et en dehors et de nombreuses images sont prises de sorte qu&#39;une partie importante de la population est imagé à refléter la structure sous-jacente avec une précision de sous-diffraction. Un certain nombre d&#39;approches ont été publiées notamment GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 et RESOLFT 22. Algorithmes qui mesurent la position d&#39;une détection de molécule unique peuvent ensuite être utilisés pour localiser la position réelle de la molécule avec une précision meilleure que 20 nm en utilisant raccord gaussien 23, par exemple rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 et palm3d orage 27. Quand l&#39;imagerie cellulaire ou d&#39;autres échantillons biologiques, qui ont une forte densité de molécule, il est donc nécessaire de prendre des milliers de cadres dece clignotement, séparés spatialement, le signal pour l&#39;image, une proportion importante des molécules marquées. Microscopie stochastique de reconstruction optique (STORM) et la dSTORM très liés et méthodes GSDIM sont des méthodes de super-résolution basée à la localisation, qui se sont révélées à travailler avec des colorants organiques disponibles dans le commerce 21. Il a été démontré depuis d&#39;être applicable à un certain nombre de différents colorants de 28 à 30, ce qui rend la méthode particulièrement intéressante en raison de la spécificité et de la commodité d&#39;autres approches d&#39;immunomarquage bien établis pour effectuer la microscopie de fluorescence. Par conséquent, il ya un accès facile à une gamme de conjugués anticorps-colorant et colorant biomolécules, qui ont le potentiel d&#39;être utilisé dans de super-résolution imagerie basée sur la localisation. Alors que les principes généraux du STORM et des approches similaires sont relativement simples, et à première vue, la préparation du matériel et de l&#39;échantillon semblent relativement straightforward, il ya un certain nombre d&#39;étapes dans le processus qui sont essentiels à la réalisation de haute qualité, des images libres de artefact super-résolution. Comme avec toutes les techniques de microscopie le processus peut être considéré en trois étapes principales: d&#39;abord, la préparation d&#39;échantillons, d&#39;autre part, l&#39;acquisition des images et, troisièmement, le traitement d&#39;image et / ou l&#39;analyse et l&#39;interprétation d&#39;image. Le pouvoir de résolution supplémentaire et méthode de générer des images de super-résolution en utilisant une approche basée sur la localisation-introduit de nouveaux problèmes et considérations 31-33. En commençant par la préparation des échantillons, lors de l&#39;exécution immunomarquage, en particulier immunofluorescence indirecte, où une combinaison d&#39;anticorps primaire et secondaire est utilisée, il convient de noter que le colorant fluorescent peut être jusqu&#39;à 20 nm à une distance à partir de la molécule d&#39;intérêt. Dans le cas des microtubules, ceci conduit à des diamètres de 35 à 50 nm par rapport à un diamètre de microtubules prévue de 25 nm 28,30. En outre, la densité de l&#39;étiquetage devrait meet les critères de Nyquist afin de générer une image de haute qualité 14. Par exemple, pour une résolution d&#39;image prévue de 20 nm le long d&#39;une structure filamenteuse il devrait y avoir une molécule de colorant, au moins tous les 27 à 10 nm. Alors que de nombreux colorants ont été publiées à travailler pour les approches à base de localisation-la performance globale du colorant est un mélange d&#39;au moins quatre critères importants, à savoir les photons détectés par événement de commutation (la luminosité de chaque clignement - lumineux est mieux), l&#39;équilibre sur cycle hors service (le taux de contraste de colorants dans le hors contre sur l&#39;état - plus large est généralement mieux), la fraction de survie (un taux de blanchiment bas est mieux) et le nombre de cycles de commutation (le nombre de clignotements par fluorophore - plus est mieux pour une grande résolution, bien que 1 clignotement par fluorophore peut être un avantage pour des fins de comptage molécules). La situation est encore compliquée par le fait que ces propriétés pour n&#39;importe quel colorant donné peuvent varier dans différentes conditions de tampon etavec le laser de puissance 28,29. En outre, ainsi que ces considérations STORM uniques, la qualité de l&#39;image peut être améliorée en optimisant la préparation des échantillons de la même façon que les techniques de microscopie par fluorescence plus classiques, par exemple en réduisant au minimum l&#39;autofluorescence par modification des conditions de fixation et l&#39;utilisation de réactifs d&#39;extinction. De plus, en minimisant fluorophores non liés spécifiquement est important, ce qui peut être fait en ajustant les concentrations d&#39;étiquettes, des temps d&#39;incubation et blocage et de lavage étapes. La deuxième étape de l&#39;acquisition d&#39;image est également critique. Les paramètres optimaux sur le microscope dépendront de la teinture, des conditions de tampon, la densité de marquage, et le type d&#39;échantillon, par exemple, le verre, les monocouches sur des cellules ou des échantillons de tissus. Les principales considérations sont caméra le temps d&#39;exposition, numéro de trame, angle d&#39;éclairage (FRBR, Hilo, Epi) et la puissance du laser. L&#39;objectif est de collecter autant de clignotements séparés spatialement lumineux le plus rapidement possible. Si le fond is très élevées ou clignote ne sont pas très lumineux, en d&#39;autres termes le rapport signal-sur-bruit est faible, l&#39;algorithme de reconstruction ne sera pas en mesure de localiser les positions avec précision. Ainsi que la maximisation de la précision de localisation, c&#39;est à dire la précision de la position de chaque molécule peut être mesurée, de la qualité de l&#39;image dépend également d&#39;un grand nombre de localisations. Si un nombre insuffisant de molécules d&#39;intérêt sont imagé, soit en raison de la faible efficacité de l&#39;étiquetage, photoblanchiment excessive ou un numéro d&#39;image insuffisante, alors l&#39;image résultante de super-résolution sera ponctuée et discontinu comme critères de Nyquist n&#39;auront pas été remplies 14,27 . Et enfin, la troisième étape, le traitement d&#39;image, est particulièrement important par rapport aux techniques de microscopie à fluorescence standard. Il existe une gamme de librement et disponibles dans le commerce des algorithmes, ce qui est à la fois un avantage, en termes de choix, et un inconvénient, en ce qu&#39;il peut être difficile de savoir which est le plus approprié à utiliser. Si par exemple les données brutes a bien espacées clignote spatialement distincts alors un algorithme d&#39;ajustement seule molécule peut être très précise et efficace, par exemple par les algorithmes d&#39;ajustement rares disponibles sous une pluie torrentielle 27, rapidSTORM 24,25, 12 et palm3d logiciel QuickPALM 26 . Si les données brutes contient beaucoup de chevauchement des signaux alors algorithmes qui peuvent être plus appropriés inclure DAOSTORM 34, 35 et 3B deconSTORM 36. En outre, ces algorithmes contiennent des seuils pour différents critères tels que nombre de signaux, ou de photons par clignotement, ainsi que diverses autres options d&#39;affichage d&#39;image, comme la visualisation des fonctions gaussiennes lissées ou histogrammes avec des grilles de pixels, où la taille de pixel de super-résolution peut être sélectionné par l&#39;utilisateur. Toutes ces options modifier l&#39;apparence de l&#39;image finale et ont des implications pour l&#39;interprétation des images et l&#39;analyse. <p class="jove_content"&gt; Par conséquent, nous présentons trois échantillons d&#39;essai qui fournira le nouvel utilisateur avec un point de départ pour des expériences à base de colorants à base de localisation-super-résolution, qui, pour des raisons de clarté, nous appellerons comme tempête, et les utilisateurs plus expérimentés de la possibilité de optimiser leurs expériences. Premièrement, il est possible de revêtir la surface de verre avec une couche fluorescente de dextrane-conjugué colorant. Cela fournit un moyen rapide et simple à mettre en place que le microscope, colorant et tampon travaillent pour générer clignotant signal fluorescent. La méthode peut être étendue en comparant mesures moyennes de précision de la localisation et le numéro générés par la tempête de pluie pour optimiser les conditions de tampon, les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image et de tester différents colorants. Deuxièmement, nous présentons un protocole simple pour la préparation de filaments d&#39;actine sur le verre qui peut être facilement marqué à l&#39;aide conjugués phalloidin-dye. Ceux-ci fournissent des structures idéales pour effectuer des mesures de la résolution 27 et généralement la moitié du maximum pleine largeur (FWHM)d&#39;un filament est donnée comme une estimation empirique de la résolution 37. Il convient de noter que la résolution varie entre les échantillons et entre les images dans le même échantillon parce que la résolution en super-résolution microscopie basée localisation-est une fonction de la luminosité de fluorophore, le bruit de fond et la densité de localisation 27 et ceux-ci ne sont pas nécessairement constante tout au long de l&#39;échantillon. Les filaments d&#39;actine sont utilisés pour démontrer artefacts potentiels tels que mislocalizations et de la dérive et la façon dont ils peuvent être identifiés avec des fonctionnalités du logiciel au sein orage. En outre, nous décrivons l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents repères à la fois la mesure et la dérive correcte. Et troisièmement, la coloration des cellules avec le facteur de croissance épidermique (EGF), des conjugués de colorant-est décrite. FEM fournit un indicateur utile de la super-résolution performance de l&#39;image, car une proportion du récepteur à la surface de la cellule subit une endocytose via des vésicules, qui sont des structures de taille sous-diffraction d&#39;environ 50-150 nm de diamètre 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Imaging verre de chambre</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Microscope inversé </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Voir ci-dessous pour les alternatives</td></tr><tr><td>Objectif 100 X TIRF Olympus</td><td></td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Voir ci-dessous pour les alternatives</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Voir ci-dessous pour les alternatives</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>640 nmToptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - pour l’imagerie Alexa 647 ou Cy5 colorants</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Logiciel d’acquisition (contrôle du matériel)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bits), processeur Intel Xeon E5420, 16 Go de RAM *Contrôle de l’instrument et traitement d’image</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Analyse et traitement d’images <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij » target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>logiciel Laser</td><td>Analytics Group (Cambridge)<</td><td></td><td>a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources » target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ » target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Exemple de microscopes</td><td></td><td></td> STORM/PALM auto-construits <td>Voir aussi référence 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope » target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a></td></tr><tr><td>*Microscopes commerciaux à super-résolution STORM/PALM Leica</td><td>SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives aux microscopes</td><td></td><td></td> auto-construits</tr><tr><td colspan="4">Table 1. Matériaux & Equipement </td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1 ; 2 ; 3 ; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1 ; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Tampon d’actine général</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Filaments d’actine préformés</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Microsphères TetraSpeck (0,1 micron)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Plats en plastique</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldéhyde - solution à 10 % grade EM Polysciences</td><td></td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glycérine</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1 ; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 2. Réactifs</td></tr></tbody></table>

les échantillons de test pour optimiser storm super-résolution microscopie

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM est une technique de microscopie de super-résolution récemment développé avec jusqu&#39;à 10 fois meilleure résolution que les techniques de microscopie de fluorescence standard. Cependant, comme l&#39;image est acquise d&#39;une manière très différente de la normale, en mettant en place une molécule par molécule de l&#39;image, il ya des défis importants pour les utilisateurs en essayant d&#39;optimiser leur acquisition de l&#39;image. Afin de faciliter ce processus et de gagner plus de perspicacité dans la façon dont fonctionne TEMPÊTE nous présentons la préparation de trois échantillons d&#39;essai et la méthode de l&#39;acquisition et de traitement STORM images de super-résolution avec des résolutions typiques de 30-50 nm. En combinant les échantillons d&#39;essai avec l&#39;utilisation du logiciel libre disponible de traitement de tempête de pluie, il est possible d&#39;obtenir une grande quantité d&#39;informations sur la qualité et la résolution d&#39;image. En utilisant ces paramètres, il est alors possible d&#39;optimiser le procédé d&#39;imagerie à partir de l&#39;optique, de préparation, choix de colorant, des conditions de tampon et les paramètres d&#39;acquisition de l&#39;image de l&#39;échantillon. Nous unmontrent des exemples LSO de certains problèmes courants qui entraînent une mauvaise qualité d&#39;image, tels que la dérive latérale, où l&#39;échantillon se déplace au cours de l&#39;acquisition et de la densité d&#39;image des problèmes résultant du phénomène de «mauvaise localisation» liés.

Nous décrivons la préparation de trois échantillons d&#39;essai et comment elles peuvent être utilisées pour optimiser et évaluer la performance des microscopes de tempête. L&#39;utilisation de ces exemples, nous montrons comment acquérir les données brutes et les traiter ensuite pour acquérir des images de super-résolution dans les cellules d&#39;environ 30-50 nm de résolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment acquérir des images super-résolues de haute qualité avec STORM. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon témoin marqué par fluorescence. La deuxième étape consiste à préparer le tampon de commutation, puis à remplir la chambre d'observation avec ce tampon.Ensuite, les données brutes sont acquises sur un microscope STORM. La dernière étape consiste à reconstruire des images en super-résolution à partir des données brutes à l'aide d'un logiciel de traitement RAINSTORM. En définitive, les échantillons test sont utilisés pour montrer comment acquérir des données brutes de haute qualité, qui peuvent ensuite être traitées pour générer des images en super-résolution STORM dans des cellules avec des résolutions comprises entre 30 et 50 nanomètres, représentant ainsi un gain de résolution de cinq à dix fois par rapport aux techniques traditionnelles de microscopie de fluorescence, notamment la TURF et la microscopie confocale.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles ne réalisent pas l'importance de collecter de nombreux liens épars de haute qualité. Cela devient beaucoup plus facile en utilisant le colorant Alexa 6 4 7 dans le tampon de commutation approprié. Une démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car l'acquisition de données brutes de haute qualité est cruciale pour produire des images de résolution SPR.Les séquences vidéo brutes de cette technique présentent un aspect totalement différent de toute autre forme de microscopie de fluorescence. Pour commencer la procédure d'enduction du verre avec du dextran fluorescent, ajouter 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d'une lame à huit chambres et incuber pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirer la solution de polylysine à l’aide d’une pipette afin de s’assurer qu’aucun liquide résiduel ne demeure.0,25 microlitre d'une solution mère de dextrine à deux milligrammes par millilitre. Alexa 6 47 dans 25 microlitres d'eau déionisée afin de préparer une solution à 20 microgrammes par millilitre pour créer un revêtement dense de dextrine. Solution d'Alexa 6 47.Diluez 20 microlitres de la solution de 20 microgrammes par millilitre dans un volume total de 200 microlitres d'eau déionisée. Pour une solution de densité moyenne, diluez deux microlitres dans 200 microlitres d'eau déionisée. Pour une solution de faible densité, diluez 0,2 microlitre.Dans 200 microlitres d'eau déionisée, ajouter 200 microlitres des solutions de dextrine Alexis X 47 diluées dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes. Des durées d'incubation plus longues peuvent être utilisées, ce qui peut entraîner un revêtement de dextrine plus dense. Enfin, éliminer les solutions Dexter Xis X 47 et laver trois fois avec de l'eau.Pour préparer des filaments d'actine fluorescents sur du verre, ajoutez d'abord 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d'une chambre à huit compartiments. Recouvrez le verre et incubez pendant 10 minutes. Retirez ensuite à l’aide d’une pipette pour vous assurer qu’aucun liquide ne reste.Ajouter dans chaque chambre 90 microlitres de tampon d'actine général préalablement reconstitué selon les instructions du fabricant. Puis ajouter 10 microlitres de solution d'actine polymérisée à 10 micromolaire et un microlitre de foid et d'Alexa 647, et mélanger délicatement par aspiration et expulsion à l'aide d'une pipette pendant 30 minutes à température ambiante afin de préparer des billes fluorescentes servant de marqueurs fiduciaux. Diluer un microlitre de billes Tepec dans 200 microlitres de PBS et homogénéiser. Ajouter les billes diluées dans la chambre d'imagerie et attendre 15 minutes.Après 15 minutes, retirez la solution et lavez trois fois avec du PBS avant l'acquisition d'images. Les cellules cultivées à environ 80 % de confluence sont utilisées dans cette expérience. Retirez le milieu de culture et rincez avec du PBS. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution de formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes.Retirez le formaldéhyde et lavez trois fois avec du PBS. Veillez à ce que les cellules ne s'assèchent pas et utilisez toujours des solutions tamponnées au PBS. Pour éviter un stress hypotonique, ajoutez deux microlitres d'une solution mère d'EGF Alexa 647 à 50 microgrammes par millilitre à 200 microlitres de solution de BSA à 0,1 %, puis ajoutez cette solution aux cellules HeLa.Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Éliminer la solution et laver trois fois avec du PBS. Ajouter une solution de blocage contenant 0,1 % de BSA et laisser agir pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, éliminer la solution de blocage et rincer trois fois supplémentaires avec du PBS avant l'acquisition d'images. Juste avant l'acquisition, préparer le tampon de commutation en mélangeant les solutions mères d'enzyme glucose et d'agent réducteur dans un rapport de 50 microlitres, 400 microlitres et 100 microlitres, puis ajouter du PBS pour compléter le volume final à un millilitre. Retirer le PBS de la chambre d'observation, puis remplir entièrement avec le tampon de commutation.Placez soigneusement une lame couvre-objet sur le dessus de la chambre, en veillant à ce qu'il n'y ait absolument aucune bulle et que toute la chambre soit recouverte. Si des bulles apparaissent, ajoutez du tampon ou du PBS supplémentaire. Sinon, les performances du tampon peuvent diminuer.La collecte de données de liaison de haute qualité et peu denses est essentielle pour la réussite de cette procédure ; veillez donc à ce que les microscopes soient correctement focalisés et que les paramètres d'acquisition appropriés soient utilisés. Repérez une structure fluorescente d'intérêt à imager. Sélectionnez l'angle d'illumination souhaité.Dans ce cas, un angle de prisme ou un angle fortement incliné est recommandé, car cela améliore le rapport signal sur bruit en minimisant la lumière hors foyer, ce qui est particulièrement bénéfique pour les échantillons cellulaires. Prenez une référence d'image à diffusion limitée de la structure avant l'acquisition en microscopie STORM. Augmentez le laser d'excitation à une puissance élevée correspondant à environ deux kilowatts par centimètre carré, tout en effectuant l'acquisition avec des réglages de caméra d'une exposition de 10 millisecondes et un temps de cycle d'environ 50 hertz ou images par seconde.Une fois que les flores quadruples sont passées à un motif de clignotement clairsemé, collectez 10 000 images. Pour commencer cette reconstruction, ouvrez le fichier M RAINSTORM dans MATLAB et exécutez-le dans la fenêtre rainstorm.Sélectionnez le fichier image à analyser à l’aide du bouton de navigation. Il doit s'agir d'un fichier TIF. Modifiez la largeur en pixels pour qu'elle corresponde aux données brutes du système de microscope utilisé pour acquérir les données.Laissez les autres valeurs par défaut. Appuyez sur le bouton traiter les images et attendez jusqu'à l'apparition d'une image préliminaire. La durée du traitement dépendra de la taille du fichier, des caractéristiques de l'ordinateur et du nombre de liens candidats présents dans les données brutes.Pour générer une image mise à jour en super-résolution, appuyez sur le bouton « ouvrir l'examinateur » et une deuxième fenêtre apparaîtra. Appuyez sur le bouton « ajuster le contraste » afin de modifier l'affichage de l'image selon vos préférences. Dans certains cas où l'image est très sombre, la valeur maximale devrait être réduite.Utilisez la fenêtre de révision pour générer des métriques utiles d'évaluation de la qualité de l'image et affiner davantage l'image en super-résolution. Conservez les trois premiers paramètres de contrôle qualité aux valeurs par défaut de 5 000, 0,1 et 0,8 à 3,5 respectivement. Mettez à jour la valeur des comptes par photon.Modifier la valeur seuil de précision de localisation afin d'obtenir un compromis entre l'optimisation de la localisation moyenne, la précision et le nombre de localisations. Dans l'image finale, des valeurs comprises entre 30 et 50 nanomètres sont recommandées, selon la qualité des données et de l'échantillon. Le facteur d'échelle par défaut de la reconstruction est de cinq, ce qui produira des pixels de super-résolution de 32 nanomètres, en supposant que le pixel dans les images d'origine mesure 160 nanomètres.Si les images brutes ont une taille de pixel de 100 nanomètres, cela produira des images en super-résolution avec des pixels de 20 nanomètres. Augmentez le facteur d'échelle pour obtenir des pixels en super-résolution plus petits. Dans l'image finale, appuyez sur le bouton « exécuter l'examinateur » pour générer une image mise à jour en super-résolution.Appuyez sur le bouton afficher les histogrammes pour visualiser les métriques de qualité de l'image. Enfin, appuyez sur le bouton enregistrer l'image dans le visualiseur afin de sauvegarder toutes ces données. Commencez cette procédure en générant une image de la même manière que précédemment démontré.Appuyez sur le bouton de suivi de la zone dans le visualiseur, puis cliquez et faites glisser une zone autour du marqueur fiduciel sur l'image examinée. Attendez qu'une nouvelle image apparaisse, affichant les positions encadrées. Enregistrez cette image si vous le souhaitez, si l'objet d'intérêt est un marqueur fiduciel.Comme c'est le cas ici, effectuez la correction de la dérive en cliquant sur le bouton définir l'ancrage, puis sur le bouton soustraire la dérive. Enfin, cliquez à nouveau sur exécuter l'examinateur pour générer une nouvelle image STORM. Un revêtement réussi de dextrine devrait produire une monocouche fluorescente et des données typiques de dextrine sont présentées dans cette figure.Les images limitées par la diffraction montrent différentes concentrations de dextrine avant l'acquisition STORM. Les reconstructions en super-résolution ont une taille de pixel de 25 nanomètres. 10 000 images ont été collectées avec une taille de trame de 128 par 128 pixels, et des images individuelles issues de cette séquence sont présentées.À une concentration élevée de dextrine. La monocouche fluorescente doit apparaître relativement uniforme, comme illustré sur ces images et ce segment vidéo. À des concentrations plus faibles, les clignotements apparaîtront plus espacés et en netteté.Avec aucun fond apparent pendant cette phase d'acquisition d'images sous illumination laser constante, le nombre de clignotements diminue au fil du temps, comme le montre la comparaison entre l'image 2000 et l'image 8 000 dans l'échantillon à haute densité. La principale différence entre les images de super-résolution des concentrations élevée, moyenne et faible de dextrine réside dans le nombre décroissant de localisations. Ce graphique présente la moyenne de trois séquences de 10 000 images pour chaque concentration de dextrine, les barres d'erreur indiquant l'écart type.Cependant, cette relation proportionnelle entre la concentration des molécules fluorescentes, le nombre de clignotements dans les données brutes et le nombre de localisations n'est pas une relation linéaire simple, comme le montre ce graphique du nombre de localisations acceptées par image. En utilisant une moyenne glissante sur 100 images à des densités moléculaires très élevées, le logiciel est incapable de localiser correctement les molécules lors de l'acquisition de n'importe quel échantillon. Un problème courant peut être la présence d'un halo fluorescent brillant mais flou s'étendant sur l'image, causé par la diffusion du fluoro dans le milieu.On peut éviter ou éliminer ces molécules fluorescentes détachées en augmentant le nombre d'étapes de lavage avec du PBS avant d'ajouter le tampon de commutation ou en ajoutant du tampon de commutation frais à la chambre. Le traitement et la comparaison des données provenant de chaque séquence d'images produisent des images de super-résolution très différentes. Les panneaux C et D sont des reconstructions d'images de super-résolution correspondant aux données recueillies dans les panneaux A et B respectivement. Ce graphique représente le nombre de localisations acceptées par image, calculé à l'aide d'une moyenne glissante sur 100 images.La ligne rouge correspond aux séquences d'orage A et C, où le fond est élevé, la ligne bleue correspond aux séquences B et D, où le fond est faible. Le nombre de localisations acceptées pour les images correspondant aux données à fond élevé et à fond faible est indiqué sur le deuxième graphique. Ces trois images limitées par la diffraction montrent des données typiques de filaments d'actine préformés fixés à la surface du verre avant l'ajout du tampon de commutation et de l'imagerie STORM.Des filaments de longueurs variables peuvent être observés. Les filaments très brillants sont souvent constitués de plusieurs filaments emmêlés ensemble. La sélection de filaments individuels relativement brillants, plutôt que des zones emmêlées, permet d'obtenir des images de meilleure qualité pendant la phase d'acquisition.Des clignotements nets et bien mis au point doivent être observés le long de la longueur du filament. Un clignotement clairsemé doit être observé pendant la phase d'acquisition, puis ultérieurement dans les données traitées. Il devrait y avoir un filament fin et continu dans les localisations par image, qui doit montrer une diminution progressive.Typiquement, la largeur à mi-hauteur (FWHM) d'un filament est donnée comme estimation empirique de la résolution en traçant une ligne droite à travers une région agrandie du filament d'actine à l'aide de la fonction « profil d'intensité » dans ImageJ, puis en effectuant un ajustement gaussien. La FWHM est calculée à 43,2 nanomètres. Un problème de mauvaise localisation peut survenir lorsque plusieurs filaments d'actine se ramifient ou se croisent, en traitant des sous-ensembles d'images et en comparant les 5 000 premières et les 5 000 dernières images.Une image différente est produite dans l'image en super-résolution en utilisant les 5 000 premières images. De nombreuses localisations sont visibles au centre de l'image. Toutefois, lorsqu'on utilise les 5 000 dernières images, très peu de ces localisations sont apparentes et seuls les filaments subsistent, bien qu'ils apparaissent partiellement continus en raison du faible nombre de localisations dans l'image.Si une densité de clignotement trop élevée est suspectée, la comparaison des images avec les données de localisation par image peut fortement suggérer que ce problème se produit durant le premier ensemble d'images. On observe un nombre moyen de localisations par image supérieur à 10, contre environ quatre pour le dernier ensemble d'images. Un autre problème potentiel en microscopie STORM est la dérive, qui se produit lorsque l'échantillon se déplace par rapport à l'objectif pendant la phase d'acquisition des données. Bien qu'elle soit très difficile à détecter durant l'acquisition des images, la dérive peut être mise en évidence dans les images de super-résolution de structures connues, telles que les filaments d'actine.Le premier signe indiquant qu'une dérive latérale a pu se produire est que la structure est plus grande que prévue. Par exemple, une largeur à mi-hauteur relativement importante par rapport aux données de limite de précision issues de l'orage, dans ce cas 90 nanomètres comparés à 67 nanomètres. Une meilleure méthode pour détecter la dérive consiste à comparer les localisations en fonction du temps, c'est-à-dire à vérifier si les localisations dans les images ultérieures sont décalées par rapport à celles des premières images.Cela peut être clairement observé dans le cas des filaments d'actine lorsqu'ils sont affichés avec un code couleur. En utilisant la fonction de suivi de boîte dans rainstorm, comme illustré dans les panneaux B et C, les localisations sont affichées avec une couleur correspondant au numéro d'image auquel elles ont été acquises. Par exemple, les localisations provenant du début de la séquence d'acquisition sont en bleu, tandis que celles provenant de la fin de la séquence d'acquisition sont en rouge.Les couleurs déplacées indiquent qu'une dérive s'est produite afin de la mesurer et de la corriger. Pour mesurer la dérive, des billes fluorescentes d'un diamètre de 100 nanomètres peuvent être utilisées comme marqueurs fiduciaux ; les numéros un à quatre montrent des billes recadrées et agrandies individuellement. Dans un exemple où une dérive relativement importante d'environ 100 nanomètres se produit sur une durée de trois minutes et 10 secondes pendant la phase d'acquisition, la même fonction de suivi de zone peut être utilisée pour coder la dérive en couleurs et la confirmer, puisque les quatre billes de cet exemple présentent une dérive quasi identique. Il est alors possible d'en sélectionner une — dans ce cas, la bille deux — comme référence, puis de soustraire la dérive des autres billes.Une comparaison avec le panneau E montre que la dérive latérale a été corrigée. Enfin, des cellules HeLa marquées avec le facteur de croissance épidermique peuvent être utilisées pour fournir un exemple réaliste de résolution d'image. Dans les cellules, le panneau A montre une image limitée par la diffraction d'une partie d'une cellule HeLa focalisée au niveau de la surface basale de la cellule, où les boîtes jaunes indiquent les régions d'intérêt agrandies présentées dans les panneaux B et C, par opposition aux régions d'intérêt agrandies floues de l'image limitée par la diffraction.Les images en super-résolution doivent montrer un mélange d'amas et occasionnellement des pixels isolés uniques. Les amas auront un diamètre d'environ 100 nanomètres et correspondent probablement à des fossettes et des vésicules en formation. Le chemin par lequel l'EGF est principalement régulé à la baisse et les localisations endocytées par image extraites du panneau D sont présentées dans le graphique G. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des échantillons de test simples, d'acquérir des données et de reconstruire des images de résolution STORM de haute qualité.Ces méthodes permettront d'éviter certains pièges courants liés à l'ajustement, tels que la dérive, et aideront à optimiser votre storm. Voir les expériences de résolution.

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