Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Cette expérience de microscopie à fluorescence évalue la viabilité des bactéries individuelles associées aux cellules hôtes et détermine la viabilité bactérienne dans différents emplacements subcellulaires. Tout d’abord, pour identifier les bactéries externes, exposez les cellules infectées à un réactif fluorescent spécifique à la perméase bactérienne, l’hôte infecté en présence de colorants fluorescents qui distinguent les bactéries viables des bactéries non viables en fonction de l’intégrité de la membrane bactérienne. Ensuite, pour indiquer où se trouvent les bactéries à l’intérieur des cellules hôtes, incubez les cellules infectées avec un anticorps couplé par fluorescence à un marqueur d’intérêt.

Les images immunofluorescentes qui en résultent peuvent déterminer le pourcentage de bactéries viables à l’intérieur et à l’extérieur des cellules hôtes, ainsi que la localisation subcellulaire des bactéries intracellulaires viables par rapport aux bactéries intracellulaires non viables. Contrairement aux tests de numération des colonies, aux tests de protection contre la gentamycine et à la microscopie électronique, cette méthode permet d’évaluer directement la viabilité des bactéries individuelles. Il peut également révéler si les bactéries de différents compartiments subcellulaires présentent des différences dans leur viabilité.

Brittany Johnson, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure pour que des cellules soient cultivées sur des lamelles de verre circulaires en 24 plaques de puits pour ajouter des bactéries d’intérêt et incuber pendant le temps souhaité. Rincez une fois les cellules infectées doucement. Ajoutez ensuite l’anticorps couplé Alexa Fluor 6 4 7, ou une lectine spécifique bactérienne pour détecter les bactéries externes et incuber pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante.

Après deux rinçages, aspirez le média et ajoutez 0,5 millilitre de solution de coloration vivante contenant du cyto neuf et du propidium iodé. Incuber les cellules pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité, puis rincer deux fois avec des vadrouilles au chlorure de magnésium. Inversez le couvercle glisse face vers le bas sur des lames de verre.

Sceller avec du vernis à ongles transparent. Acquérez les images en 30 minutes à l’aide d’un microscope fluorescent avec des jeux de filtres détaillés dans le protocole textuel pour étiqueter les bactéries. Ajoutez 10 microgrammes par millilitre de DPI dans un milieu plus défini et incubez pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Infectez maintenant les cellules adhérentes avec des bactéries marquées DPI. Ne fixez pas les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. Rincez les cellules une fois.

Ajoutez ensuite l’anticorps couplé Alexa Fluor 6, 4, 7 ou la lectine et incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après deux rinçages avec tampon vadrouille, ajoutez un anticorps couplé Alexa Fluor 5, 5, 5 contre le marqueur subcellulaire d’intérêt et incubez pendant 20 minutes Après deux, RIN avec tampon vadrouille, lavez une fois les cellules avec des serpillières chlorure de magnésium. Ensuite, aspirez le milieu et ajoutez 0,4 micromolaire de cyt vert incuber les cellules pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité, rin les cellules deux fois en vadrouilles, chlorure de magnésium.

Ensuite, lavez les cellules. Une fois de plus dans des serpillières de chlorure de magnésium pendant cinq minutes. Inversez le couvercle, glisse face vers le bas sur les lames de verre, scellez-le avec du vernis à ongles transparent, acquérez des images des lames dans les 30 minutes sur le microscope à fluorescence.

Dans cette expérience, des neutrophiles humains ont été infectés par la gonorrhée. La lectine de soja couplée Alexa Fluor 6 4 7 détecte la gonorrhée extracellulaire. Ensuite, la matrice de viabilité fluorescente verte et l’iodure de propidium fluorescent rouge ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméer préférentiellement les membranes plasmiques de la cellule hôte, mais ne pénètre pas la membrane de la gonorrhée dans les cellules infectées, le noyau de la cellule eucaryote se colore à la fois avec du cyto neuf et de l’iodure de propidium.

Ces images de neutrophiles infectés par la gonorrhée ont été générées à l’aide des colorants de viabilité, de l’écran cyt talk et du dpi. Le colorant iodure de propidium n’a pas été utilisé car il est fluorescent dans les canaux rouge et ultraviolet sur le microscope à fluorescence. Toutes les gonorrhées colorent avec du dpi, mais seules les bactéries avec des membranes compromises se tachent avec du vert bœuf.

La bactérie intracellulaire non viable présente un anneau de coloration pour le CD 63 qui entoure la bactérie. Cet anneau indique que les granules primaires sont enrichis au niveau de ce phagosome. La bactérie intracellulaire viable n’est pas colorée pour le CD 63, ce qui indique que les granules primaires ne sont pas enrichis au niveau de son phagosome. Pris.

Ensemble, les données montrent une corrélation entre la viabilité de la gonorrhée et les résidents dans un phagosome primaire à granules négatifs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la viabilité des bactéries dans les cellules hôtes. De plus, vous serez en mesure de déterminer la viabilité des bactéries localisées dans différents compartiments des cellules hôtes en utilisant des anticorps dirigés contre ces compartiments subcellulaires.