对于电感受的制备快速协议大肠杆菌和霍乱弧菌

该程序的总体目标是在同一天快速方便地产生感受态细菌。他们需要转型。这是通过首先将细菌铺板在 LB 琼脂上并孵育 4 到 6 小时来实现的。

接下来，小心地从琼脂表面收获细菌草坪，并将沉淀重悬于无菌冷水或缓冲液中。然后将细菌沉淀在 4 摄氏度下洗涤 3 次，并重悬于 40 μL 中。最后，感受态细胞在 DNA 存在下进行电穿孔。

最终，可以获得的结果显示细菌转化水平与使用需要大量设备、大量细菌培养物和无菌缓冲液的传统方法获得的水平相当。与现有方法相比，该技术的主要优点是，在计划转化的同一天，几乎可以从任何实验室菌株中制备新鲜的、有能力的细菌，而无需大型离心机、转子或无菌缓冲液和培养物的领导者通常，这种方法的新手不会很费劲，因为这只是细菌学实验室中常用的技术的捷径变体。无法确定该协议的发起者，因为随着时间的推移，许多研究人员已经使用和优化了它。

这里介绍的方法已经在我们的实验室中使用了近二十年，我们的目标是与我们的同行分享这个有用的方案。这种方法的视觉演示对于一步很重要。特别是，从螺旋钻上的草坪上收集细菌，因为它需要经验的眼睛来评估板上的生长。

这是最直观的。演示该程序的是加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学 Te Koski 博士实验室的研究助理 Theresa Brooks 女士。I 在下午晚些时候开始细菌培养物制备，使用少量大肠杆菌或 v coray 在无菌 bo 硅酸盐玻璃试管中接种 1 至 5 毫升高压灭菌器 LB 肉汤。

将接种的试管放在滚轮滚筒中，并在 37 摄氏度和高速下孵育过夜。用本生灯的火焰加热玻璃棒的中间，直到玻璃变软，用玻璃棒准备一个曲棍球棒形状的细胞撒布器。然后用镊子或钳子轻轻地将弯曲方向引导成 135 度角。

在末端和第一个弯曲之间的中点再次加热杆，并将其向内弯曲 45 度。准备含抗生素和不含抗生素的 lb 通气剂，并在 4 摄氏度下储存。第二天早上。

将 100 μL 过夜培养物接种到每个 LB 琼脂平板上。使用细胞铺展器，将板在 37 摄氏度下孵育 4 到 6 小时，或直到看到细菌生长的薄草坪。使用接种环从板中收获直径约 2 毫米的细菌团，然后复苏，将其悬浮在 1 毫升冰冷的细菌中。

2 毫摩尔氯化钙。如果使用 v coray 或无菌双蒸水治疗大肠杆菌，并使用设置为 4 摄氏度的冷冻离心机，则以 5， 000 Gs 离心悬浮液 5 分钟。去除最终上清液复苏后，将沉淀悬浮在 40 微升氯化钙或双蒸水中并保持在冰上。

要进行转化，请将最多 1 μg 血浆 DNA 添加到 40 μL 细菌悬液中，然后将混合物转移到预冷无菌的 0.2 cm 间隙中。将 Vete 插入脉冲控制模块的电穿孔室，并以 1.8 KB 和 25 微ph 的电压进食。时间常数应约为 5.0 毫秒，并且不应发生电弧。

将细胞快速重悬于一毫升 LB 肉汤中，并转移到先前高压灭菌的烤玻璃试管中。在 37 摄氏度的充气生长条件下孵育 30 分钟，无需选择抗生素，让细胞恢复。将细菌接种在含有抗生素的 LB ager 板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。

如此处所示，我们用大肠杆菌和 V co 阵列进行了一组转化，以比较我们的快速方法与最初由 Doer 等人描述的用于制备电感受态细菌的传统方法的改造效率。转化体产量在每 μg DNA 范围内的第 6 到 10 个 CFU 到 10 之间，在大肠杆菌和弧菌的 3 个重复实验中。使用传统方法进行电能。

细胞制备，在使用快速方法对大肠杆菌和弧菌进行三次重复实验中，转化体产量似乎降低 10 倍至每 μg DNA 10 至 10 至 5 倍，至 10 至 6 CFU/μg DNA。出于这个原因，我们通过将转化的 CFU 除以从其他相同批次的感受态细胞的模拟转化中回收的 CFU 数量来确定转化细菌的百分比。转化细菌的百分比在 1 个对数以内。

无论制备方法和物种转化如何。这些结果表明，快速方法的效率与传统的较长制备感受态细胞的程序相当，并且 IEO、Coray 和 esia coli 的代表性菌株同样适用于快速程序。一旦掌握，这项技术可以在 5 到 6 小时内完成，并正确执行。

在尝试此程序时，重要的是要记住在细菌生长的对数期收获细菌，在无菌、新鲜制备和预冷的缓冲水溶液中洗涤它们，并保持低温，直到通过电穿孔后重悬于 LB 中。观看本视频后，您应该对如何在实验室中快速生成电感受态细菌菌株特异性细胞有一个很好的了解，方法是在初始草坪上培养它们，在生长的对数期收集它们，然后在冷缓冲液中洗涤它们，为电穿孔做准备。