Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

L’objectif général de ce protocole est d’étudier les structures d’assemblages de protéines supermoléculaires insolubles et non cristallines à résolution atomique par spectroscopie RMN à l’état solide à rotation d’angle magique. Nous présenterons les étapes méthodologiques essentielles à l’étude des structures atomiques d’assemblages de protéines biomoléculaires par RMN à l’état solide. L’étude des structures atomiques de ces assemblages est extrêmement difficile car ils sont intrinsèquement insolubles et non cristallins.

La RMN à l’état solide est une technique émergente capable d’étudier la structure et la dynamique moléculaires à la résolution atomique sans être limitée par la taille de l’objet assemblé, ou par sa solubilité. Nous illustrons ici les étapes clés pour visualiser les structures atomiques des assemblages de protéines biomoléculaires par RMN à l’état vendu, y compris la préparation d’échantillons marqués isotopiquement, la collecte et l’analyse de données structurales à partir de la RMN à l’état solide. La première étape d’un flux de travail de RMN à l’état solide est la production de sous-unités protéiques marquées en C13 N15 et leur assemblage in vitro.

Inoculer une pré-culture de 15 mil de milieu LB préchauffé avec une colonie de cellules E. coli transformées. Incuber à 37 degrés Celsius avec 200 tr/min en secouant pendant la nuit. Pour inoculer la culture principale, transférez l’ensemble de la pré-culture dans un litre de milieu N9 préchauffé contenant les sources isotopiques de carbone et d’azote nécessaires.

Ceux-ci peuvent inclure du chlorure d’ammonium marqué N15, du glucose uniformément marqué en C13, du glucose marqué sélectivement en C13 ou du glycérol marqué sélectivement en C13 Incuber à 37 degrés et mesurer la densité optique à 600 nanomètres dès que la culture devient trouble. Lorsque la DO a atteint une valeur de 0,8, induire l’expression de la protéine avec un IPTG mini-molaire de 0,75 pendant quatre heures. Notez que les conditions optimales d’induction peuvent varier d’une protéine à l’autre.

Récupérer les cellules par centrifugation pendant 30 minutes à 6 000 G et quatre degrés. Après purification des sous-unités protéiques, elles sont assemblées in vitro. Concentrez la protéine sur environ une mini molaire dans une unité de filtration centrifuge.

Pour ce faire, introduisez l’échantillon dans l’unité de filtration et centrifugez-le à 4 000 G pendant 30 minutes. Entre les étapes de centrifugation, mélangez délicatement la solution dans l’unité de filtration à l’aide d’une pipette pour éviter le dépôt de protéines au niveau de la membrane du filtre. Répétez la procédure jusqu’à ce que la concentration souhaitée soit atteinte.

Transférez l’échantillon dans un tube de faucon et incubez sous agitation pendant une semaine à température ambiante. Habituellement, la polymérisation des sous-unités en filaments s’accompagne d’une solution qui devient trouble. Ajouter 0,02 % en poids par volume d’azoture de sodium pour éviter la contamination bactérienne.

Pour récolter l’assemblage de protéines, centrifugez l’échantillon pendant une heure à 20 000 G et quatre degrés. Aspirez la majorité du surnageant en ne laissant que suffisamment de liquide pour couvrir la surface afin d’éviter le dessèchement de l’échantillon, et stockez l’échantillon à quatre degrés jusqu’à la mesure. Nous présenterons les expériences essentielles pour une analyse structurale par RMN à l’état solide.

La polarisation croisée unidimensionnelle, ou CP, et les expériences ineptes détectées sur les noyaux C13 sont utilisées pour détecter respectivement des segments de protéines rigides et flexibles dans l’assemblage. Et d’estimer le degré d’homogénéité structurelle et de polymorphisme local. Ici, nous utilisons des valeurs expérimentales standard.

Les plages de paramètres typiques sont indiquées dans le protocole. Insérez la rotation dans l’aimant RMN et démarrez la rotation de l’angle magique comme décrit dans le protocole. Réglez la fréquence de rotation souhaitée et assurez-vous de la stabilisation à plus ou moins 10 hertz.

Enregistrez un seul spectre de protons pulsé et unidimensionnel à l’aide de 16 balayages. Mettre en place un CP 1D proton carbone. Les expériences CP montrent les signaux qui proviennent de résidus dans une conformation rigide. Les paramètres initiaux de l’expérience sont tirés d’une procédure d’optimisation standard sur un composé de référence.

Les paramètres d’étalonnage et de découplage des impulsions peuvent être optimisés dans l’échantillon lorsque la sensibilité est suffisamment élevée. Ici, nous enregistrons un CP avec 16 scans. Le temps de contact et les niveaux de puissance CP sont choisis en fonction de l’intensité maximale du signal, comme démontré ici pour l’optimisation du temps de contact CP.

L’intensité maximale dans cet exemple est atteinte à 800 millisecondes. Les paramètres de découplage doivent également être réajustés par rapport à ceux initialement définis lors de l’étalonnage du composé de référence. Enfin, observez attentivement la localisation des bandes latérales en rotation à la fréquence de rotation de l’angle magique donné, indiquée ici à 18 kilohertz, pour éviter tout chevauchement avec le signal.

Enregistrez un spectre CP de proton-carbone 1D de référence qui sert d’empreinte spectrale unidimensionnelle. Ici, nous accumulons 128 balayages avec un temps de contact CP de 800 millisecondes, une force de découplage de 100 kilohertz, un délai de recyclage de trois secondes et un temps d’acquisition de 20 millisecondes. Traitez l’expérience CP sans apathie.

Choisissez un pic isolé pour estimer le C39 dans l’échantillon, ce qui indique l’ordre structurel et l’homogénéité. Ici, la largeur de la ligne, mesurée comme la largeur totale à mi-hauteur, est d’environ 60 à 70 hertz, ce qui indique une structure protéique bien ordonnée dans l’assemblage. Mettez en place une expérience unidimensionnelle inepte sur le carbone des protons pour sonder les parties très mobiles de l’assemblage des protéines.

Enregistrez une expérience inepte de référence pour servir d’empreinte digitale pour les segments de protéines mobiles. Les paramètres typiques sont de 128 balayages et d’un temps d’acquisition de 25 millisecondes. Traiter l’expérience inepte sur le carbone proton.

Le nombre de signaux, et leurs positions, sont indicatifs de l’étendue de la mobilité des résidus et de la composition en acides aminés respectivement. Ici, seul le signal du tampon de torsion CH2 merit-y est observé car la protéine entière est dans un régime rigide dans la structure d’assemblage. L’analyse conformationnelle de la structure protéique est basée sur les affectations de résonance RMN à l’état solide pour tous les résidus rigides de l’assemblage.

Cela est rendu possible parce que les changements chimiques sont des sondes très sensibles pour l’environnement chimique local et peuvent être utilisés pour prédire la structure secondaire de la protéine. Une détermination complète de la structure 3D est ensuite basée sur la collecte de données structurelles telles que les contraintes de distance qui codent à la fois les proximités d’atomes intra et intermoléculaires jusqu’à neuf angströms. Ici, nous montrerons comment les expériences bidimensionnelles de base sont enregistrées et donnerons un exemple d’affectation séquentielle.

Nous ferons ensuite une brève démonstration de la façon de collecter des contraintes de distance à partir d’expériences enregistrées sur des échantillons marqués sélectivement en C13. Configurez l’expérience PDSD carbone carbone bidimensionnel à temps de mélange court pour détecter la corrélation carbone-carbone intra-résidu. Copiez les valeurs de l’étape initiale de polarisation croisée du proton-carbone de l’expérience CP unidimensionnelle.

Le mixage peut être réglé à 50 millisecondes pour des échantillons uniformément marqués en C13. Ici, nous avons choisi un temps d’acquisition de 15 et 20 millisecondes dans les dimensions indirectes et directes respectivement. Pour traiter le spectre PDSD, nous utilisons une fonction de fenêtre QSINE avec un décalage sinusoïdal de 3,5.

Pour permettre l’affectation spécifique d’un résidu, utilisez les paramètres du temps de mélange court PDSD pour enregistrer un temps de mélange intermédiaire PDSD avec un temps de mélange de 100 à 200 millisecondes. Notez que des spectres supplémentaires, y compris des expériences détectées à l’azote, sont souvent nécessaires pour une attribution de résonance complète, et sont détaillés dans le protocole. Choisissez un programme d’analyse RMN, tel que CCPNMR Analysis.

Chargez les spectres 2D dans le logiciel et créez un objet moléculaire avec la séquence protéique primaire. Commencez par l’identification des types d’acides aminés qui sont visibles dans le spectre PDSD à court temps de mélange. La connexion des atomes de carbone des systèmes de spin permet une affectation spécifique au type de résidu.

Ici, nous attribuons le système de spin d’un résidu de thénium. Les transferts de polarisation entre les noyaux C-alpha, C-bêta et C-gamma conduisent à des pics croisés physiques dans le spectre PDSD. Essayez d’identifier autant de résidus que possible avec cette procédure.

Superposez le spectre PDSD à temps de mélange court et intermédiaire. Les pics supplémentaires visibles dans le temps de mélange intermédiaire PDSD résultent généralement du contact entre des résidus séquentiels. Marquez les pics de résonance d’un système de spin et trouvez des corrélations dans le temps de mélange intermédiaire PDSD avec les fréquences de résonance d’autres systèmes de spin.

Nous montrons l’assignation séquentielle avec le thénium 33 à l’isolutane 32 dans notre assemblage de protéines filamenteuses. Les fréquences de résonance du système de spin du thénium sont visibles sur une fréquence carbone des isolites en 32, et vice versa. Les procédures d’assignation avec les spectres d’azote détecté et d’obtention de la structure secondaire des protéines à partir des affectations sont décrites dans le protocole.

Après une affectation de résonance approfondie, nous pouvons procéder à l’identification des contraintes à longue portée. Les contraintes à longue portée sont des proximités de carbone de carbone intra ou intermoléculaires entre des résidus distants qui définissent à la fois le pli tertiaire des sous-unités monomères et la disposition des sous-unités au sein de l’assemblage. Ici, les échantillons marqués sélectivement en C13 sont d’une importance particulière.

Superposez un PDSD à temps de mélange intermédiaire avec un PDSD à temps de mélange long enregistré avec un temps de mélange compris entre 400 millisecondes et une seconde sur un échantillon étiqueté sélectivement en C13. Si possible, les deux PDSD auraient dû être enregistrés sur le même échantillon étiqueté sélectivement. Les pics supplémentaires résultent de corrélations entre des atomes de C13 plus éloignés.

Lors de l’attribution de résonance, tenez compte du schéma d’étiquetage sélectif. Dans ce cas, le 1-3-glycérol. Ici, nous avons mis en évidence un exemple d’un pic de contact à longue portée avec une affectation sans ambiguïté dans les deux dimensions.

Thénium 33 C-bêta avec protéine 45 C-alpha. Une fois l’identification à longue distance effectuée, les dispositifs de contention sont classés comme non ambigus ou ambigus ainsi qu’intra ou intermoléculaires. Les listes de contraintes à préparer pour la modélisation structurelle sont énumérées dans le protocole.

Des tutoriels sur la modélisation structurelle à l’aide de différents programmes peuvent être trouvés en ligne. Les données RMN à l’état solide, seules ou en conjonction avec des données complémentaires, peuvent permettre de déterminer la structure au niveau atomique d’assemblages supermoléculaires. Les avantages de la RMN à l’état solide sont, d’une part, la capacité de fournir à la fois des informations sur la structure secondaire et des contraintes de distance atomique à partir d’interfaces intramoléculaires, qui peuvent être intégrées dans le processus de modélisation.

Pourtant, d’autre part, la caractéristique unique de la spectroscopie RMN à l’état solide réside dans sa capacité à collecter des contraintes de distance atomique aux interfaces intermoléculaires de l’assemblage supermoléculaire intact. La détection et la distinction entre les assignations de contention intra et intermoléculaires peuvent cependant être un processus fastidieux et nécessitent généralement une préparation d’échantillons marqués sélectivement en C13. Cependant, avec les nouveaux développements dans les stratégies de marquage sélectif, la conception du matériel du spectromètre et les méthodologies de RMN à l’état solide, la technique réalise de plus en plus son potentiel théorique de fournir des informations moléculaires au niveau atomique sans limitations de taille d’objet, d’ordre à longue portée ou de cristallinité.

Cette méthode nous permet d’étudier la structure atomique des assemblages biomoléculaires. Il est très important de préparer soigneusement l’échantillon pour optimiser les conditions RMN, afin d’obtenir des données à haute résolution. Avec ce protocole, nous pouvons obtenir des résolutions atomiques qui sont des informations sur les assemblages de protéines.

Et cette technique peut être combinée avec d’autres techniques en biologie structurale pour obtenir des modèles tridimensionnels.