快速制备电转感受态Escherichia coli和Vibrio cholerae的实验方案

本实验的总体目标是快速、便捷地在同一天内制备出感受态细菌，用于转化实验。首先将细菌接种于LB琼脂平板上，培养4至6小时即可实现这一目的。

接下来，从琼脂表面小心收集细菌菌苔，并将菌体沉淀重悬于无菌冷水中或缓冲液中。然后，在4°C条件下将细菌沉淀洗涤三次，并重悬于40 µL溶液中。最后，在DNA存在的情况下对感受态细胞进行电穿孔转化。

最终可获得与传统方法相当的细菌转化水平结果，而传统方法需要大量设备、大体积的细菌培养物以及无菌缓冲液。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可在计划进行转化的当天，几乎从任何实验室菌株直接制备新鲜的感受态细菌，无需使用大型离心机、转子，也无需大量无菌缓冲液和培养物。通常情况下，初次使用该方法的人员也不会遇到较大困难，因为这只是细菌学实验室中常用技术的一种简化变体。由于该方案已被众多研究人员长期使用并不断优化，其原始发明者已无法确定。

本文所述方法已在我们的实验室中使用了近二十年，我们旨在与同行分享这一实用的实验方案。其中有一个步骤尤其需要通过视觉演示来展示，即从平板培养基的菌苔上用取样螺杆收集细菌，因为评估平板上菌落的生长状况需要一定的经验。

这一点通过可视化展示最为清晰。本次演示由加拿大艾伯塔大学埃德蒙顿分校Dr. Te Koski实验室的研究助理Theresa Brooks女士进行。我通常在傍晚开始细菌培养的准备工作，使用少量大肠杆菌（E. coli）或V. coraly（v coray）接种1至5毫升经高压灭菌的LB液体培养基，培养基置于无菌硼硅酸盐玻璃试管中。

将接种后的试管放入滚轴摇床中，在37摄氏度下高速振荡培养过夜。取一根玻璃棒，在本生灯火焰上加热其中部，直至玻璃变软，制成形似曲棍球棒的涂布棒。然后用镊子或钳子轻轻将其弯曲成135度角。

再次在末端与第一个弯曲点之间的中点处加热玻璃棒，并将其向内弯曲成45度角。制备含有和不含抗生素的LB培养基，置于4°C保存。次日早晨。

将100微升过夜培养物接种到每个LB琼脂平板上。使用细胞涂布器，在37摄氏度下孵育平板4至6小时，或直至出现可见的薄层细菌生长。使用接种环从平板上挑取直径约2毫米的细菌菌团，并将其重悬于1毫升冰预冷的溶液中。

2 毫摩尔氯化钙。若使用 v coray 或用于大肠杆菌的无菌双蒸水，在 4 摄氏度预冷的离心机中以 5,000 G 离心 5 分钟。弃去上清液，并重复洗涤两次。除去最后一次上清液后，将沉淀重悬于 40 微升氯化钙或双蒸水中，并置于冰上保存。

进行转化时，将不超过一微克的质粒DNA加入40微升的细菌悬液中，混匀后转移至预冷的无菌0.2厘米间隙电转杯中。将电转杯插入脉冲控制模块的电穿孔腔室，以1.8千伏和25微法进行电击。时间常数应约为5.0毫秒，且不应出现电弧现象。

将细胞在1毫升LB肉汤中迅速重悬，并转移至预先经高压灭菌的玻璃试管中。在37摄氏度、有氧培养条件下孵育30分钟，期间不加抗生素进行筛选，使细胞恢复生长。将细菌涂布于含抗生素的LB琼脂平板上，于37摄氏度过夜培养。

如图所示，我们利用大肠杆菌（e coli）和 V co array 进行了一系列转化实验，以比较本研究建立的快速方法与传统电转化感受态细菌制备方法（最初由 Doer 等人描述）在转化效率上的差异。在三次重复实验中，采用传统电转化感受态方法时，大肠杆菌和 v coray 的转化子产量均达到每微克 DNA 10⁶ 至 10⁷ CFU 的范围。

细胞制备过程中，采用快速方法在三次重复实验中，大肠杆菌（e coli）和v coray的转化子产量均下降了十倍，达到每微克DNA 10的5次方至10的6次方个菌落形成单位（CFUs）。因此，我们通过将转化后的菌落形成单位数除以相同批次感受态细胞在空白转化实验中回收的菌落形成单位数，计算出转化细菌的百分比。转化细菌的比例在1个数量级范围内。

无论采用何种制备方法或转化物种，这些结果均表明，快速方法的效率与制备感受态细胞的传统较长时间方法相当，且 ieo、coray 和 esia coli 的代表性菌株均同样适用于该快速流程。掌握此技术后，可在五至六小时内完成操作，且需规范执行。

在进行该实验操作时，务必记住要在细菌生长的对数期进行收集，使用无菌、新鲜配制并预冷的缓冲水溶液洗涤细菌，并在电穿孔前始终保持其处于低温状态，直至在LB培养基中重悬。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在实验室中快速制备电转感受态的细菌菌株特异性细胞，具体步骤包括在初代菌苔上培养细菌，在其对数生长期收集菌体，随后用低温缓冲液洗涤，为电穿孔做好准备。