Détermination de la structure et de la coordination de complexes peptides-métalliques à l’aide de la RMN 1D et 2D ¹H

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la structure d’un peptide mimétique mimétique de protéine chaperon Metallo complexé avec du cuivre. Pour ce faire, il faut d’abord préparer l’échantillon dans un environnement sans oxygène. La deuxième étape consiste à acquérir les données de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ou RMN montrant les interactions entre les atomes d’hydrogène.

Ensuite, les interactions spatiales sont cartographiées sur un modèle de peptide linéaire. La dernière étape consiste à trouver une structure représentative à basse énergie qui correspond aux données. En fin de compte, les structures dérivées de la RMN sont utilisées pour déterminer le mode de liaison et pour effectuer une analyse structurelle sur le complexe lié au cuivre.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la cristallographie aux rayons X, est que vous pouvez l’utiliser pour examiner les complexes de liaison hebdomadaires ainsi que les molécules et les complexes qui ne cristallisent pas. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des protéines de liaison au cuivre. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que d’autres métaux pour étudier comment les protéines permettent l’administration en toute sécurité d’ions métalliques essentiels, mais potentiellement toxiques, dans l’environnement de la lignée cellulaire.

Pour commencer, préparez les échantillons dans un environnement sans oxygène afin d’empêcher le cuivre de s’oxyder, pour préparer l’échantillon APO, dissoudre environ un à deux milligrammes du peptide dans 450 à 500 microlitres de solvant de qualité RMN deutéré pour l’échantillon de cuivre ayant réagi, dissoudre la même quantité que le peptide APO avec une quantité molaire EQU de sel métallique dans 450 à 500. Des microlitres de solvant RMN filtrent chaque solution à l’aide d’un verre central, d’un papier filtrant ou de toute autre technique qui convient aux composés étudiés et ne les absorbe pas. Ceci est essentiel pour éliminer toutes les particules métalliques, qui affecteront l’homogénéité.

Transférez les solutions dans des tubes RMN et fermez les échantillons dans les tubes. Avant de quitter la boîte à gants, sortez les échantillons de la boîte à gants et scellez-les. Enregistrer les spectres unidimensionnels des protons de l’APO et des échantillons de cuivre ayant réagi dans la machine RMN et comparer.

Le peptide APO est flexible et présente une moyenne de confirmations, mais en réagissant avec le cuivre, les amides peptidiques liés ont une structure plus rigide. Par conséquent, le spectre peptidique contenant du cuivre devrait montrer un changement significatif dans le changement chimique dans la région de l’amide, et les pics pourraient se résoudre. Configurez des expériences de RMN optimisées, confortables, curieuses ou roses dans des conditions identiques à celles décrites dans le protocole texte et exécutez-les dans l’ordre.

Exécutez des expériences unidimensionnelles entre chaque expérience pour vous assurer que la composition de l’échantillon reste constante tout au long de l’acquisition des données. Après avoir traité les données comme indiqué dans le protocole de texte, préparez un ensemble de spectres confortables et à superposés sur le spectre noea et rose. Pour attribuer tous les pics NOE dans le spectre.

Commencez par attribuer des pics qui chevauchent les signaux de toxis dans la région de l’empreinte digitale. Comme cela facilitera les entrées ultérieures d’assignation des pics avec l’enregistrement du programme Sparky, les pics attribués traduisent les valeurs de couplage de H alpha en protéines amides en angles dérivaux. Traduisez également les pics en contraintes de distance en intégrant les pics à partir du programme et en les traduisant à l’aide d’une interaction de distance connue.

Si les pics se chevauchent ou si les méthodes d’intégration automatique ne peuvent pas être utilisées, les pics peuvent être étiquetés comme forts, moyens, faibles ou très faibles par estimation visuelle, et ces désignations peuvent être traduites en distances allant jusqu’à 2,5, 3,5, 4,5 et 5,5 angströms respectivement. Dans importez les contraintes de distance et les angles de dédalage avec le format correct pour explorer. Explore fouillera l’espace de confirmation pour trouver des structures qui adhèrent à la géométrie chimique canonique.

En plus des contraintes de distance trouvées expérimentalement pour générer un ensemble dans lequel aucun de ces paramètres n’est violé. Celui-ci constituera l’ensemble de départ. Effectuez la première série de détermination de structure sans utiliser de contraintes sur le métal pour trouver quels résidus participent à la liaison du métal sans aucun biais.

Introduisez les contraintes progressivement pour faciliter l’identification des erreurs d’affectation ainsi que l’énergie NOE et les paramètres d’agenouillement simulés comme décrit dans le protocole textuel avant de minimiser les structures à l’aide de la minimisation de l’énergie du gradient conjugué pour 4 000 itérations, créez un ensemble final de généralement 50 membres en effectuant l’introduction des contraintes de manière itérative sur l’ensemble entier, indiquez le nombre de chaque type d’interaction NOE trouvé. Enfin, créez un ensemble de structures qui adhèrent à la géométrie chimique canonique et au rapport sur les contraintes dérivées de la RMN empirique. Le nombre total de confirmations, le nombre de celles qui ont des violations des contraintes NM Rived et le RMSD de l’ensemble entier, y compris les valeurs RMSD du squelette et de tous les atomes lourds.

Analysez l’ensemble de basse énergie et déterminez quelles chaînes latérales de résidus sont à proximité les unes des autres pour pouvoir lier l’ion métallique. Une fois ceux-ci déterminés, répétez l’analyse, y compris les données de liaison au cuivre. En plus des contraintes de distance dérivées de la RMN, ajoutez maintenant des contraintes de liaison métallique aux résidus déterminés.

Ajoutez les paramètres appropriés pour décrire l’ion métallique et sa topologie. Entrez les informations physiques appropriées, telles que les longueurs de liaison de masse avec d’autres atomes, les angles et les paramètres de répulsion non liants dans le fichier de paramètres. Ajoutez les informations de liaison au fichier de topologie.

Ces informations comprennent les liens qui se forment et se rompent, et les accusations formelles qui sont modifiées à la suite de la liaison. Enfin, acquérez un ensemble de structures comme avant l’ensemble résolu représente l’espace de confirmation adopté par le peptide. Lors de la mesure RMN, importez toutes les confirmations de la structure dans le programme Mal Mall pour créer un ensemble de départ.

Examinez l’ensemble pour déterminer la stabilité locale de la molécule. Déterminez les valeurs RMSD du squelette et de la chaîne latérale en sélectionnant les quatre régions de résidus suivantes le long de la séquence et en demandant au programme de calculer la RMSD à la structure d’énergie la plus basse ou à la moyenne, déterminez quelles régions de la molécule présentent une stabilité locale en traçant la RMSD locale en fonction de la séquence, superposez l’ensemble le long de cette région de la molécule et utilisez cet ensemble pour une analyse plus approfondie. Choisissez des confirmations à basse énergie qui respectent les contraintes dérivées de la RMN.

Ceux-ci formeront l’enregistrement d’ensemble de basse énergie et indiqueront le nombre de confirmations dans l’ensemble, les critères de sélection et les valeurs RMSD. Si le mode de liaison du métal n’a pas encore été déterminé, analysez l’ensemble de basse énergie et déterminez quelles chaînes latérales de résidus sont incorrectes. Proximité les uns des autres pour pouvoir lier l’ion métallique.

Utilisez KYMERA pour déterminer les distances intramoléculaires entre les atomes soupçonnés de liaison métallique. Calculez les distances moyennes dans l’ensemble une fois que celles-ci ont été déterminées. Répétez l’analyse, y compris les données de liaison du cuivre.

Examinez l’ensemble et déterminez la structure secondaire locale de la molécule à l’aide des paramètres de recherche par défaut du programme MAL mall. Ensuite, importez l’ensemble dans kymera. Les structures secondaires sont maintenues par une liaison hydrogène et indiquent des régions stables de la molécule.

Déterminez la liaison de l’hydrogène à l’aide de l’outil kymera. Poursuivre l’analyse structurale telle que détaillée dans le protocole de texte. Pour étudier les modèles de protéines de liaison au cuivre, la structure de la séquence de liaison conservée d’une protéine dans le peptide linéaire dérivé a été déterminée par RMN à l’état de solution, la région amide du peptide de 6,7 à 8,5.

Le PP M a montré une expansion lors de la réaction avec le cuivre à 6,6 à 9,0 PP M. L’élargissement de la ligne dû à une légère oxydation du cuivre est évident dans la ligne de base. On voit ici une superposition des régions d’empreintes digitales de Roy Toxi et des spectres confortables du peptide lié au cuivre. L’échantillon était stable avec le temps et les spectres étaient bien résolus et donnaient 81 interactions NOE qui ont été acquises par une expérience rose.

Étant donné que la molécule a donné des interactions NOE proches de zéro dans l’expérience NO C, l’ensemble du peptide dérivé pour l’échantillon ayant réagi, mais sans utiliser de contraintes pour le métal, a donné 47 des 50 non-structures avec une valeur RMSD de 1,44 et 2,07 angströms sur le squelette et les atomes lourds respectivement. Parmi ceux-ci, 13 conformateurs de basse énergie ont été choisis pour une analyse plus approfondie, avec des valeurs RMSD de 0,25 et 0,61 angströms sur le squelette et les atomes lourds, respectivement. Le graphique RMSD local a montré une région de stabilité entre les résidus trois et sept. En plus de la région terminale C rigide, y compris un résidu prolène, cette région se trouve dans une confirmation de courbure entre les résidus quatre et sept dans toutes les confirmations.

La confirmation de la courbure est stabilisée par une liaison hydrogène entre les donneurs et les accepteurs de squelette, la glycine cinq et l’anine trois ans, ainsi que la cystéine six et la cystéine trois. Cette courbure est également évidente dans la cystine trois et le sinus sept par les valeurs de couplage réduites dans cette région. Les confirmations ont été superposées sur cette région et analysées pour détecter d’éventuels résidus de liaison en considérant la cystine trois, la cystine six et la méthionine un comme résidus de liaison potentiels.

La distance la plus courte entre atomes de soufre et d’atome de soufre était celle entre les groupes folate de la cystéine trois et de la cystéine six, la liaison au cuivre a été introduite et le calcul a été répété pour donner l’ensemble utilisé pour l’analyse. L’ensemble de basse énergie du peptide lié au cuivre montre que l’amine terminale terminale est proche du cuivre lié. Voici l’isosurface de distribution du potentiel électrostatique avec le potentiel positif indiqué en bleu et le potentiel négatif indiqué en rouge.

Le résidu d’arginine s’étend à partir du squelette du peptide en formant un lobe positif de potentiel électrostatique, tandis que les rendements en carbone du squelette sont disposés en une ligne formant un potentiel électrostatique négatif moins proéminent Une fois maîtrisé, une détermination structurelle peut être effectuée en environ une semaine de temps de RMN et quelques jours supplémentaires de travail afin d’obtenir un ensemble de confirmations pouvant être utilisées pour l’analyse structurelle. À la suite de cette procédure, d’autres mutans peptidiques et différentes conditions peuvent être analysés afin de répondre à des questions supplémentaires portant sur les conditions requises pour différents degrés de liaison et de libération de l’ion cuivre.