Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment acquérir des images de tempête de haute qualité en super résolution. Pour ce faire, il faut d’abord préparer un échantillon de test marqué par fluorescence. La deuxième étape consiste à préparer le tampon de commutation, puis à remplir la chambre d’imagerie avec le tampon.

Ensuite, les données brutes sont acquises à l’aide d’un microscope orageux. La dernière étape consiste à reconstruire des images en super résolution à partir de données brutes à l’aide d’un logiciel de traitement des tempêtes de pluie. En fin de compte, les échantillons de test sont utilisés pour montrer comment acquérir des données brutes de haute qualité, qui peuvent ensuite être traitées pour générer des images de super résolution de tempête dans des cellules d’une résolution comprise entre 30 et 50 nanomètres, ce qui représente une amélioration de la résolution de cinq à dix fois supérieure à celle des techniques traditionnelles de microscopie à fluorescence, y compris les techniques de microscopie à fluorescence et confocale.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal parce qu’elles ne réalisent pas l’importance de collecter de nombreux liens clairsemés de haute qualité. Ceci est beaucoup plus facile en utilisant le colorant Alexa 6, 4, 7 dans le tampon de commutation correct. Une démonstration visuelle de cette technique est essentielle car l’acquisition de données brutes de haute qualité est essentielle pour produire des images de résolution SPR.

Les séquences vidéo brutes de cette technique sont complètement différentes de toute autre forme de microscopie à fluorescence. Commencer la procédure de revêtement du verre avec de la dextrine fluorescente à 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d’un verre de couverture à huit chambres et incuber pendant 10 minutes. Au bout de 10 minutes, prélever la solution de polylysine à l’aide d’une pipette pour s’assurer qu’aucun liquide ne reste dilué.

0,25 microlitre d’une solution mère de dextrine de deux milligrammes par millilitre. Alexa 6 47 dans 25 microlitres d’eau déminéralisée pour créer une solution de 20 microgrammes par millilitre pour créer un revêtement haute densité de dextrine. Alexa 6 47.

Diluez 20 microlitres de la solution de 20 microgrammes par millilitre dans un total de 200 microlitres d’eau déminéralisée. Pour une solution de densité moyenne, diluez deux microlitres dans 200 microlitres d’eau déminéralisée. Pour une solution de faible densité, diluer 0,2 microlitre.

Dans 200 microlitres d’eau déminéralisée, ajoutez 200 microlitres de la solution de dextrine diluée Alexis X 47 dans chaque puits et incubez pendant 10 minutes. Des temps d’incubation plus longs peuvent être utilisés, ce qui peut entraîner un revêtement de dextrine plus dense. Enfin, retirez les solutions Dexter Xis X 47 et lavez-les trois fois à l’eau.

Pour préparer d’abord des filaments d’actine fluorescents sur du verre, ajoutez 200 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % dans chaque puits d’une chambre à huit chambres. Couvrir le verre et incuber pendant 10 minutes. Retirer à l’aide d’une pipette pour s’assurer qu’il ne reste plus de liquide.

Ajouter à chaque chambre 90 microlitres de tampon d’actine général préalablement reconstitué selon les instructions du fabricant. Ajoutez ensuite 10 microlitres de 10 micromolaires de solution de filaments d’actine préformés et un microlitre de foid et d’Alexa 6 47 et pipetez doucement de haut en bas pour mélanger, incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour préparer des perles fluorescentes de microsphères comme marqueurs repères pour diluer un microlitre de billes de tepec dans 200 microlitres de PBS et mélangez. Ajoutez les billes diluées dans la chambre d’imagerie et attendez 15 minutes.

Après 15 minutes, retirez la solution et lavez-la trois fois avec du PBS avant d’imager des cellules cultivées à environ 80 % de fluidité sont utilisées dans cette expérience. Retirez le milieu de culture et lavez-le avec du PBS. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution de formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes.

Retirez le formaldéhyde et lavez trois fois avec du PBS. Ne laissez pas les cellules rester sèches et utilisez toujours des solutions tamponnées PBS. Pour éviter le stress hypotonique, ajoutez deux microlitres d’une solution mère de 50 microgrammes par millilitre d’EGF Alexa, 6 47 à 200 microlitres de solution BSA à 0,1 %, puis ajoutez cette solution aux cellules ela.

Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez la solution et lavez-la trois fois avec du PBS. Ajouter une solution bloquante à 0,1 % BSA et laisser reposer 15 minutes à température ambiante.

Après cela, retirez la solution de blocage et lavez-la encore trois fois avec du PBS avant l’imagerie. Juste avant l’imagerie, préparez le tampon de commutation en mélangeant l’enzyme glucose et les solutions mères d’agent réducteur Dans un rapport de 50 microlitres, 400 microlitres et 100 microlitres, ajoutez du PBS pour porter le volume final à un millilitre. Retirez le PBS de la chambre d’imagerie, puis remplissez-le jusqu’en haut avec le tampon de commutation.

Placez soigneusement une lamelle sur le dessus de la chambre, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles du tout et que toute la chambre est couverte. Si des bulles sont observées, remplissez avec un tampon supplémentaire ou PBS. Sinon, les performances de la mémoire tampon peuvent diminuer.

La collecte de données de liaison de haute qualité et éparses est essentielle au succès de cette procédure, alors assurez-vous que les microscopes sont correctement mis au point et que les bons paramètres d’acquisition sont utilisés. Localisez une structure fluorescente d’intérêt à imager. Sélectionnez l’angle d’éclairage souhaité.

Dans ce cas, un gazon ou un angle très incliné est recommandé car cela améliore le rapport signal/bruit en minimisant la lumière floue, ce qui est particulièrement avantageux pour les échantillons de cellules. Prenez une référence à une image limitée de la structure avant l’imagerie de la tempête. Augmentez le laser d’excitation à une puissance élevée correspondant à environ deux kilowatts par centimètre carré lors de l’imagerie avec des réglages de caméra de 10 millisecondes d’exposition et un temps de cycle d’environ 50 hertz ou images par seconde.

Une fois que les quatre de la flore se sont transformés en un motif de clignement clairsemé, collectez 10 000 images. Pour commencer cette reconstruction. Ouvrez le fichier RAINSTORM M depuis MATLAB et exécutez-le dans la fenêtre rainstorm.

Sélectionnez le fichier image à analyser à l’aide du bouton Parcourir. Il doit s’agir d’un fichier TIF. Modifiez la largeur des pixels pour qu’elle corresponde aux données brutes du système de microscope utilisé pour acquérir les données.

Laissez les autres valeurs par défaut. Appuyez sur le bouton Traiter les images et attendez qu’une image préliminaire apparaisse. La durée du traitement dépendra de la taille du fichier, de la spécification de l’ordinateur et du nombre de liens candidats dans les données brutes.

Pour générer une image super résolution mise à jour, appuyez sur le bouton Ouvrir le réviseur et une deuxième fenêtre apparaîtra. Appuyez sur le bouton de réglage du contraste afin de modifier l’affichage de l’image comme vous le souhaitez. Dans certains cas où l’image est très sombre, la valeur maximale doit être diminuée.

Utilisez la fenêtre de réviseur pour générer des mesures de qualité d’image utiles et affiner davantage l’image en super résolution. Laissez les trois premiers paramètres de contrôle qualité aux valeurs par défaut de 5 000, 0,1 et 0,8 à 3,5 respectivement. Mettez à jour le nombre de valeurs par photon.

Modifiez le seuil de précision de localisation pour trouver un compromis entre l’optimisation de la localisation moyenne, la précision et le nombre de localisation. Dans l’image finale, des valeurs de 30 à 50 nanomètres sont recommandées en fonction de la qualité des données et de l’échantillon. Le facteur d’échelle de reconstruction par défaut est de cinq, ce qui générera des pixels de super résolution de 32 nanomètres, en supposant que le pixel des images d’origine est de 160 nanomètres.

Si les images brutes ont une taille de pixel de 100 nanomètres, cela produira des images de super résolution avec des pixels de 20 nanomètres. Augmentez le facteur d’échelle pour produire des pixels de super résolution plus petits. Dans l’image finale, appuyez sur le bouton Exécuter le réviseur pour générer une image de super résolution mise à jour.

Appuyez sur le bouton Afficher les histogrammes afin d’afficher les mesures de qualité d’image. Enfin, appuyez sur le bouton d’enregistrement de l’image dans l’examinateur afin de sauvegarder toutes ces données. Commencez cette procédure en générant une image de la même manière que celle illustrée précédemment.

Appuyez sur le bouton de suivi de la boîte dans l’examinateur et cliquez et faites glisser une boîte sur le repère sur l’image examinée. Attendez qu’une nouvelle image apparaisse, qui affichera les positions encadrées. Enregistrez cette image si vous le souhaitez, si l’objet d’intérêt est un repère financier.

Comme c’est le cas ici, effectuez une correction de dérive en cliquant sur le bouton Définir l’ancre puis sur le bouton Soustraire la dérive. Enfin, cliquez à nouveau sur Exécuter le réviseur pour générer une nouvelle image de tempête. Un enrobage réussi de dextrine devrait produire une monocouche fluorescente et les données typiques de la dextrine sont illustrées dans cette figure.

Les images limitées par la diffraction montrent différentes concentrations de dextrine avant l’imagerie de la tempête. Les reconstructions à super résolution ont une taille de pixel de 25 nanomètres. 10 000 images ont été collectées avec une taille d’image de 1 28 x 1 28 pixels et des images individuelles sont montrées à partir de cette séquence.

À une concentration élevée de dextrine. La monocouche fluorescente doit apparaître relativement uniforme, comme illustré dans ces images et ce segment vidéo. À des concentrations plus faibles, les clignements apparaîtront plus clairsemés et plus nets.

En l’absence de fond évident pendant cette phase d’acquisition d’images à éclairage laser constant, le nombre de clignements diminuera avec le temps, comme l’illustre une comparaison entre l’image 2000 et l’image 8 000 dans l’échantillon à haute densité. La principale différence entre les images à super résolution des concentrations de dextrine élevées, moyennes et faibles est la diminution du nombre de localisations. Ce graphique montre une moyenne de trois séquences de 10 000 images de chaque concentration de dextrine où les barres d’erreur indiquent l’écart-type.

Cependant, cette relation proportionnelle entre la concentration des molécules fluorescentes, le nombre de clignotements dans les données brutes et le nombre de localisations n’est pas une simple relation linéaire, comme l’illustre ce graphique du nombre de localisations acceptées par image. En utilisant une moyenne mobile de 100 images à des densités de molécules très élevées, le logiciel n’est pas en mesure de localiser avec succès les molécules lors de l’imagerie d’un échantillon. Un problème courant peut être la présence d’une brume fluorescente brillante mais non focalisée sur l’image, causée par la diffusion de la force fluorescente à travers le support.

Ces molécules fluorescentes détachées peuvent être évitées ou éliminées en augmentant le nombre d’étapes de lavage avec le PBS avant l’ajout du tampon de commutation ou en ajoutant un nouveau tampon de commutation à la chambre, en traitant et en comparant les données de chaque séquence d’images, on obtient des images de super résolution très différentes. Les panneaux C et D sont des constructions d’imagerie à super résolution correspondant aux données collectées dans les panneaux A et B respectivement. Ce graphique représente le nombre de localisations acceptées par image à l’aide d’une moyenne glissante de 100 images.

La ligne rouge correspond à la séquence de tempêtes A et C où l’arrière-plan est élevé, la ligne bleue correspond à B et D où l’arrière-plan est faible. Le numéro de localisation accepté pour les images correspondant aux données d’arrière-plan hautes et basses est indiqué dans le deuxième graphique. Ces trois images limitées par diffraction montrent des données typiques de filaments d’actine préformés collés à la surface du verre avant l’ajout d’un tampon de commutation et l’imagerie de tempête.

Des longueurs variables de filaments peuvent être observées. Les filaments très brillants sont souvent plusieurs filaments enchevêtrés ensemble. La sélection de filaments uniques relativement brillants plutôt que de zones enchevêtrées permet d’obtenir des images de meilleure qualité pendant la phase d’acquisition.

Des clignements lumineux doivent être visibles sur toute la longueur du filament. Un clignotement épars doit être visible pendant la phase d’acquisition et par la suite dans les données du processus. Il devrait y avoir un mince filament continu dans les localisations par image devrait montrer un déclin progressif.

Typiquement, le plein avec le demi-maximum ou FWHM d’un filament est donné comme une estimation empirique de la résolution en traçant une ligne droite à travers une région zoomée du filament d’actine à l’aide de la fonction de profil de tracé de l’image J et en effectuant ensuite un ajustement gaussien. Le FWHM est calculé à 43,2 nanomètres. Un problème de mauvaise localisation peut se produire lorsqu’un certain nombre de filaments d’actine se ramifient et/ou se croisent en traitant des sous-ensembles de trames et en comparant les 5 000 premières et les 5 000 dernières.

Une image différente est produite dans l’image en super résolution à l’aide des 5 000 premières images. De nombreuses localisations sont visibles au milieu de l’image. Cependant, lorsque l’on utilise les 5 000 dernières images, très peu de ces localisations sont apparentes et seuls les filaments sont laissés, bien qu’un peu continus, en raison du faible nombre de localisations dans l’image.

Si l’on soupçonne une densité de clignotement trop élevée, la comparaison des images avec les données de localisation par image peut fortement suggérer que ce problème se produit lors de la première série d’images. Il y a un nombre moyen de localisations par trame de plus de 10 par rapport au dernier ensemble de trames où il est d’environ quatre. Un autre problème potentiel en microscopie tempête est la dérive, qui se produit lorsque l’échantillon se déplace par rapport à la lentille objective Au cours de la phase d’acquisition de données, bien que très difficile à détecter pendant la phase d’acquisition d’images, la dérive peut être détectée dans les images à super résolution de structures connues telles que les filaments d’actine.

Le premier signe qu’une dérive latérale a pu se produire est que la structure est plus grande que prévu. Par exemple, avec un plein relativement grand avec un demi-maximum par rapport aux données limites de précision d’un orage, dans ce cas 90 nanomètres contre 67 nanomètres. Une meilleure façon de détecter la dérive est de comparer les localisations en fonction du temps, c’est-à-dire pour voir si les localisations dans les images ultérieures sont déplacées par rapport à celles des premières images.

Cela peut être clairement vu dans le cas des filaments d’actine lorsqu’ils sont affichés avec un code couleur. En utilisant la fonction de suivi de boîte dans Rainstorm, comme indiqué dans les panneaux B et C, les localisations sont affichées avec une couleur correspondant au numéro de cadre de leur acquisition. Par exemple, les localisations du début de la séquence d’acquisition sont bleues tandis que les localisations de la fin de la séquence d’acquisition sont rouges.

Les couleurs déplacées indiquent qu’une dérive s’est produite afin de mesurer et de corriger. Pour la dérive, des perles fluorescentes de 100 nanomètres de diamètre peuvent être utilisées comme repères : les numéros un à quatre montrent les perles recadrées et zoomées individuellement. Dans un exemple où il y a une dérive relativement sévère d’environ 100 nanomètres sur une période de trois minutes et 10 secondes pendant la phase d’acquisition, la même fonction de suivi de boîte peut être utilisée pour coder en couleur et confirmer que la dérive s’est produite car les quatre perles de cet exemple montrent une dérive presque identique, il est possible de sélectionner l’une d’entre elles dans ce cas la perle deux à utiliser comme référence et à soustraire la dérive des autres perles.

Une comparaison avec le panneau E montre que la dérive latérale a été corrigée. Enfin, les cellules heela colorées au facteur de croissance épidermique peuvent être utilisées pour donner un exemple réaliste de résolution d’image. Dans les cellules, le panneau A montre une image limitée par la diffraction d’une partie d’une cellule hela focalisée à la surface de la cellule basale, où les cases jaunes indiquent les régions d’intérêt zoomées affichées dans les panneaux B et C, contrairement aux régions d’intérêt zoomées indistinctes dans l’image limitée par diffraction.

Les images en super résolution doivent montrer un mélange de clusters, parfois isolés, de pixels uniques. Les amas auront un diamètre d’environ 100 nanomètres et sont susceptibles de correspondre à des fosses et des vésicules en formation. La voie par laquelle l’EGF est principalement régulé à la baisse et les localisations endocytosées par image des données du panneau D sont présentées dans le graphique G.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire des échantillons de test simples, d’acquérir des données et de reconstruire une tempête de haute qualité, voir des images de résolution.

Ces méthodes vous aideront à éviter certains pièges courants tels que la dérive et à optimiser votre tempête. Voir expériences de résolution.