Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Cette expérience de microscopie à fluorescence évalue la viabilité de bactéries individuelles associées à des cellules hôtes et détermine la viabilité bactérienne dans différentes localisations sous-cellulaires. Premièrement, afin d'identifier les bactéries externes, exposez les cellules infectées à un réactif fluorescent spécifique à la perméase bactérienne, ou aux cellules hôtes infectées en présence de colorants fluorescents permettant de distinguer les bactéries viables des non viables selon l'intégrité de la membrane bactérienne. Ensuite, pour indiquer l'emplacement des bactéries à l'intérieur des cellules hôtes, incubez les cellules infectées avec un anticorps marqué au fluorochrome dirigé contre un marqueur d'intérêt.

Les images d'immunofluorescence obtenues permettent de déterminer le pourcentage de bactéries viables à l'intérieur et à l'extérieur des cellules hôtes, ainsi que la localisation subcellulaire des bactéries intracellulaires viables par rapport aux non viables. Contrairement aux dosages par comptage des colonies, aux tests de protection à la gentamicine et à la microscopie électronique, cette méthode permet une évaluation directe de la viabilité de chaque bactérie. Elle peut également révéler si les bactéries situées dans différents compartiments subcellulaires présentent des différences de viabilité.

La démonstration de cette procédure sera effectuée par Brittany Johnson, étudiante diplômée de mon laboratoire. Ajoutez aux cellules cultivées sur des lamelles circulaires en verre dans des plaques de 24 puits les bactéries d'intérêt et incubez pendant la durée souhaitée. Rincez délicatement les cellules infectées une fois. Puis ajoutez un anticorps marqué avec Alexa Fluor 6 4 7, ou une lectine spécifique aux bactéries afin de détecter les bactéries externes, et incubez pendant 10 minutes à l'obscurité à température ambiante.

Après deux lavages, aspirez le milieu et ajoutez 0,5 millilitre de solution de coloration vivant-mort contenant du cyto neuf et de l'iodure de propidium. Incubez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière, puis rincez deux fois dans du mops chlorure de magnésium. Retournez les lamelles et placez-les face vers le bas sur des lames de verre.

Sceller avec du vernis à ongles transparent. Acquérir les images dans les 30 minutes à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de jeux de filtres décrits dans le protocole textuel pour marquer les bactéries. Ajouter 10 microgrammes par millilitre de DPI dans le milieu défini mors et incuber pendant 20 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.

Ensuite, infectez les cellules adhérentes avec des bactéries marquées au DPI. Ne fixez pas les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. Rincez les cellules une fois.

Ensuite, ajouter l'anticorps ou la lectine couplé à l’Alexa Fluor 647 et incuber pendant 10 minutes à température ambiante à l’obscurité. Après deux rinçages avec le tampon mops, ajouter un anticorps couplé à l’Alexa Fluor 555 dirigé contre le marqueur sous-cellulaire d’intérêt et incuber pendant 20 minutes. Après deux rinçages avec le tampon mops, laver les cellules une fois avec le tampon mops chlorure de magnésium. Puis aspirer le milieu et ajouter du cyt green à 0,4 micromolaire ; incuber les cellules pendant cinq minutes à température ambiante à l’obscurité, puis rincer les cellules deux fois dans le tampon mops chlorure de magnésium.

Ensuite, lavez les cellules une fois supplémentaire dans du chlorure de magnésium MOPS pendant cinq minutes. Retournez les lamelles et placez-les face contre le bas sur des lames en verre ; scellez avec du vernis incolore, puis acquérez les images des lames dans les 30 minutes sur un microscope à fluorescence.

Dans cette expérience, des neutrophiles humains ont été infectés par la gonorrhée. La lectine de soja marquée avec l’Alexa Fluor 6 4 7 détecte la gonorrhée extracellulaire. Ensuite, le colorant vert fluorescent de viabilité et l’iodure de propidium rouge fluorescent ont été ajoutés en présence de saponine, qui piège le cholestérol et perméabilise de façon privilégiée les membranes plasmiques des cellules hôtes, mais ne traverse pas la membrane de la gonorrhée dans les cellules infectées ; le noyau de la cellule eucaryote se colore avec le cyto neuf et l’iodure de propidium.

Ces images de neutrophiles infectés par la gonorrhée ont été obtenues à l'aide des colorants de viabilité cyt talk screen et dpi. Le colorant iodure de propidium n'a pas été utilisé car il fluoresce à la fois dans les canaux rouge et ultraviolet du microscope à fluorescence. Toutes les gonorrhées se colorent au dpi, mais seules les bactéries dont les membranes sont altérées se colorent à l'ox green.

Les bactéries intracellulaires non viables présentent un anneau de marquage pour le CD63 entourant les bactéries. Cet anneau indique que les granules primaires sont enrichis au niveau de ce phagosome. La bactérie intracellulaire viable ne présente pas de marquage pour le CD63, ce qui indique que les granules primaires ne sont pas enrichis au niveau de son phagosome.

Ensemble, les données montrent une corrélation entre la viabilité de la gonorrhée et les résidents d'un phagosome négatif pour les granules primaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer la viabilité des bactéries dans les cellules hôtes. De plus, vous serez en mesure de déterminer la viabilité des bactéries localisées dans différents compartiments des cellules hôtes en utilisant des anticorps dirigés contre ces compartiments subcellulaires.