Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

L’objectif principal de ce manuscrit est de présenter une procédure d’imagerie de la microscopie tirf à base de puces photoniques nouvellement développée et de la microscopie de localisation à molécule unique, comme dSTORM. Le composant principal ici est la puce photonique qui sont faites de série de guide optique d’onde. La lumière à l’intérieur du guide d’ondes optique est guidée en fonction de la réflexion interne totale.

Une partie de la lumière est présente à la surface sous forme d’ondes évanescentes. Ces ondes évanescentes, elles se décomposent exponentiellement loin de la surface, avec une profondeur de pénétration de quelques centaines de nanomètres. Cela les rend adaptés à l’éclairage TIRF.

L’éclairage TIRF via le guide d’ondes optique est disponible sur une zone extrêmement grande, définie par la géométrie du guide d’ondes, et est donc idéale pour l’imagerie à haut débit. La principale différence entre une configuration TIRF traditionnelle et dSTORM par rapport à notre approche est que nous utilisons une puce photonique pour éclairer l’échantillon, au lieu d’envoyer de la lumière à travers une lentille objective d’imagerie. Notre approche découple l’éclairage et la partie lumière de la collection, ouvrant de nouvelles possibilités d’imagerie.

Placer la puce dans la boîte de Pétri en verre à l’aide d’une pince à gaufrettes, et couvrir complètement avec une solution Hellmanex de 1%. Déposer la boîte de Pétri sur une plaque chauffante à 70 degrés pendant 10 minutes. Alors qu’il est encore sur la plaque chauffante, frotter la surface avec un écouvillon de tissu cleanroom.

Retirer la puce de la boîte de Pétri. Rincer avec au moins 100 millilitres d’eau déionnée. Rincer avec au moins 100 millilitres d’isopropanol, en prenant soin que le solvant ne sèche pas à la surface pour éviter les taches d’évaporation.

Rincer avec au moins 100 millilitres d’eau déionnée. Faites sécher la puce à l’arme à azote. Préparer un plus tard de 150 micromètres PDMS en le faisant tourner dans une boîte de Pétri.

Utilisez un scalpel pour couper un cadre d’environ 1,5 par 1,5 centimètre de la couche PDMS. Soulevez le cadre de la boîte de Pétri à l’aide d’une pince à épiler. Déposez-le à plat sur une puce propre et polie.

L’échantillon est maintenant prêt pour l’ensemencement cellulaire. Après l’ensemencement cellulaire, retirez la puce du média. Utilisez un tuyau pour enlever tout excès de liquide de l’extérieur de la chambre PDMS.

Retirez le liquide actuel de l’intérieur de la chambre PDMS à l’aide d’un pipet tout en ajoutant environ 60 microlitres propres PBS en même temps. Remplacez le PBS par 60 microlitres propres PBS, et laissez-le incuber pendant une minute. Répétez l’étape précédente, en la laissant incuber pendant cinq minutes cette fois.

Retirez le PBS et remplacez-le par 60 microlitres de la solution de teinture. Laissez l’échantillon couver pendant environ 15 minutes, le protégeant de la lumière. Lavez l’échantillon avec du PBS en utilisant la procédure décrite précédemment.

Retirez le PBS et remplacez-le par 40 microlitres du tampon d’imagerie en même temps. Placez un coverslip sur le dessus, empêchant les bulles d’air de se former en dessous. Appuyez doucement sur le coverslip contre la chambre d’imagerie pour enlever tout excès de médias.

Utilisez un tuyau pour enlever tout excès de médias à l’extérieur du coverslip. Nettoyez la zone à l’extérieur du couvercle à l’aide d’un écouvillon humide pour éviter les cristaux formés par des résidus de supports d’immersion séchés. Cette version de la configuration se compose de trois composants principaux.

Le microscope avec le porte-filtre, la source de lumière blanche, la caméra et le revolver objectif. Le stade de couplage, qui est un stade piezo à trois axes, avec un laser couplé à la fibre, et une lentille de couplage. L’étape de l’échantillon, qui est une étape manuelle à un axe, avec pointe et inclinaison, avec un support de vide.

Le couplage et le stade de l’échantillon sont montés sur une scène motorisée à deux axes pour la traduction de l’échantillon. Placez la puce sur le camion à vide, avec la facette de couplage vers l’objectif de couplage. Assurez-vous que la puce se trouve à environ une longueur focale de l’objectif de couplage.

Allumez la pompe à vide. Allumez le laser à un milliwatt. Ajustez grossièrement la hauteur de la puce de sorte que le faisceau frappe le bord de celui-ci.

Éteignez le laser. Allumez la source de lumière blanche. Choisissez une lentille objective à faible grossissement, par exemple, un 10x.

Concentrez le microscope sur un guide d’ondes. Traduisez le microscope le long du guide d’ondes pour voir s’il est bien aligné avec le chemin optique. Déplacez le microscope vers le bord de couplage.

Allumez le laser à un milliwatt ou moins. Traduisez le microscope le long du bord de couplage pour trouver la lumière laser. Concentrez le faisceau sur le bord de la puce.

Ajustez l’étape de couplage le long de la trajectoire optique dans la direction qui réduit la taille du faisceau laser jusqu’à ce qu’il disparaisse. Le faisceau est maintenant au-dessus ou au-dessous de la surface de la puce. Ajustez la hauteur du stade de couplage jusqu’à ce que la tache du faisceau réapparaisse et soit maximisée.

Répétez les deux étapes précédentes jusqu’à ce que le laser forme un endroit ciblé. Déplacez l’endroit ciblé vers le guide d’ondes d’intérêt. Traduisez le microscope à une courte distance du bord de sorte que la tache de faisceau focalisée ne soit plus visible.

Éteignez la lumière blanche. Ajustez le contraste. Si le guide d’onde guide, la lumière éparse le long du guide d’onde doit être clairement visible.

Ajustez l’axe de l’étape de couplage pour maximiser l’intensité lumineuse dispersée. Éteignez le laser. Allumez la lumière blanche.

Ajustez le contraste si nécessaire. Accédez à la région d’imagerie. Concentrez-vous avec l’objectif d’imaginer désiré.

Éteignez la lumière blanche. Insérez le filtre de fluorescence et tournez la puissance laser à un milliwatt. Réglez le temps d’exposition de la caméra à environ 100 millisecondes.

Ajustez le contraste au besoin. Assurez-vous que le couplage est toujours optimisé. Localisez une région d’intérêt pour l’imagerie.

Allumez la scène piezo en boucle pour faire la moyenne des nœuds. Capturez au moins 300 images. Chargez la pile d’images capturée aux Fidji à l’aide d’une pile virtuelle.

Dans le menu d’images aux Fidji, choisissez Stacks et Z Project. Calculez l’image TIRF en choisissant le type de projection, intensité moyenne. Allumez le laser à un milliwatt, et réglez le temps d’exposition de la caméra à 30 millisecondes.

Ajustez le contraste et concentrez-vous. Augmentez la puissance du laser jusqu’à ce que le clignotement soit observé. Zoomez sur une petite région de l’échantillon.

Ajustez le contraste. Capturez quelques images pour voir si les clignotements sont bien séparés. Réglez le temps d’exposition de la caméra pour un clignotement optimal.

Allumez la scène piezo en boucle. Enregistrez une pile d’images d’au moins 30 000 images, selon la densité clignotante. Ouvrez Fidji, et chargez la pile dSTORM sous forme d’images virtuelles.

Ajustez le contraste si nécessaire. Utilisez l’outil rectangle pour sélectionner la zone que vous souhaitez reconstruire. Analyse open run dans le plugin ThunderSTORM aux Fidji.

Définissez les paramètres de base de la caméra dans ThunderSTORM, correspondant à votre appareil. Les paramètres par défaut restants sont généralement satisfaisants. Commencez la reconstruction.

La liste de localisation fournie par le logiciel de reconstruction est filtrée pour supprimer les localisations non spécifiques. Une correction supplémentaire de la dérive est appliquée si nécessaire. La principale différence entre l’imagerie à base de puces et l’imagerie traditionnelle réside dans l’instrumentation et l’acquisition de données.

La qualité des images reconstituées peut donc être évaluée de la même manière qu’une image à partir d’un microscope commercial à super résolution. Étant donné que les guides d’ondes multi-mode sont utilisés, l’image qui en résulte peut toutefois présenter une excitation inhomogène si trop peu d’images sont collectées. Ceci est indiqué dans le panneau a.

L’augmentation de la quantité de modèles d’excitation devrait entraîner une excitation inhomogène, comme le montre le panneau b. Ici nous avons la cellule endothéliale sinusoïdale de foie imaged, avec la membrane fluorescente-étiquetée de plasma. Les panneaux a et b sont des images limitées en diffraction.

Le panneau c montre une image limitée par diffraction de l’encart dans le panneau b. Le panneau d montre une image dSTORM de la même région. Les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques ont des fenestrations de taille nanométrique dans leur membrane plasmatique, qui sont clairement visibles dans l’image de superré résolution dans le panneau d.

L’un des principaux avantages de l’imagerie à super résolution à base de puces est le vaste champ de vision réalisable. Le panneau a montre une image dSTORM de 500 microns par 500 microns de cellules endothéliales sinusoïdiennes hépatiques avec microtubulin fluorescente-étiquetée. Le panneau b montre l’encart magenta du panneau a, avec des images à la fois limitées en diffraction et super-résolution à comparer.

Le panneau c montre l’encart vert du panneau a. La résolution de l’image capturée est de 77 nanomètres. Dans cette vidéo, nous avons effectué un grand champ de vision TIRF et dSTORM imagerie des cellules endothéliales sinusoïdes hépatiques à l’aide d’une puce photonique pour l’illumination.

Notre méthode est moins complexe, plus compacte et plus flexible que la façon conventionnelle d’effectuer le TIRF à l’aide d’un objectif microscope d’une ouverture numérique prédéterminée et d’un champ de vision bas. La microscopie de localisation, telle que dSTORM, est l’une des plusieurs techniques d’imagerie à super résolution que nous avons explorées à l’aide de puces photoniques. Par exemple, la lumière peut être beaucoup plus étroitement confinée à l’intérieur d’un matériau optique à indice de haute réfractivité qu’il n’est possible d’utiliser une lentille objective d’imagerie.

Cette propriété de l’éclairage de puce a trouvé l’application en augmentant la résolution de la méthode optique de microscopie intensité-fluctuation-basée et de la microscopie structurée d’illumination. En outre, les puces photoniques bénéficient également de la miniaturisation, de la rentabilité et d’une configuration optique simple. Le fait d’être une technologie intégrée le rend compatible avec d’autres fonctions optiques sur puce.

Dans l’ensemble, cela permet de se transformer en microscopes conventionnels à diffraction limitée, permettant une super-résolution à faible coût.