Name: Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Apprenez à évaluer la viabilité bactérienne dans les cellules hôtes par microscopie à fluorescence. Cette méthode permet de distinguer les bactéries viables des non viables selon leur localisation subcellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Asya Smirnov et Laura Gonyar pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R00 R01 TW008042 et AI097312 à AKCMBJ a été soutenu en partie par les NIH T32 AI007046.

Une. Évaluation de la viabilité bactérienne avec l&#39;iodure de propidium et SYTO9 <ol><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries d&#39;intérêt. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois doucement dans 0,1 M de 3 - (N-morpholino) propanesulfonique (MOPS), pH 7,2, contenant 1 mM de MgCl2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min à l&#39;obscurité à la température ambiante avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. </li></ol> REMARQUE: procéder à des contrôles par des bactéries vivantes et mortes, en l&#39;absence de cellules hôtes, pour montrer que la lectine ou anticorps d&#39;intérêt se lie toutes les bactéries indépendamment de la viabilité (Figure 1). <ol start="4"><li> Rincer les cellules deux fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Aspirer mdias de cellules et ajouter 0,5 ml Vivant / Mort coloration Solution. Vivant / Mort Solution de coloration est de 5 uM SYTO9, 30 uM de l&#39;iodure de propidium, et 0,1% de saponine (concentrations finales) dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> lamelles Inverser face vers le bas sur des lames de verre et sceller avec du vernis à ongles transparent. N&#39;utilisez pas de support de montage. </li><li> Acquérir des images à l&#39;intérieur de 30 min, en utilisant un microscope à fluorescence avec des jeux de filtres compatibles avec l&#39;acquisition des images verte, rouge, et rouge lointain. </li></ol> REMARQUE: Les deux microscopie de fluorescence conventionnelle et la microscopie confocale à balayage laser peut être utilisé. Après 30 minutes, les colorants fluorescents commencent à fuir par les bactéries et les données acquises ne sont plus exactes. Les images présentées dans cet article ont été acquis sur un montant microscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 avec appareil photo numérique Hamamatsu Orca-ER en utilisant un logiciel Openlab. La fluorescence de l&#39;Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 590-650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est de couleur bleu-faux. La fluorescence de l&#39;iodure de propidium a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 540-580 nm et un filtre d&#39;émission de 600 à 660 nm. La fluorescence a été détectée à partir de SYTO9 en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. <ol start="10"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent bleu + rouge, bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement, bactéries viables externes apparaissent en bleu + vert, et les bactéries viables internes apparaissent en vert seulement. Compter oeil par le nombre de bactéries qui sont externes non viables, non viables interne, externe viable, et interne viable. </li><li> Calculer le pour cent de bactéries viables externe en divisant le nombre de bactéries viables externes par le nombre total de bactéries externes (viable, plus nonvimesure). Calculer le pour cent des bactéries viables internes en divisant le nombre de bactéries viables internes par le nombre total de bactéries internes (non viable, plus viable) (Figure 4). </li><li> Il existe deux contrôles essentiels à effectuer avec ce protocole. Tout d&#39;abord, valider que toutes les bactéries non viables sont l&#39;iodure de propidium positif et toutes les bactéries vivantes sont SYTO9 positif. Un milieu de culture logarithmique de bactéries (en l&#39;absence de toute cellule de l&#39;hôte) doit être&gt; 95% SYTO9-positif. Illustrée à la figure 2 est une culture à mi-logarithmique de N. gonorrhoeae (à 10 8 unités formatrices de colonies par ml former) incubées avec mort Colorant / Live. Deuxièmement, valider que les deux iodure de propidium et SYTO9 peuvent entrer perméabilisées, des cellules hôtes infectées. <ol><li> Pour générer une population de bactéries mortes, de recueillir 2 x 10 8 unités colonie bactérienne dans un tube de 1,5 ml former, ajouter 70% d&#39;isopropanol et de s&#39;asseoir pendant 10 min. Pellet les bactéries dans une micro-une laver les bactéries deux fois dans du PBS pour éliminer l&#39;isopropanol résiduel. Ensuite, suivez les étapes protocole 1.5 à 1.7. Ajouter 5 ul de suspension bactérienne à une lame de verre et recouvrir d&#39;une lamelle. échantillons de l&#39;image que dans le protocole étape 1.9. Dans ces conditions, 100% de la population devrait être l&#39;iodure de propidium-positive (figure 2). Chez certaines espèces bactériennes, l&#39;iodure de propidium peut pas complètement submerger SYTO9 coloration, et les bactéries non viables peut apparaître jaune ou orange. </li><li> Pour des cellules phagocytaires telles que les neutrophiles, exposer les cellules de bactéries tuées par l&#39;isopropanol et de veiller à ce que 100% des bactéries intracellulaires sont l&#39;iodure de propidium-positif (Figure 3). Pour les cellules non phagocytaires qui ne peuvent pas internaliser les bactéries mortes, il peut être suffisant pour traiter les cellules infectées avec l&#39;azoture de sodium ou d&#39;autres agents antimicrobiens cellules infiltrant avant d&#39;ajouter Vivant / Mort coloration Solution. </li></ol></li></ol> 2. Évaluation de la viabilité bactérienne avec SYTOX Green et DAPI <ol><li> bactéries Label d&#39;intérêt avec 10 pg / ml DAPI en milieu défini de Morse 25 pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,5 ml 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li&gt; Acquérir les images dans les 30 min avec un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d&#39;acquisition. </li></ol> REMARQUE: La fluorescence à partir de l&#39;Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 590-650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est de couleur rouge-faux. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 355-375 nm et un filtre d&#39;arrêt de 400 nm. <ol start="10"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent rouge + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent en rouge + bleu, et les bactéries viables internes apparaissent en bleu uniquement (Figure 4). Quantifier le pour cent des bactéries internes et externes, comme décrit dans le protocole step 1,11. </li><li> Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3). </li></ol> 3. Évaluation de la viabilité bactérienne Outre la localisation subcellulaire <ol><li> bactéries Label d&#39;intérêt avec 10 pg / ml DAPI dans Défini le moyen de Morse pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et rincer les cellules deux times dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules avec Alexa Fluor 555 anticorps contre le marqueur couplé subcellulaire d&#39;intérêt pendant 20 min, en MOPS / MgCl 2 contenant 0,2% de saponine. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules 5 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li> Acquérir les images de diapositives dans les 30 minutes sur un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d&#39;acquisition. </li></ol> REMARQUE: Fluorescence de Alexa Fluor 647 a été détecté en utilisant un filtre à onde d&#39;excitation de 590 à 650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est faux de couleur pourpre. Fluorescence from Alexa Fluor 555 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 540-580 nm et un filtre d&#39;émission de 600 à 660 nm. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 355-375 nm et un filtre d&#39;arrêt de 400 nm. <ol start="14"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent violet + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent violet + bleu, bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement, et la protéine intracellulaire apparaît rouge (Figure 4). Quantifier la perecent de bactéries viables externes et internes tel que décrit dans le protocole étapes 1.11. </li><li> Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3). </li><li> Dansplus de compter des bactéries viables et non viables, de classer chaque bactérie comme positif ou négatif pour la colocalisation avec le marqueur subcellulaire d&#39;intérêt. </li><li> Calculer le pour cent de bactéries viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries viables colocalisés par le nombre total de bactéries viables. Calculer le pour cent des bactéries non viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries non viables colocalisés par le nombre total de bactéries non viables. </li></ol>

<ol><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77(2011).</li>
<li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li>
<li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).</li>
<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+absolute%2C+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li>
<li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128%2C+a+fresh-produce+washing+aid%2C+in+chlorinated+wash+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li>
<li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry%3A+a+comparison+to+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).</li>
<li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells%3A+clinical+and+pathogenetic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li>
<li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53(2006).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination%3A+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li>
<li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li>
<li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li>
<li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li>
<li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li>
<li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate%2C+Tetrahymena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li>
<li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+the+requirement+for+hypoxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%5BTitle%5D)+AND+%22BacLight.+Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Présentés ici sont deux protocoles qui utilisent liaison à l&#39;ADN et les colorants de viabilité en conjonction avec une lectine fluorescente pour identifier les bactéries vivantes et mortes et attachés à l&#39;intérieur des cellules humaines. Depuis deux protocoles pénalisent en direct de bactéries mortes, le choix de protocole à utiliser dépend du but de l&#39;expérience. Le premier protocole utilise l&#39;iodure de propidium pour détecter les bactéries non viables et SYTO9 pour détecter les bactéries intactes. Repr...

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d&#39;adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l&#39;hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l&#39;activité antimicrobienne du système immunitaire de l&#39;hôte. Le système immunitaire de l&#39;hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d&#39;autres composants de l&#39;immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l&#39;hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d&#39;infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l&#39;hôte immunisé réponse 1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d&#39;un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles 5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d&#39;accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses. Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d&#39;agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d&#39;une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne, mais n&#39;est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l&#39;essai de comptage de colonies, l&#39;essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l&#39;incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote 6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l&#39;incapacité de l&#39;antibiotique d&#39;avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l&#39;examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l&#39;examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu&#39;elle peut fournir des informations concernant l&#39;emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d&#39;or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n&#39;est pas particulièrement sensible à l&#39;évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l&#39;acétate d&#39;uranyle, le citrate de plomb, ou d&#39;autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable 7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d&#39;électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité. Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d&#39;évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d&#39;abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l&#39;ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l&#39;iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L&#39;iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d&#39;origine hydrique viables 9-12. Dans le second protocole, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l&#39;emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d&#39;intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L&#39;utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l&#39;infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l&#39;intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles 5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des 15 à 24.

<table><tbody><tr><td>21 G 3/4 aiguilles papillon pour le prélèvement sanguin</td><td>Becton Dickinson</td><td>367251</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement sanguin avec héparine de sodium 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Eau stérile pour l’irrigation</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>RDCD0200</td><td></td></tr><tr><td>Le PBS no Ca2+ ou Mg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>lamelles de protection circulaires en verre de 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum Humain Mélangé</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Interleukine-8 humaine</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL/CF</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 ou L7012</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 ou L7012</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka Analytique</td><td>47036</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lectine de soja couplée à Alexa Fluor 647</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Souris anti-CD63</td><td>Études développementales Banque d’hybridomes</td><td>H5C6</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit d’étiquetage d’anticorps Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémacytomètre Bright Line Hausser</td><td>Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pince</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Les protocoles actuels pour répondre à ces questions comprennent des essais de comptage des colonies, des essais de protection gentamicine, et la microscopie électronique. le nombre de colonies et de protection de la gentamicine essais seulement évaluer la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne et sont incapables de déterminer la viabilité bactérienne individu. La microscopie électronique peut être utilisé pour déterminer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations en ce qui concerne leur localisation dans les cellules hôtes. Cependant, les bactéries présentent souvent une gamme de densités d&#39;électrons, ce qui rend difficile l&#39;évaluation de la viabilité. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes. Ces tests ont été développés à l&#39;origine pour évaluer la survie de Neisseria gonorrhoeae dans les neutrophiles humains primaires, mais doit être unpplicable toute interaction cellulaire bactérie-hôte. Ces protocoles associent des colorants fluorescents membrane perméable (SYTO9 et 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), qui colore toutes les bactéries, avec des colorants de membrane imperméable fluorescent (iodure de propidium et SYTOX vert), qui ne sont accessibles à bactéries non viables. Avant la perméabilisation de la cellule eucaryote, d&#39;un anticorps ou d&#39;un réactif fluorescent est ajouté à identifier les bactéries extracellulaires. Ainsi, ces tests de discrimination de la viabilité des bactéries adhérentes et à l&#39;intérieur des cellules eucaryotes. Un protocole est également prévue en utilisant les colorants de viabilité en combinaison avec des anticorps fluorescents à des marqueurs de cellules eucaryotes, afin de déterminer la localisation subcellulaire des bactéries individuelles. Les colorants de viabilité bactériennes décrites dans cet article sont un complément et / ou solution de rechange adaptée à des techniques de microbiologie traditionnelle pour évaluer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations sur l&#39;endroit où les bactéries survivent dans une cellule hôtes.

Les protocoles décrits ont été utilisés pour examiner la survie de N. gonorrhoeae après l&#39;exposition à l&#39;humain primaire neutrophiles 5,26. Les neutrophiles ont été infectées par N. gonorrhoeae et traitées avec le protocole 1, en ​​utilisant la viabilité SYTO9 colorant vert fluorescent et de l&#39;iodure de propidium-rouge fluorescent (figure 4A). Les colorants ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméabiliser les membranes plas...

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Cette expérience de microscopie à fluorescence évalue la viabilité de bactéries individuelles associées à des cellules hôtes et détermine la viabilité bactérienne dans différentes localisations sous-cellulaires. Premièrement, afin d'identifier les bactéries externes, exposez les cellules infectées à un réactif fluorescent spécifique à la perméase bactérienne, ou aux cellules hôtes infectées en présence de colorants fluorescents permettant de distinguer les bactéries viables des non viables selon l'intégrité de la membrane bactérienne. Ensuite, pour indiquer l'emplacement des bactéries à l'intérieur des cellules hôtes, incubez les cellules infectées avec un anticorps marqué au fluorochrome dirigé contre un marqueur d'intérêt.Les images d'immunofluorescence obtenues permettent de déterminer le pourcentage de bactéries viables à l'intérieur et à l'extérieur des cellules hôtes, ainsi que la localisation subcellulaire des bactéries intracellulaires viables par rapport aux non viables. Contrairement aux dosages par comptage des colonies, aux tests de protection à la gentamicine et à la microscopie électronique, cette méthode permet une évaluation directe de la viabilité de chaque bactéri

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des...

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Cet article présente deux protocoles : l’un pour mesurer les bactéries anaérobies qui peuvent envahir et survivre avec succès dans l’hôte, et l’autre pour visualiser les bactéries anaérobies interagissant avec les cellules hôtes. Cette étude peut être appliquée à n’importe quel anaérobie cultivable et à tout type de cellule eucaryote.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Une méthode est décrite ici pour déterminer l’association et la compétition interrègnes (bactériennes et fongiques) pour l’adhérence aux monocouches de cellules HeLa infectées par le virus. Ce protocole peut être étendu à plusieurs combinaisons de procaryotes, d’eucaryotes et de virus.

Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Ce manuscrit décrit une méthode d’utilisation de la microscopie à fluorescence unicellulaire pour visualiser et quantifier la compétition bactérienne en coculture.

Quantification de la concurrence interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire

Apprenez à évaluer la viabilité bactérienne dans les cellules hôtes par microscopie à fluorescence. Cette méthode permet de distinguer les bactéries viables des non viables selon leur localisation subcellulaire.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Explorer plus de vidéos