Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

L'objectif général de ce protocole est d'étudier les structures d'assemblages protéiques supramoléculaires insolubles et non cristallins à une résolution atomique par spectroscopie RMN en état solide avec rotation à l'angle magique. Nous présenterons les étapes méthodologiques essentielles pour l'étude des structures atomiques d'assemblages protéiques biomoléculaires par RMN en état solide. L'étude des structures atomiques de ces assemblages est extrêmement difficile car ils sont par nature insolubles et non cristallins.

La RMN à l'état solide est une technique émergente permettant d'étudier la structure moléculaire et la dynamique à une résolution atomique, sans être limitée par la taille de l'objet assemblé ni par sa solubilité. Nous illustrons ici les étapes clés permettant de visualiser les structures atomiques d'assemblages protéiques biomoléculaires par RMN à l'état solide, y compris la préparation d'échantillons isotopiquement marqués, la collecte et l'analyse de données structurales provenant de la RMN à l'état solide. La première étape d'un protocole de RMN à l'état solide consiste à produire des sous-unités protéiques marquées au C13 et N15, puis à les assembler in vitro.

Inoculez une pré-culture de 15 ml de milieu LB préchauffé avec une colonie de cellules d’E.coli transformées. Incubez à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min pendant la nuit. Pour inoculer la culture principale, transférez l’ensemble de la pré-culture dans un litre de milieu N9 préchauffé contenant les sources isotopiquement marquées de carbone et d’azote nécessaires.

Cela peut inclure du chlorure d'ammonium marqué N15, du glucose marqué C13 uniformément, du glucose marqué C13 de façon sélective ou du glycérol marqué C13 de façon sélective. Incuber à 37 degrés et mesurer la densité optique à 600 nanomètres dès que la culture devient trouble. Lorsque la DO atteint une valeur de 0,8, induire l'expression protéique avec un IPTG à 0,75 millimolaire pendant quatre heures. Noter que les conditions d'induction optimales peuvent varier d'une protéine à l'autre.

Récupérer les cellules par centrifugation pendant 30 minutes à 6 000 G et à quatre degrés. Après la purification des sous-unités protéiques, celles-ci sont assemblées in vitro. Concentrer la protéine à environ un millimolaire dans une unité de filtration centrifuge.

Pour ce faire, introduisez l'échantillon dans l'unité de filtration et centrifugez à 4 000 G pendant 30 minutes. Entre chaque étape de centrifugation, mélangez délicatement la solution dans l'unité de filtration à l'aide d'une pipette afin d'éviter le dépôt de protéines sur la membrane filtrante. Répétez la procédure jusqu'à ce que la concentration souhaitée soit atteinte.

Transférez l'échantillon dans un tube falcon et incubez sous agitation pendant une semaine à température ambiante. Généralement, la polymérisation des sous-unités en filaments s'accompagne d'une turbidité de la solution. Ajoutez de l'azoture de sodium à 0,02 % poids par volume pour éviter toute contamination bactérienne.

Pour récolter l'assemblage protéique, centrifuger l'échantillon pendant une heure à 20 000 G et à quatre degrés. Aspirer la majeure partie du surnageant en laissant uniquement suffisamment de liquide pour recouvrir la surface afin d'éviter le dessèchement de l'échantillon, puis conserver l'échantillon à quatre degrés jusqu'à la mesure. Nous présenterons les expériences essentielles pour une analyse structurale par RMN à l'état solide.

Des expériences unidimensionnelles de polarisation croisée, ou CP, et d'INEPT détectées sur les noyaux de C13 sont utilisées pour détecter respectivement les segments protéiques rigides et flexibles dans l'assemblage, ainsi que pour estimer le degré d'homogénéité structurale et de polymorphisme local. Ici, nous utilisons des valeurs expérimentales standard.

Les plages de paramètres typiques sont indiquées dans le protocole. Insérez le rotor dans l'aimant RMN et lancez la rotation à l'angle magique, comme décrit dans le protocole. Réglez la fréquence de rotation souhaitée et assurez-vous qu'elle est stabilisée à ± 10 hertz près.

Enregistrez un spectre monodimensionnel du proton unique pulsé en utilisant 16 balayages. Configurez une expérience CP proton carbone 1D. Les expériences CP montrent les signaux provenant des résidus dans une conformation rigide. Les paramètres initiaux de l'expérience sont obtenus à partir d'une procédure standard d'optimisation sur un composé de référence.

Les paramètres d'étalonnage des impulsions et de découplage peuvent être optimisés directement sur l'échantillon lorsque la sensibilité est suffisamment élevée. Ici, nous enregistrons un CP avec 16 balayages. Le temps de contact CP et les niveaux de puissance sont choisis en fonction de l'intensité du signal maximale, comme illustré ici pour l'optimisation du temps de contact CP.

L'intensité maximale dans cet exemple est atteinte à 800 millisecondes. Les paramètres de découplage doivent également être réajustés par rapport à ceux initialement définis lors de l'étalonnage avec le composé de référence. Enfin, observez attentivement la localisation des bandes satellites dues à la rotation à la fréquence de rotation à l'angle magique donnée, ici à 18 kilohertz, afin d'éviter tout recouvrement avec le signal.

Enregistrez un spectre de référence CP proton carbone en 1D qui sert de signature spectrale à une dimension. Ici, nous accumulons 128 balayages avec un temps de contact CP de 800 millisecondes, une puissance de découplage de 100 kilohertz, un délai de recyclage de trois secondes et un temps d'acquisition de 20 millisecondes. Traitez l'expérience CP sans apodisation.

Choisissez un pic isolé pour estimer le C39 dans l'échantillon, ce qui indique l'ordre structural et l'homogénéité. Ici, la largeur de ligne, mesurée comme la largeur à mi-hauteur, est d'environ 60 à 70 hertz, ce qui reflète une structure protéique bien ordonnée au sein de l'assemblage. Mettez en place une expérience unidimensionnelle de type INEPT proton-carbone pour sonder les parties très mobiles de l'assemblage protéique.

Enregistrez une expérience de référence INEPT afin de servir d'empreinte pour les segments protéiques mobiles. Les paramètres typiques sont 128 balayages et un temps d'acquisition de 25 millisecondes. Traitez l'expérience proton-carbone INEPT.

Le nombre de signaux et leurs positions indiquent respectivement l'importance de la mobilité des résidus et la composition en acides aminés. Ici, seul le signal provenant du groupe CH2 du tampon twist mérite-y est observé, car la totalité de la protéine se trouve dans un régime rigide au sein de la structure d'assemblage. L'analyse conformationnelle de la structure protéique repose sur l'attribution des résonances RMN à l'état solide pour tous les résidus rigides de l'assemblage.

Cela est rendu possible parce que les déplacements chimiques sont des sondes très sensibles de l'environnement chimique local et peuvent être utilisés pour prédire la structure secondaire de la protéine. La détermination complète de la structure tridimensionnelle repose ensuite sur la collecte de données structurales telles que les contraintes de distance, qui codent les proximités atomiques intramoléculaires et intermoléculaires jusqu'à neuf angströms. Ici, nous montrerons comment les expériences bidimensionnelles de base sont enregistrées et donnerons un exemple d'attribution séquentielle.

Nous donnerons ensuite une brève démonstration sur la manière de recueillir des contraintes de distance à partir d'expériences enregistrées sur des échantillons spécifiquement marqués au C13. Mettez en place l'expérience bidimensionnelle PDSD carbone-carbone avec un court temps de mélange afin de détecter la corrélation carbone-carbone au sein d'un même résidu. Copiez les valeurs de l'étape initiale de transfert d'aimantation proton-carbone provenant de l'expérience unidimensionnelle CP.

Le mélange peut être réglé à 50 millisecondes pour des échantillons uniformément marqués au C13. Ici, nous avons choisi un temps d'acquisition de 15 et 20 millisecondes respectivement dans les dimensions indirecte et directe. Pour traiter le spectre PDSD, nous utilisons une fonction fenêtre QSINE avec un décalage de cloche sinusoidale de 3,5.

Pour permettre l'attribution spécifique des résidus, utilisez les paramètres du PDSD à court temps de mélange afin d'enregistrer un PDSD à temps de mélange intermédiaire, avec un temps de mélange compris entre 100 et 200 millisecondes. Notez que des spectres supplémentaires, notamment des expériences détectées par l'azote, sont souvent nécessaires pour une attribution complète des résonances, et sont décrits en détail dans le protocole. Choisissez un logiciel d'analyse RMN, tel que CCPNMR Analysis.

Chargez les spectres 2D dans le logiciel et créez un objet moléculaire contenant la séquence protéique principale. Commencez par l'identification des types d'acides aminés visibles sur le spectre PDSD à court temps de mélange. La connexion des atomes de carbone des systèmes de spin permet une attribution spécifique au type de résidu.

Ici, nous attribuons le système de spin d'un résidu de thenium. Les transferts de polarisation entre les noyaux C-alpha, C-bêta et C-gamma conduisent à des pics croisés physiques dans le spectre PDSD. Essayez d'identifier autant de résidus que possible à l'aide de cette procédure.

Superposez à la fois le spectre PDSD à court temps de mélange et celui à temps de mélange intermédiaire. Les pics supplémentaires visibles dans le spectre PDSD à temps de mélange intermédiaire proviennent généralement de contacts entre des résidus séquentiels. Marquez les pics de résonance d'un système de spins et recherchez les corrélations dans le spectre PDSD à temps de mélange intermédiaire avec les fréquences de résonance d'autres systèmes de spins.

Nous montrons l'attribution séquentielle du thenium 33 à l'isolutane 32 dans notre assemblage protéique filamenteux. Les fréquences de résonance du système de spin du thenium sont visibles sur une fréquence de carbone des isolutanes dans 32, et inversement. Les procédures d'attribution à l'aide de spectres détectés par l'azote et d'obtention de la structure secondaire de la protéine à partir des attributions sont décrites dans le protocole.

Après une attribution complète des résonances, nous pouvons passer à l'identification des contraintes à longue distance. Les contraintes à longue distance sont des proximités intra- ou intermoléculaires entre atomes de carbone appartenant à des résidus éloignés, qui définissent à la fois le repliement tertiaire des sous-unités monomériques et l'agencement des sous-unités au sein de l'assemblage. Ici, les échantillons marqués sélectivement au C13 revêtent une importance particulière.

Superposer un PDSD à temps de mélange intermédiaire avec un PDSD à long temps de mélange carbone-carbone, enregistré avec un temps de mélange compris entre 400 millisecondes et une seconde, sur un échantillon marqué sélectivement au C13. Si possible, les deux PDSD doivent avoir été enregistrés sur le même échantillon marqué sélectivement. Des pics supplémentaires proviennent de corrélations entre des atomes de C13 plus éloignés.

Lors de l'attribution des résonances, tenez compte du schéma de marquage sélectif. Dans ce cas, le glycérol 1-3. Ici, nous avons mis en évidence un exemple de pic de contact à longue distance avec une attribution sans ambiguïté dans les deux dimensions.

Thenium 33 C-bêta avec la protéine 45 C-alpha. Après avoir effectué l'identification des distances à longue portée, les contraintes sont classées comme étant non ambiguës ou ambiguës, ainsi que comme intramoléculaires ou intermoléculaires. Les listes de contraintes à préparer pour la modélisation structurale sont indiquées dans le protocole.

Des tutoriels sur la modélisation structurale à l'aide de différents programmes sont disponibles en ligne. Les données de RMN en état solide, prises isolément ou en combinaison avec des données complémentaires, permettent la détermination de la structure à l'échelle atomique d'assemblages supramoléculaires. Les avantages de la RMN en état solide résident, d'une part, dans la capacité à fournir des informations sur la structure secondaire ainsi que des contraintes de distance atomique provenant des interfaces intramoléculaires, qui peuvent être intégrées au processus de modélisation.

Pourtant, d'un autre côté, la caractéristique unique de la spectroscopie RMN à l'état solide réside dans sa capacité à recueillir des contraintes de distance atomique aux interfaces intermoléculaires d'un assemblage supramoléculaire intact. La détection et la distinction entre les attributions de contraintes intramoléculaires et intermoléculaires peuvent toutefois constituer un processus fastidieux, nécessitant généralement la préparation d'échantillons marqués sélectivement au C13. Toutefois, grâce à de récents progrès dans les stratégies de marquage sélectif, la conception du matériel du spectromètre et les méthodologies de RMN à l'état solide, cette technique réalise de plus en plus son potentiel théorique de fournir des informations moléculaires au niveau atomique, sans limitation liée à la taille de l'objet, à l'ordre à longue portée ou à la cristallinité.

Cette méthode nous permet d'étudier la structure atomique des assemblages biomoléculaires. Il est très important de préparer soigneusement l'échantillon afin d'optimiser les conditions de RMN et d'obtenir des données haute résolution. Grâce à ce protocole, nous pouvons obtenir des résolutions atomiques, qui fournissent des informations sur les assemblages protéiques.

Et cette technique peut être combinée à d'autres techniques en biologie structurale afin d'obtenir des modèles tridimensionnels.