Microscopie de localisation à une seule molécule des protéines membranaires utilisant le marquage à anticorps unique

Mes recherches portent sur la membrane des lymphocytes T et visent à révéler de nouvelles perspectives à l’échelle nanométrique pertinentes pour le ciblage thérapeutique. Les méthodes d’imagerie existantes ne visualisent généralement pas directement les interactions anticorps-épitope à l’échelle nanométrique dans les cellules. Ce protocole surmonte cette limitation en permettant une observation directe dans l’environnement cellulaire.

Après avoir monté l’échantillon sur le microscope et déposé des colloïdes d’or à la surface, utilisez un éclairage en champ clair pour vérifier qu’un nombre suffisant de colloïdes ont été déposés dans la région d’intérêt. Vérifiez que la densité idéale de 5 à 10 colloïdes d’or est présente dans la zone d’intérêt avant de procéder. Pour la configuration optique du fluorophore de la sonde anticorps, ouvrez le logiciel d’imagerie et accédez aux paramètres de configuration optique.

Sélectionnez le miroir dichroïque approprié et réglez la longueur d’onde et la densité de puissance d’excitation du laser. Ajustez le temps d’intégration de la caméra et sélectionnez le filtre d’émission. Ensuite, réglez le binning de pixels de l’appareil photo pour atteindre une taille de pixel de 150 à 160 nanomètres.

Maintenant, créez une configuration optique pour l’étape de décoloration photo en sélectionnant un mode de décoloration photo dans le logiciel d’imagerie. Réglez la puissance du laser à 100 % et ajustez le temps d’intégration de la caméra à une seconde. Définissez les paramètres d’imagerie dans le logiciel d’acquisition d’image en définissant l’intervalle de non-éclairage, le nombre de frames et la fréquence de l’étape de blanchiment photo.

Ensuite, préparez le tampon d’imagerie en diluant l’anticorps CD81 à une concentration de 1 microgramme par millilitre dans 200 microlitres de 5 % BSA produits dans le DPBS. La concentration finale recommandée d’anticorps est de 0,5 nanomolaire pour les lymphocytes T de Jurkat, ou de 2 nanomolaires pour les cellules U-2 OS. Ajoutez le tampon d’imagerie préparé au puits contenant les cellules et lancez l’acquisition d’image dans le logiciel pour commencer la collecte des données.

Utilisez la fonction de vue en direct dans le logiciel d’imagerie configuré pour le marquage à anticorps unique de membrane afin de surveiller la liaison des anticorps en temps réel. Configurez les paramètres d’imagerie dans le logiciel d’acquisition d’image pour obtenir au moins 10 images et réglez l’intervalle non éclairé à cinq secondes. Commencez l’acquisition et évaluez la rareté des localisations de molécules individuelles dans le film enregistré.

Si plusieurs événements de liaison d’anticorps chevauchants sont observés immédiatement après l’ajout du tampon d’imagerie, ou si des localisations de molécule unique s’accumulent au fil du temps, l’acquisition est annulée. Réduisez la concentration d’anticorps de deux fois et répétez l’acquisition sur un nouvel échantillon. Continuez à doubler la concentration d’anticorps et réévaluez le nombre d’événements par unité de surface jusqu’à atteindre la densité de localisation d’une seule molécule souhaitée.

Si la densité d’événements est faible, doublez la concentration d’anticorps dans le tampon d’imagerie. Répétez l’acquisition sur un nouvel échantillon et continuez à doubler la concentration d’anticorps tout en réévaluant le nombre d’événements de liaison par unité de surface jusqu’à atteindre la densité de localisation souhaitée d’une seule molécule. Pour l’optimisation des intervalles non éclairants, configurez les paramètres d’imagerie dans le logiciel d’acquisition d’image afin d’obtenir une acquisition sur 50 images.

Après avoir ajouté l’anticorps et commencé l’acquisition, évaluer la densité et la rareté des localisations de molécules uniques dans le film enregistré. Déterminer l’intervalle non éclairant le plus bas qui donne une densité d’événements unique optimale. Enfin, si des événements de liaison qui se chevauchent spatialement surviennent au fil de l’acquisition de l’image, introduire une étape de blanchiment photo à intervalles réguliers.

Ajustez la fréquence de photoblanchiment afin que la fluorescence des anticorps liés ne soit éliminée avant que les événements superposés ne s’accumulent. Définir le chemin du fichier dans le logiciel MATLAB vers le dossier contenant le fichier de valeurs séparées par virgules de la cellule M reconstruit. Exécutez le code en cliquant sur Exécuter dans la barre d’outils MATLAB.

Lorsque vous le demandez, sélectionnez le fichier CSV de la cellule M et cliquez sur Ouvrir pour le charger dans le programme. Effectuez l’analyse en utilisant les entrées précédemment définies comme point de départ. Évaluation du schéma de points contenant les données de localisation non regroupées.

Choisissez une valeur minimale en points supérieure au nombre de localisations de bruit mais inférieure au nombre de localisations sur la cellule. Évaluez la fenêtre qui représente les données regroupées. Confirmez que les grappes sont maintenues sur la cellule avec le phénotype attendu tandis que les localisations à l’extérieur de la cellule sont minimisées.

Si les paramètres de regroupement sont trop restrictifs, diminuez la valeur minimale en points et augmentez l’epsilon. Si les paramètres de regroupement sont trop inclusifs, augmentez la valeur minimale en points et diminuez l’epsilon. Enfin, après avoir ajusté la valeur minimale en points et l’epsilon, relancez le code pour obtenir un clustering optimal.

Les lymphocytes T de Jurkat ont été immobilisés avec un espacement suffisant pour préserver l’intégrité de la membrane et permettre à des anticorps d’accéder aux épitopes membranaires. Les colloïdes dorés ont été visualisés et utilisés comme marqueurs fiduciaux pour la correction de dérive latérale lors de l’acquisition de l’image des cellules M. L’optimisation de l’intervalle sans illumination a montré qu’un intervalle de cinq secondes produisait des événements de liaison des anticorps avec un chevauchement spatial minimal, comparé à des intervalles plus courts ou plus longs à une concentration nanomolaire d’anticorps.

L’application de la correction de dérive a amélioré l’image de la cellule M reconstruite par rapport à la reconstruction non corrigée. Le regroupement basé sur la densité des localisations des cellules M a réduit les interactions de fond à faible densité et mis en lumière les événements de liaison CD81 regroupés. Nous pouvons observer l’interaction des anticorps avec leurs épitopes membranaires dans un environnement cellulaire, fournissant des informations pertinentes sur les anticorps thérapeutiques.

La concentration d’anticorps, l’intervalle de non-illumination et les étapes de photoblanchiment sont essentielles à optimiser. Des paramètres sous-optimaux compromettront les résultats. Le marquage à anticorps unique peut être étendu pour évaluer simultanément la liaison des protéines membranaires par plusieurs anticorps dans le même environnement cellulaire.