Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment acquérir des images super-résolues de haute qualité avec STORM. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon témoin marqué par fluorescence. La deuxième étape consiste à préparer le tampon de commutation, puis à remplir la chambre d'observation avec ce tampon.

Ensuite, les données brutes sont acquises sur un microscope STORM. La dernière étape consiste à reconstruire des images en super-résolution à partir des données brutes à l'aide d'un logiciel de traitement RAINSTORM. En définitive, les échantillons test sont utilisés pour montrer comment acquérir des données brutes de haute qualité, qui peuvent ensuite être traitées pour générer des images en super-résolution STORM dans des cellules avec des résolutions comprises entre 30 et 50 nanomètres, représentant ainsi un gain de résolution de cinq à dix fois par rapport aux techniques traditionnelles de microscopie de fluorescence, notamment la TURF et la microscopie confocale.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles ne réalisent pas l'importance de collecter de nombreux liens épars de haute qualité. Cela devient beaucoup plus facile en utilisant le colorant Alexa 6 4 7 dans le tampon de commutation approprié. Une démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car l'acquisition de données brutes de haute qualité est cruciale pour produire des images de résolution SPR.

Les séquences vidéo brutes de cette technique présentent un aspect totalement différent de toute autre forme de microscopie de fluorescence. Pour commencer la procédure d'enduction du verre avec du dextran fluorescent, ajouter 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d'une lame à huit chambres et incuber pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirer la solution de polylysine à l’aide d’une pipette afin de s’assurer qu’aucun liquide résiduel ne demeure.

0,25 microlitre d'une solution mère de dextrine à deux milligrammes par millilitre. Alexa 6 47 dans 25 microlitres d'eau déionisée afin de préparer une solution à 20 microgrammes par millilitre pour créer un revêtement dense de dextrine. Solution d'Alexa 6 47.

Diluez 20 microlitres de la solution de 20 microgrammes par millilitre dans un volume total de 200 microlitres d'eau déionisée. Pour une solution de densité moyenne, diluez deux microlitres dans 200 microlitres d'eau déionisée. Pour une solution de faible densité, diluez 0,2 microlitre.

Dans 200 microlitres d'eau déionisée, ajouter 200 microlitres des solutions de dextrine Alexis X 47 diluées dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes. Des durées d'incubation plus longues peuvent être utilisées, ce qui peut entraîner un revêtement de dextrine plus dense. Enfin, éliminer les solutions Dexter Xis X 47 et laver trois fois avec de l'eau.

Pour préparer des filaments d'actine fluorescents sur du verre, ajoutez d'abord 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d'une chambre à huit compartiments. Recouvrez le verre et incubez pendant 10 minutes. Retirez ensuite à l’aide d’une pipette pour vous assurer qu’aucun liquide ne reste.

Ajouter dans chaque chambre 90 microlitres de tampon d'actine général préalablement reconstitué selon les instructions du fabricant. Puis ajouter 10 microlitres de solution d'actine polymérisée à 10 micromolaire et un microlitre de foid et d'Alexa 647, et mélanger délicatement par aspiration et expulsion à l'aide d'une pipette pendant 30 minutes à température ambiante afin de préparer des billes fluorescentes servant de marqueurs fiduciaux. Diluer un microlitre de billes Tepec dans 200 microlitres de PBS et homogénéiser. Ajouter les billes diluées dans la chambre d'imagerie et attendre 15 minutes.

Après 15 minutes, retirez la solution et lavez trois fois avec du PBS avant l'acquisition d'images. Les cellules cultivées à environ 80 % de confluence sont utilisées dans cette expérience. Retirez le milieu de culture et rincez avec du PBS. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution de formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes.

Retirez le formaldéhyde et lavez trois fois avec du PBS. Veillez à ce que les cellules ne s'assèchent pas et utilisez toujours des solutions tamponnées au PBS. Pour éviter un stress hypotonique, ajoutez deux microlitres d'une solution mère d'EGF Alexa 647 à 50 microgrammes par millilitre à 200 microlitres de solution de BSA à 0,1 %, puis ajoutez cette solution aux cellules HeLa.

Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Éliminer la solution et laver trois fois avec du PBS. Ajouter une solution de blocage contenant 0,1 % de BSA et laisser agir pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, éliminer la solution de blocage et rincer trois fois supplémentaires avec du PBS avant l'acquisition d'images. Juste avant l'acquisition, préparer le tampon de commutation en mélangeant les solutions mères d'enzyme glucose et d'agent réducteur dans un rapport de 50 microlitres, 400 microlitres et 100 microlitres, puis ajouter du PBS pour compléter le volume final à un millilitre. Retirer le PBS de la chambre d'observation, puis remplir entièrement avec le tampon de commutation.

Placez soigneusement une lame couvre-objet sur le dessus de la chambre, en veillant à ce qu'il n'y ait absolument aucune bulle et que toute la chambre soit recouverte. Si des bulles apparaissent, ajoutez du tampon ou du PBS supplémentaire. Sinon, les performances du tampon peuvent diminuer.

La collecte de données de liaison de haute qualité et peu denses est essentielle pour la réussite de cette procédure ; veillez donc à ce que les microscopes soient correctement focalisés et que les paramètres d'acquisition appropriés soient utilisés. Repérez une structure fluorescente d'intérêt à imager. Sélectionnez l'angle d'illumination souhaité.

Dans ce cas, un angle de prisme ou un angle fortement incliné est recommandé, car cela améliore le rapport signal sur bruit en minimisant la lumière hors foyer, ce qui est particulièrement bénéfique pour les échantillons cellulaires. Prenez une référence d'image à diffusion limitée de la structure avant l'acquisition en microscopie STORM. Augmentez le laser d'excitation à une puissance élevée correspondant à environ deux kilowatts par centimètre carré, tout en effectuant l'acquisition avec des réglages de caméra d'une exposition de 10 millisecondes et un temps de cycle d'environ 50 hertz ou images par seconde.

Une fois que les flores quadruples sont passées à un motif de clignotement clairsemé, collectez 10 000 images. Pour commencer cette reconstruction, ouvrez le fichier M RAINSTORM dans MATLAB et exécutez-le dans la fenêtre rainstorm.

Sélectionnez le fichier image à analyser à l’aide du bouton de navigation. Il doit s'agir d'un fichier TIF. Modifiez la largeur en pixels pour qu'elle corresponde aux données brutes du système de microscope utilisé pour acquérir les données.

Laissez les autres valeurs par défaut. Appuyez sur le bouton traiter les images et attendez jusqu'à l'apparition d'une image préliminaire. La durée du traitement dépendra de la taille du fichier, des caractéristiques de l'ordinateur et du nombre de liens candidats présents dans les données brutes.

Pour générer une image mise à jour en super-résolution, appuyez sur le bouton « ouvrir l'examinateur » et une deuxième fenêtre apparaîtra. Appuyez sur le bouton « ajuster le contraste » afin de modifier l'affichage de l'image selon vos préférences. Dans certains cas où l'image est très sombre, la valeur maximale devrait être réduite.

Utilisez la fenêtre de révision pour générer des métriques utiles d'évaluation de la qualité de l'image et affiner davantage l'image en super-résolution. Conservez les trois premiers paramètres de contrôle qualité aux valeurs par défaut de 5 000, 0,1 et 0,8 à 3,5 respectivement. Mettez à jour la valeur des comptes par photon.

Modifier la valeur seuil de précision de localisation afin d'obtenir un compromis entre l'optimisation de la localisation moyenne, la précision et le nombre de localisations. Dans l'image finale, des valeurs comprises entre 30 et 50 nanomètres sont recommandées, selon la qualité des données et de l'échantillon. Le facteur d'échelle par défaut de la reconstruction est de cinq, ce qui produira des pixels de super-résolution de 32 nanomètres, en supposant que le pixel dans les images d'origine mesure 160 nanomètres.

Si les images brutes ont une taille de pixel de 100 nanomètres, cela produira des images en super-résolution avec des pixels de 20 nanomètres. Augmentez le facteur d'échelle pour obtenir des pixels en super-résolution plus petits. Dans l'image finale, appuyez sur le bouton « exécuter l'examinateur » pour générer une image mise à jour en super-résolution.

Appuyez sur le bouton afficher les histogrammes pour visualiser les métriques de qualité de l'image. Enfin, appuyez sur le bouton enregistrer l'image dans le visualiseur afin de sauvegarder toutes ces données. Commencez cette procédure en générant une image de la même manière que précédemment démontré.

Appuyez sur le bouton de suivi de la zone dans le visualiseur, puis cliquez et faites glisser une zone autour du marqueur fiduciel sur l'image examinée. Attendez qu'une nouvelle image apparaisse, affichant les positions encadrées. Enregistrez cette image si vous le souhaitez, si l'objet d'intérêt est un marqueur fiduciel.

Comme c'est le cas ici, effectuez la correction de la dérive en cliquant sur le bouton définir l'ancrage, puis sur le bouton soustraire la dérive. Enfin, cliquez à nouveau sur exécuter l'examinateur pour générer une nouvelle image STORM. Un revêtement réussi de dextrine devrait produire une monocouche fluorescente et des données typiques de dextrine sont présentées dans cette figure.

Les images limitées par la diffraction montrent différentes concentrations de dextrine avant l'acquisition STORM. Les reconstructions en super-résolution ont une taille de pixel de 25 nanomètres. 10 000 images ont été collectées avec une taille de trame de 128 par 128 pixels, et des images individuelles issues de cette séquence sont présentées.

À une concentration élevée de dextrine. La monocouche fluorescente doit apparaître relativement uniforme, comme illustré sur ces images et ce segment vidéo. À des concentrations plus faibles, les clignotements apparaîtront plus espacés et en netteté.

Avec aucun fond apparent pendant cette phase d'acquisition d'images sous illumination laser constante, le nombre de clignotements diminue au fil du temps, comme le montre la comparaison entre l'image 2000 et l'image 8 000 dans l'échantillon à haute densité. La principale différence entre les images de super-résolution des concentrations élevée, moyenne et faible de dextrine réside dans le nombre décroissant de localisations. Ce graphique présente la moyenne de trois séquences de 10 000 images pour chaque concentration de dextrine, les barres d'erreur indiquant l'écart type.

Cependant, cette relation proportionnelle entre la concentration des molécules fluorescentes, le nombre de clignotements dans les données brutes et le nombre de localisations n'est pas une relation linéaire simple, comme le montre ce graphique du nombre de localisations acceptées par image. En utilisant une moyenne glissante sur 100 images à des densités moléculaires très élevées, le logiciel est incapable de localiser correctement les molécules lors de l'acquisition de n'importe quel échantillon. Un problème courant peut être la présence d'un halo fluorescent brillant mais flou s'étendant sur l'image, causé par la diffusion du fluoro dans le milieu.

On peut éviter ou éliminer ces molécules fluorescentes détachées en augmentant le nombre d'étapes de lavage avec du PBS avant d'ajouter le tampon de commutation ou en ajoutant du tampon de commutation frais à la chambre. Le traitement et la comparaison des données provenant de chaque séquence d'images produisent des images de super-résolution très différentes. Les panneaux C et D sont des reconstructions d'images de super-résolution correspondant aux données recueillies dans les panneaux A et B respectivement. Ce graphique représente le nombre de localisations acceptées par image, calculé à l'aide d'une moyenne glissante sur 100 images.

La ligne rouge correspond aux séquences d'orage A et C, où le fond est élevé, la ligne bleue correspond aux séquences B et D, où le fond est faible. Le nombre de localisations acceptées pour les images correspondant aux données à fond élevé et à fond faible est indiqué sur le deuxième graphique. Ces trois images limitées par la diffraction montrent des données typiques de filaments d'actine préformés fixés à la surface du verre avant l'ajout du tampon de commutation et de l'imagerie STORM.

Des filaments de longueurs variables peuvent être observés. Les filaments très brillants sont souvent constitués de plusieurs filaments emmêlés ensemble. La sélection de filaments individuels relativement brillants, plutôt que des zones emmêlées, permet d'obtenir des images de meilleure qualité pendant la phase d'acquisition.

Des clignotements nets et bien mis au point doivent être observés le long de la longueur du filament. Un clignotement clairsemé doit être observé pendant la phase d'acquisition, puis ultérieurement dans les données traitées. Il devrait y avoir un filament fin et continu dans les localisations par image, qui doit montrer une diminution progressive.

Typiquement, la largeur à mi-hauteur (FWHM) d'un filament est donnée comme estimation empirique de la résolution en traçant une ligne droite à travers une région agrandie du filament d'actine à l'aide de la fonction « profil d'intensité » dans ImageJ, puis en effectuant un ajustement gaussien. La FWHM est calculée à 43,2 nanomètres. Un problème de mauvaise localisation peut survenir lorsque plusieurs filaments d'actine se ramifient ou se croisent, en traitant des sous-ensembles d'images et en comparant les 5 000 premières et les 5 000 dernières images.

Une image différente est produite dans l'image en super-résolution en utilisant les 5 000 premières images. De nombreuses localisations sont visibles au centre de l'image. Toutefois, lorsqu'on utilise les 5 000 dernières images, très peu de ces localisations sont apparentes et seuls les filaments subsistent, bien qu'ils apparaissent partiellement continus en raison du faible nombre de localisations dans l'image.

Si une densité de clignotement trop élevée est suspectée, la comparaison des images avec les données de localisation par image peut fortement suggérer que ce problème se produit durant le premier ensemble d'images. On observe un nombre moyen de localisations par image supérieur à 10, contre environ quatre pour le dernier ensemble d'images. Un autre problème potentiel en microscopie STORM est la dérive, qui se produit lorsque l'échantillon se déplace par rapport à l'objectif pendant la phase d'acquisition des données. Bien qu'elle soit très difficile à détecter durant l'acquisition des images, la dérive peut être mise en évidence dans les images de super-résolution de structures connues, telles que les filaments d'actine.

Le premier signe indiquant qu'une dérive latérale a pu se produire est que la structure est plus grande que prévue. Par exemple, une largeur à mi-hauteur relativement importante par rapport aux données de limite de précision issues de l'orage, dans ce cas 90 nanomètres comparés à 67 nanomètres. Une meilleure méthode pour détecter la dérive consiste à comparer les localisations en fonction du temps, c'est-à-dire à vérifier si les localisations dans les images ultérieures sont décalées par rapport à celles des premières images.

Cela peut être clairement observé dans le cas des filaments d'actine lorsqu'ils sont affichés avec un code couleur. En utilisant la fonction de suivi de boîte dans rainstorm, comme illustré dans les panneaux B et C, les localisations sont affichées avec une couleur correspondant au numéro d'image auquel elles ont été acquises. Par exemple, les localisations provenant du début de la séquence d'acquisition sont en bleu, tandis que celles provenant de la fin de la séquence d'acquisition sont en rouge.

Les couleurs déplacées indiquent qu'une dérive s'est produite afin de la mesurer et de la corriger. Pour mesurer la dérive, des billes fluorescentes d'un diamètre de 100 nanomètres peuvent être utilisées comme marqueurs fiduciaux ; les numéros un à quatre montrent des billes recadrées et agrandies individuellement. Dans un exemple où une dérive relativement importante d'environ 100 nanomètres se produit sur une durée de trois minutes et 10 secondes pendant la phase d'acquisition, la même fonction de suivi de zone peut être utilisée pour coder la dérive en couleurs et la confirmer, puisque les quatre billes de cet exemple présentent une dérive quasi identique. Il est alors possible d'en sélectionner une — dans ce cas, la bille deux — comme référence, puis de soustraire la dérive des autres billes.

Une comparaison avec le panneau E montre que la dérive latérale a été corrigée. Enfin, des cellules HeLa marquées avec le facteur de croissance épidermique peuvent être utilisées pour fournir un exemple réaliste de résolution d'image. Dans les cellules, le panneau A montre une image limitée par la diffraction d'une partie d'une cellule HeLa focalisée au niveau de la surface basale de la cellule, où les boîtes jaunes indiquent les régions d'intérêt agrandies présentées dans les panneaux B et C, par opposition aux régions d'intérêt agrandies floues de l'image limitée par la diffraction.

Les images en super-résolution doivent montrer un mélange d'amas et occasionnellement des pixels isolés uniques. Les amas auront un diamètre d'environ 100 nanomètres et correspondent probablement à des fossettes et des vésicules en formation. Le chemin par lequel l'EGF est principalement régulé à la baisse et les localisations endocytées par image extraites du panneau D sont présentées dans le graphique G. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des échantillons de test simples, d'acquérir des données et de reconstruire des images de résolution STORM de haute qualité.

Ces méthodes permettront d'éviter certains pièges courants liés à l'ajustement, tels que la dérive, et aideront à optimiser votre storm. Voir les expériences de résolution.