Name: Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Découvrez la spectroscopie RMN à l'état solide MAS pour étudier les structures atomiques d'assemblages protéiques insolubles et non cristallins. Cette méthode permet de visualiser les architectures moléculaires complexes.

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Ce travail est financé par l’ANR (13-CDRP-0017-01 B.H. et ANR-14-CE09-0020-01 à A.L.), « Investissements d’avenir » Programme IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 à B.H.) référence ANR-10-IDEX-03-02 à B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 à A.L.), le programme FP7 (pcrd7-personnes-2013-CIG à A.L.) et le Conseil européen de la recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (ERC Starting Grant à A.L., contrat N° 639020) et le projet " WEAKINTERACT. »

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La RMN à l’état solide (SSNMR) est une méthode de choix pour la caractérisation des assemblages macromoléculaires protéiques au niveau atomique. Une des questions centrales dans la détermination de la structure axée sur les SSNMR est la qualité spectrale du système étudié, qui permet d’établir des modèles structurels 3D de précision différents, qui vont généralement de modèles basse résolution (contenant l’image secondaire structure des éléments et peu d’information 3D) aux structures 3D Pseudo-aléatoire atomiques. La quantité et la qualité des informations structurales extraites des expériences multidimensionnelles de SSNMR est la clé pour calculer une structure RMN haute résolution de l’Assemblée.
Le protocole décrit repose sur la détection de 13C -13C et 15N -13C structurelle retenue nécessitant l’enregistrement de plusieurs spectres 2D (et parfois 3D) avec signal sur bruit élevé. À des fréquences de MAS modérées (&#60; 25 kHz), l’échantillon est introduit dans les rotors avec tailles de 3,2 à 4 mm de diamètre permettant de quantités de protéine jusqu'à ~ 50 mg, dépendant de l’hydratation de l’échantillon. La quantité de l’échantillon à l’intérieur du rotor est directement proportionnelle à la ratio signal-bruit dans les spectres SSNMR, un facteur décisif pour la détection des contraintes de distance longue portée ainsi que leur affectation sans ambiguïté.
La résolution spectrale est un paramètre crucial lors de la cession de résonance séquentielle et la collection de restrictions. Pour obtenir des résultats optimaux, les paramètres de préparation d’échantillon doivent être optimisés, notamment dans la purification de la sous-unité et les conditions de montage (pH, tampon, secouant, température, etc.). Pour l’optimisation de l’échantillon, il est recommandé de préparer les échantillons non étiquetées pour plusieurs conditions distinctes pour lesquelles l’Assemblée a été observée et d’enregistrer un 1D 1H13C CP spectre (décrit à l’étape 2.1) sur chaque échantillon préparé. Les spectres permettent de confronter la résolution spectrale et la dispersion entre les différentes préparations, selon qui les conditions optimales peuvent être jugées.
La qualité des données SSNMR dépend fortement du choix des paramètres d’acquisition du NMR, surtout pour les étapes de transfert de polarisation. L’utilisation des intensités de champ magnétique élevées (fréquence de 1H ≥600 MHz) est essentielle pour la haute sensibilité et résolution spectrale, nécessaire face à des cibles complexes tels que les assemblages macromoléculaires protéiques.
Un facteur limitatif dans bien des cas est la disponibilité de spectromètre. Par conséquent, un choix judicieux des échantillons pour être préparé doit précéder la session spectromètre. Dans tous les cas, uniformément 13C, 15échantillon marqué N est une condition sine qua non pour effectuer l’assignation de résonance séquentielle et intra-résiduelle. Pour les protéines assignés par des techniques de RMN à l’état solide voir71. Détermination de la structure des assemblages macromoléculaires à des fréquences de MAS modérées nécessite sélectivement 13échantillons marqués au C ; pour la détection à longue distance 13C -13C et 13C -15N entre en contact avec échantillons basée sur 1, 3 -13C - et 2 -13C-gylcerol ou 1 -13C - et 2 -13C-glucose étiquetage sont couramment utilisés, comme décrit ci-dessus. Le choix entre les deux régimes d’étiquetage est issu de la spectrale ratio signal-bruit et de la résolution. Pour distinguer entre intra - et intermoléculaires contacts à longue distance, mixtes échantillons étiquetés et dilués ont révélé efficace.
En bref, les étapes essentielles pour une étude structurale de SSNMR atomique sont : (i) la préparation des sous-unités et la nécessité de l’Assemblée d’être optimisée pour obtenir l’excellent échantillon quantitatif et qualitatif, les paramètres de résistance et d’acquisition du champ spectromètre (ii) doivent être choisis avec soin ; (iii) sélectifs étiquetage stratégies sont nécessaires pour une détermination de la structure 3D et la quantité de données requises dépend de la qualité des données et la disponibilité de données complémentaires.
Malgré son applicabilité à un large éventail de systèmes supramoléculaires allant de protéines membranaires à homomultimeric nano-objets, SSNMR est souvent limitée par la nécessité pour les mg-quantités de matériau isotopiquement étiqueté. Les récents développements technologiques en ultra-rapide SSNMR MAS (≥100 kHz) ouvert vers le haut de l’avenue à 1H-détecté NMR et pousser la limite de la quantité d’échantillon minimal pour sub-mg 72,,du7374. Néanmoins, pour des études structurelles détaillées 13C marqué échantillons sont indispensables, ce qui limite l’application de SSNMR d’échantillons rassemblés en vitro ou de systèmes exprimés dans les organismes qui survivent dans un milieu minimal lorsque dans la cellule SSNMR est une nouvelle méthode (pour 75,76,77,78, voir commentaires).
Un facteur important dans l’application SSNMR pour obtenir des structures 3D haute résolution est la résolution spectrale : intrinsèque hétérogénéité conformationnelle dans un assembly peut limiter l’analyse spectrale de spectres et de résolution. Résidus spécifiques 13C étiquetage peut dans certains cas fournir une alternative pour obtenir des informations de distance spécifique sur les résidus de stratégiques afin d’obtenir des modèles structuraux (pour une récente voir du 79,d’exemples80).
SSNMR pour la détermination de la structure 3D nécessite toujours la collecte de plusieurs ensembles de données avec des temps de collection de données souvent long sur des instruments sophistiqués, selon l’approche et le système de plusieurs jours à plusieurs semaines sur un 600-1000 MHz (fréquence de1H) spectromètre. Par conséquent, l’accès au temps du spectromètre peut être un facteur limitant dans une étude approfondie de la SSNMR.
Dans le cas des ensembles de protéines homomultimeric, conduisant à des données SSNMR d’une qualité suffisante pour identifier un grand nombre de contraintes structurelles telles que dans 3,57,64,70, SSNMR ne donne toujours aucun accès aux dimensions microscopiques. Par conséquent, dans une détermination de structure SSNMR de novo d’un assembly homomultimeric, EM ou par longueur-masse (MPL) données idéalement complément données SSNMR pour calculer les paramètres de la symétrie. Données SSNMR seules fournissent atomique intra - et intermoléculaires interfaces
SSNMR est très complémentaire avec les techniques structurelles telles que les mesures EM ou MPL, mais les données peuvent aussi parfaitement être combinées avec la structure atomique obtenue par cristallographie aux rayons x ou la RMN en solution sur des sous-unités mutées ou tronquées. Un nombre croissant d’études se trouvent dans la littérature où la conjonction de différentes données structurelles a permis de déterminer des modèles 3D atomiques des assemblages macromoléculaires (voir Figure 6 exemples représentatifs).
Dans le domaine de la biologie structurale, SSNMR apparaît comme une technique prometteuse pour étudierassemblys insolubles et non cristalline à l’atomique niveau, c.-à-d. fournissant structurelle des données à l’échelle atomique. À cet égard, SSNMR est le pendentif à solution NMR et cristallographie de rayon x pour assemblages moléculaires, y compris les protéines membranaires de leurs assemblées d’environnement et de la protéine natives comme enveloppes virales, bactériennes filaments ou amyloïdes, RNA et Complexes ARN-protéine (voir, par exemple,81). Ses applications hautement versatile in vitro et dans le contexte cellulaire, comme le suivi des modifications de structures secondaires, tertiaires et quaternaires, identification des surfaces d’interaction avec les molécules de partenaire à l’échelle atomique (par exemple, 82) et cartographie dynamique moléculaire dans le cadre des assemblées complexes, indiquent le potentiel important de SSNMR dans de futures études structurales sur les assemblys biomoléculaire complexes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Moyen de M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6.7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mélange de vitamine MEM 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glucose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Composition du milieu minimal d’expression de protéine recombinante production de E. coli cellules BL21.

Les progrès dans la filature de la spectroscopie RMN à l’état solide (SSNMR) à l’angle magique offrent un outil efficace pour la caractérisation des assemblages macromoléculaires protéiques à une résolution atomique. Ces ensembles de protéines sont des systèmes ubiquitaires qui jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques. Leurs structures moléculaires, les interactions et les dynamiques sont accessibles par des études SSNMR, comme l’a montré pour virale (capsides1) et des mécanismes d’infection bactérienne (sécrétion systèmes2,3, pili,4), membrane protéines complexes5,6,7,8 et fonctionnelle amyloïdes 9,10,11. Ce type d’assemblage moléculaire peut également provoquer des pathologies telles que les maladies neurodégénératives où les protéines se réunissent dans des États mal repliées, amyloïdes et provoquent un comportement aberrant de cellule ou cellule mort 12,13. Ensembles de protéines sont souvent construits par l’oligomérisation symétrique des copies multiples de sous-unités protéiques en gros objets supramoléculaires de différentes formes, y compris les fibrilles, les filaments, les pores, les tubes ou les nanoparticules. L’architecture du Quaternaire est définie par des interactions faibles entre les sous-unités protéiques d’organiser l’Assemblée spatiale et temporelle et pour permettre des fonctions biologiques sophistiquées. Enquêtes structurelles à l’échelle atomique sur ces assemblées sont un défi pour les techniques de haute résolution depuis leur insolubilité intrinsèque et très souvent leur cristallinité-non restreint l’utilisation de la diffraction conventionnelle ou solution NMR approches. Magie-angle spinning SSNMR (MAS) est une technique émergente d’obtenir des données de résolution atomique sur des assemblages macromoléculaires insolubles et a prouvé son efficacité pour résoudre les modèles atomiques 3D pour un nombre croissant de systèmes biomoléculaires complexes y compris filaments bactériens, les assemblys amyloïdes et les particules virales 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Des progrès techniques sur les champs magnétiques élevés, des développements méthodologiques et préparation des échantillons a établi SSNMR MAS dans une méthode robuste pour étudier les protéines insolubles dans divers environnements, notamment dans leur biologiquement pertinente macromoléculaires assemblées d’État ou dans les membranes cellulaires, ce qui rend la technique très complémentaire de cryo-microscopie électronique. Dans de nombreux cas, un très haut degré de symétrie caractérise ces assemblys de protéine. MAS SSNMR exploite cette fonctionnalité, comme toutes les sous-unités protéiques dans un assembly homomolecular aurait la même structure locale et donc pratiquement la même de signature SSNMR, réduisant considérablement la complexité de l’analyse.
Un protocole efficace pour des études structurales des assemblages macromoléculaires protéiques par MAS modérées (&#60; 25KHz) SSNMR est présenté dans cette vidéo et peut être subdivisée en différentes étapes (Figure 1). Nous allons démontrer les étapes cruciales du flux de travail d’une étude structurale de SSNMR illustrée sur un assemblage de protéines filamenteuses (voir mis en évidence les étapes à la Figure 1), à l’exception de purification de protéine de sous-unité, différentes pour chaque protéine l’Assemblée mais d’une importance cruciale pour les études structurales et sans entrer dans les détails techniques/méthodologiques de calcul de structure et de la spectroscopie SSNMR pour quels tutoriels spécialisés sont disponibles en ligne. Alors que le présent Protocole se concentrera principalement sur les expériences de RMN à l’état solide effectués dans des conditions de MAS, l’utilisation d’alignés environnements biologiques 23,24,25,26 , 27, tels que bicelles alignées, permettre l’enquête de la conformation des protéines et l’interaction dynamique de protéine-protéine dans les médias de type membrane sans la technologie MAS. Nous allons montrer l’expression de la protéine et étapes de l’assemblage ainsi que l’enregistrement des spectres SSNMR cruciales et leur analyse et l’interprétation. Notre but est de donner un aperçu de l’oléoduc d’analyse structurale permettant au lecteur d’effectuer une étude structurale d’atomique-résolution d’une Assemblée macromoléculaire par des techniques SSNMR.
Le protocole comprend 3 sections :
1. à l’état solide production d’échantillon de NMR
Comme une condition préalable à une analyse par RMN à l’état solide, les constituants protéiques de la nécessité de macromoléculaires Assemblée de s’exprimer, isotopes marqués, purifiée et assemblé in vitro dans l’état natif complexe (pour un exemple, voir Figure 2) . Pour assurer la haute sensibilité de NMR, enrichissement isotopique 13C et 15N étiquetage est nécessaire grâce à l’utilisation de médias minime expression bactérienne additionné de 13C et sources d’azote 15, comme uniformément 13 C-étiqueté glucose/glycérol et 15NH4Cl respectivement. Dans le stade avancé du protocole, sélectivement 13C marqué échantillons produit avec sélectivement 13C marqué des sources telles que (1, 3 -13C)- et (2 -13C)-glycérol (ou (1 -13C)- et (2 -13C)- le glucose) sont utilisés pour faciliter l’analyse par RMN. Échantillon étiqueté mélangé correspondant à un mélange équimolaire de soit 50 % 15N - et 50 % 13C marqué ou 50 % (1, 3 -13C)- et 50 % (2 -13C)-glucose ont été introduites pour décrire la détection d’intermoléculaire interactions. Un haut degré de pureté de la protéine ainsi que des conditions rigoureuses au cours de l’étape d’assemblage sont des facteurs clés pour assurer un ordre structurel homogène de l’échantillon final.
2. préliminaire caractérisation structurale basée sur unidimensionnelle (1D) à semi-conducteurs NMR
Nous présentons les expériences essentielles pour l’analyse structurale par SSNMR. Unidimensionnelle (1D) polarisation croisée (CP) et INEPT / RINEPT28 expériences, détectés sur les noyaux de 13C sont utilisées pour détecter des segments rigides et flexibles de protéine dans l’Assemblée, respectivement et d’estimer le degré de structure homogénéité et polymorphisme local (pour un exemple, voir Figure 3).
<st></st>Rong &gt; 3. Détermination de structure de l’analyse conformationnelle et 3D
Les paragraphes 1 et 2 concernent l’analyse conformationnelle, qui repose sur l’affectation de résonance SSNMR de tous les résidus rigides de l’Assemblée de protéines, comme les déplacements chimiques sont des sondes très sensibles à l’environnement local et peuvent être utilisés pour prédire la phi/psi dièdre angles et déterminer ainsi la structure secondaire. La figure 4 illustre un exemple d’une cession de résonance séquentielle dans le noyau rigide d’un assemblage de protéines. La détermination de la structure 3D repose sur la collecte des données structurelles, telles que les contraintes de distance encodage fermer proximités (&#60; Å 7-9), contenant aussi bien intra - et intermoléculaires informations. Les paragraphes 3 et 4 décrivent interprétation et collection de retenue lointain à longue distance. Contacts à longue distance sont définis comme intramoléculaires 13C -13C proximités provenant de tout résidu i à j, avec | i-j | ≥ 4, définissant ainsi le giron de la protéine tertiaire de la sous-unité monomère ou intermoléculaires 13C -13C proximités, définir les interfaces intermoléculaires entre les sous-unités protéiques dans l’assembly. Intra - et intermoléculaires interfaces sont illustrées à la Figure 5. Dispositifs de retenue pour SSNMR détectée par le biais de 13C -13C et 15N -13C raccordement expériences habituellement codent pour des distances internucléaires &#60; 1 nm. Paragraphe 4 explique la détection des dispositifs de retenue de la distance intermoléculaire. Dans les assemblys de protéine symétrique, l’utilisation d’échantillons étiquetés de façon homogène (c'est-à-dire 100 % uniformément ou sélectivement marqués) pour identifier les interactions intermoléculaires sous-unité sous-unité est limité, comme les deux intra - et inter-moléculaires contacts aboutissent à signaux détectables. La détection sans ambiguïté des proximités intermoléculaires est obtenue en utilisant mixtes échantillons étiquetés, contenant un mélange équimolaire de deux échantillons différemment étiquetées, combiné avant l’agrégation. Paragraphe 5 présente brièvement la modélisation de la structure.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figure 1 : D’une étude d’atomique-résolution structurale par RMN à l’état solide, les flux de travail. 13 C, 15N isotopique marqué la production de protéines, purification de la sous-unité, Assemblée de sous-unité, contrôle de la formation de l’Assemblée, SSNMR des expériences, analyse expérience SSNMR et extraction des contraintes de distance et modélisation de la structure sont indiqués. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre RMN (> 11,7 Tesla)</td><td>Bruker-triple</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>resonance MAS SSNMR probehead&nbsp ;</td><td>Rotors Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5804 R&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 spectromètre</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 shaker orbital de paillasse</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver Agitateur</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur à micro-pulseurs</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN tetra cell system</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure system</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>pipette capillaire microman M25</td><td>Gilson&nbsp ;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>capillaires et pistons</td><td>Gilson&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F148112 spatule</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glycérol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glycérol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de fer</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de zinc Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Solution (100&times ;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>azoture de sodium</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4,4-diméthyl-4-silapentane-1-sulfonique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp ;</td><td></td><td>systèmes de spectrométrie</td></tr></tbody></table>

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie rmn à l’état solide

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Assemblages supramoléculaires protéines jouent un rôle fondamental dans les processus biologiques allant de l’interaction hôte-pathogène, infection virale à la propagation de maladies neurodégénératives. Ces assemblys consistent en plusieurs sous-unités protéiques organisées d’une manière non covalentes pour former de grands objets macromoléculaires qui peuvent exécuter une variété de fonctions cellulaires ou provoquer des conséquences néfastes. Perspicacités atomiques dans les mécanismes de l’assemblage et le fonctionnement de ces assemblages macromoléculaires restent souvent peu abondantes depuis leur insolubilité inhérente et non-cristallinité souvent radicalement réduit la qualité des données obtenues de la plupart des techniques utilisé en biologie structurale, tels que la cristallographie aux rayons x et la solution de résonance magnétique nucléaire (RMN). Nous présentons ici la spectroscopie RMN à l’état solide de rotation à l’angle magique (SSNMR) comme une méthode puissante pour étudier les structures des assemblages macromoléculaires à résolution atomique. SSNMR peut révéler des détails atomiques sur le complexe assemblé sans limites de taille et de la solubilité. Le protocole présenté ici décrit les étapes essentielles de la production de 13C /15N les assemblys marqués isotope macromoléculaires protéiques à l’acquisition du standard des spectres de SSNMR et leur analyse et leur interprétation. À titre d’exemple, nous montrons le pipeline d’une analyse structurale de le SSNMR d’un assemblage de protéines filamenteuses.

Le workflow SSNMR typique comporte plusieurs étapes illustrées dans la Figure 1. Habituellement les sous-unités protéiques sont produites par in vitro expression hétérologue chez e. coli, purifiées et assemblées sous agitation, mais parfois aussi dans des conditions statiques. Expression et purification de la sous-unité de la protéine sont suivis par chromatographie sur gel SDS (Figure 2 a). La formation des assemblages macromoléculaires peut ensuite être confirmée par l’analyse au microscope électronique (EM) (voir la Figure 2 b pour obtenir un exemple d’un assembly filamenteux).
Après l’introduction de l’ensemble de la protéine dans le rotor SSNMR, le rotor est inséré dans le spectromètre, la fréquence de MAS et la température sont réglementés et les spectres sont enregistrés. Premier aperçu peut être obtenue par les techniques de SSNMR 1D. La figure 3 montre un FID SSNMR typique détectée sur le canal 13C sur un échantillon de protéine structurellement homogènes, un 1H13C CP spectre, révélant les résonances de13C présents dans le noyau rigide de la sous-unité de la protéine dans la l’Assemblée et un spectre 2D 1H -13C INEPTE, représentant les résidus mobiles. Pour les idées atomiques dans le noyau rigide de la structure de l’Assemblée, des expériences de SSNMR multidimensionnelle doivent être enregistrées sur uniformément et sélectivement marqués d’échantillons pour les résonances SSNMR d’abord assigner et alors détecter de proximités à longue distance (voir Figure 4 de ).
Tous les spectres sont traités et analysés avec le logiciel adéquat pour attribuer les résonances SSNMR et extraire intra - et les contraintes de distance intermoléculaire (Figure 5). Les contraintes de distance SSNMR sont soit utilisés seul ou en conjonction avec les données techniques complémentaires, qui peuvent être intégrés dans le programme de modélisation.
Pour les structures atomiques représentatives des assemblages macromoléculaires résolus par des techniques SSNMR la Figure 6 illustre plusieurs assemblys filamenteux d’appendices bactériennes et de fibrilles amyloïdes.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figure 6:filamenteux structures macromoléculaires, déterminées par une approche de RMN à l’état solide : filaments bactériens et des fibrilles de protéine amyloïde. A) pilus de Type 1 des uropathogènes e. coli, PDB code 2N7H 4; B) ASC filament, PDB code 2N1F 63; C) aiguilles de système de sécrétion de Type III, APB codes 2MME, 2LPZ et 2MEX 2,3,64; D) bêta-amyloïde Aß42 fibrilles, PDB code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,,du6667 et Osaka mutant PDB code 2MVX 57, Iowa mutant PDB code 2MPZ 58; E) Alpha-synucléine fibrilles, PDB code 2N0A 68; F) domaine de prion HET-s, 2RNM code PDB, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Structures des assemblages supramoléculaires protéine à résolution atomique sont de grande importance en raison de leur rôle crucial dans une variété de phénomènes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des études structurales à haute résolution sur des ensembles de protéines macromoléculaire insoluble et non cristalline par magie-angle spinning spectroscopie RMN à l’état solide (MAS SSNMR).

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

L'objectif général de ce protocole est d'étudier les structures d'assemblages protéiques supramoléculaires insolubles et non cristallins à une résolution atomique par spectroscopie RMN en état solide avec rotation à l'angle magique. Nous présenterons les étapes méthodologiques essentielles pour l'étude des structures atomiques d'assemblages protéiques biomoléculaires par RMN en état solide. L'étude des structures atomiques de ces assemblages est extrêmement difficile car ils sont par nature insolubles et non cristallins.La RMN à l'état solide est une technique émergente permettant d'étudier la structure moléculaire et la dynamique à une résolution atomique, sans être limitée par la taille de l'objet assemblé ni par sa solubilité. Nous illustrons ici les étapes clés permettant de visualiser les structures atomiques d'assemblages protéiques biomoléculaires par RMN à l'état solide, y compris la préparation d'échantillons isotopiquement marqués, la collecte et l'analyse de données structurales provenant de la RMN à l'état solide. La première étape d'un protocole de RMN à l'état solide consiste à produire des sous-unités protéiques marquées au C13 et N15, puis à les assembler in vitro.Inoculez une pré-culture de 15 ml de milieu LB préchauffé avec une colonie de cellules d’E.coli transformées. Incubez à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min pendant la nuit. Pour inoculer la culture principale, transférez l’ensemble de la pré-culture dans un litre de milieu N9 préchauffé contenant les sources isotopiquement marquées de carbone et d’azote nécessaires.Cela peut inclure du chlorure d'ammonium marqué N15, du glucose marqué C13 uniformément, du glucose marqué C13 de façon sélective ou du glycérol marqué C13 de façon sélective. Incuber à 37 degrés et mesurer la densité optique à 600 nanomètres dès que la culture devient trouble. Lorsque la DO atteint une valeur de 0,8, induire l'expression protéique avec un IPTG à 0,75 millimolaire pendant quatre heures. Noter que les conditions d'induction optimales peuvent varier d'une protéine à l'autre.Récupérer les cellules par centrifugation pendant 30 minutes à 6 000 G et à quatre degrés. Après la purification des sous-unités protéiques, celles-ci sont assemblées in vitro. Concentrer la protéine à environ un millimolaire dans une unité de filtration centrifuge.Pour ce faire, introduisez l'échantillon dans l'unité de filtration et centrifugez à 4 000 G pendant 30 minutes. Entre chaque étape de centrifugation, mélangez délicatement la solution dans l'unité de filtration à l'aide d'une pipette afin d'éviter le dépôt de protéines sur la membrane filtrante. Répétez la procédure jusqu'à ce que la concentration souhaitée soit atteinte.Transférez l'échantillon dans un tube falcon et incubez sous agitation pendant une semaine à température ambiante. Généralement, la polymérisation des sous-unités en filaments s'accompagne d'une turbidité de la solution. Ajoutez de l'azoture de sodium à 0,02 % poids par volume pour éviter toute contamination bactérienne.Pour récolter l'assemblage protéique, centrifuger l'échantillon pendant une heure à 20 000 G et à quatre degrés. Aspirer la majeure partie du surnageant en laissant uniquement suffisamment de liquide pour recouvrir la surface afin d'éviter le dessèchement de l'échantillon, puis conserver l'échantillon à quatre degrés jusqu'à la mesure. Nous présenterons les expériences essentielles pour une analyse structurale par RMN à l'état solide.Des expériences unidimensionnelles de polarisation croisée, ou CP, et d'INEPT détectées sur les noyaux de C13 sont utilisées pour détecter respectivement les segments protéiques rigides et flexibles dans l'assemblage, ainsi que pour estimer le degré d'homogénéité structurale et de polymorphisme local. Ici, nous utilisons des valeurs expérimentales standard.Les plages de paramètres typiques sont indiquées dans le protocole. Insérez le rotor dans l'aimant RMN et lancez la rotation à l'angle magique, comme décrit dans le protocole. Réglez la fréquence de rotation souhaitée et assurez-vous qu'elle est stabilisée à ± 10 hertz près.Enregistrez un spectre monodimensionnel du proton unique pulsé en utilisant 16 balayages. Configurez une expérience CP proton carbone 1D. Les expériences CP montrent les signaux provenant des résidus dans une conformation rigide. Les paramètres initiaux de l'expérience sont obtenus à partir d'une procédure standard d'optimisation sur un composé de référence.Les paramètres d'étalonnage des impulsions et de découplage peuvent être optimisés directement sur l'échantillon lorsque la sensibilité est suffisamment élevée. Ici, nous enregistrons un CP avec 16 balayages. Le temps de contact CP et les niveaux de puissance sont choisis en fonction de l'intensité du signal maximale, comme illustré ici pour l'optimisation du temps de contact CP.L'intensité maximale dans cet exemple est atteinte à 800 millisecondes. Les paramètres de découplage doivent également être réajustés par rapport à ceux initialement définis lors de l'étalonnage avec le composé de référence. Enfin, observez attentivement la localisation des bandes satellites dues à la rotation à la fréquence de rotation à l'angle magique donnée, ici à 18 kilohertz, afin d'éviter tout recouvrement avec le signal.Enregistrez un spectre de référence CP proton carbone en 1D qui sert de signature spectrale à une dimension. Ici, nous accumulons 128 balayages avec un temps de contact CP de 800 millisecondes, une puissance de découplage de 100 kilohertz, un délai de recyclage de trois secondes et un temps d'acquisition de 20 millisecondes. Traitez l'expérience CP sans apodisation.Choisissez un pic isolé pour estimer le C39 dans l'échantillon, ce qui indique l'ordre structural et l'homogénéité. Ici, la largeur de ligne, mesurée comme la largeur à mi-hauteur, est d'environ 60 à 70 hertz, ce qui reflète une structure protéique bien ordonnée au sein de l'assemblage. Mettez en place une expérience unidimensionnelle de type INEPT proton-carbone pour sonder les parties très mobiles de l'assemblage protéique.Enregistrez une expérience de référence INEPT afin de servir d'empreinte pour les segments protéiques mobiles. Les paramètres typiques sont 128 balayages et un temps d'acquisition de 25 millisecondes. Traitez l'expérience proton-carbone INEPT.Le nombre de signaux et leurs positions indiquent respectivement l'importance de la mobilité des résidus et la composition en acides aminés. Ici, seul le signal provenant du groupe CH2 du tampon twist mérite-y est observé, car la totalité de la protéine se trouve dans un régime rigide au sein de la structure d'assemblage. L'analyse conformationnelle de la structure protéique repose sur l'attribution des résonances RMN à l'état solide pour tous les résidus rigides de l'assemblage.Cela est rendu possible parce que les déplacements chimiques sont des sondes très sensibles de l'environnement chimique local et peuvent être utilisés pour prédire la structure secondaire de la protéine. La détermination complète de la structure tridimensionnelle repose ensuite sur la collecte de données structurales telles que les contraintes de distance, qui codent les proximités atomiques intramoléculaires et intermoléculaires jusqu'à neuf angströms. Ici, nous montrerons comment les expériences bidimensionnelles de base sont enregistrées et donnerons un exemple d'attribution séquentielle.Nous donnerons ensuite une brève démonstration sur la manière de recueillir des contraintes de distance à partir d'expériences enregistrées sur des échantillons spécifiquement marqués au C13. Mettez en place l'expérience bidimensionnelle PDSD carbone-carbone avec un court temps de mélange afin de détecter la corrélation carbone-carbone au sein d'un même résidu. Copiez les valeurs de l'étape initiale de transfert d'aimantation proton-carbone provenant de l'expérience unidimensionnelle CP.Le mélange peut être réglé à 50 millisecondes pour des échantillons uniformément marqués au C13. Ici, nous avons choisi un temps d'acquisition de 15 et 20 millisecondes respectivement dans les dimensions indirecte et directe. Pour traiter le spectre PDSD, nous utilisons une fonction fenêtre QSINE avec un décalage de cloche sinusoidale de 3,5.Pour permettre l'attribution spécifique des résidus, utilisez les paramètres du PDSD à court temps de mélange afin d'enregistrer un PDSD à temps de mélange intermédiaire, avec un temps de mélange compris entre 100 et 200 millisecondes. Notez que des spectres supplémentaires, notamment des expériences détectées par l'azote, sont souvent nécessaires pour une attribution complète des résonances, et sont décrits en détail dans le protocole. Choisissez un logiciel d'analyse RMN, tel que CCPNMR Analysis.Chargez les spectres 2D dans le logiciel et créez un objet moléculaire contenant la séquence protéique principale. Commencez par l'identification des types d'acides aminés visibles sur le spectre PDSD à court temps de mélange. La connexion des atomes de carbone des systèmes de spin permet une attribution spécifique au type de résidu.Ici, nous attribuons le système de spin d'un résidu de thenium. Les transferts de polarisation entre les noyaux C-alpha, C-bêta et C-gamma conduisent à des pics croisés physiques dans le spectre PDSD. Essayez d'identifier autant de résidus que possible à l'aide de cette procédure.Superposez à la fois le spectre PDSD à court temps de mélange et celui à temps de mélange intermédiaire. Les pics supplémentaires visibles dans le spectre PDSD à temps de mélange intermédiaire proviennent généralement de contacts entre des résidus séquentiels. Marquez les pics de résonance d'un système de spins et recherchez les corrélations dans le spectre PDSD à temps de mélange intermédiaire avec les fréquences de résonance d'autres systèmes de spins.Nous montrons l'attribution séquentielle du thenium 33 à l'isolutane 32 dans notre assemblage protéique filamenteux. Les fréquences de résonance du système de spin du thenium sont visibles sur une fréquence de carbone des isolutanes dans 32, et inversement. Les procédures d'attribution à l'aide de spectres détectés par l'azote et d'obtention de la structure secondaire de la protéine à partir des attributions sont décrites dans le protocole.Après une attribution complète des résonances, nous pouvons passer à l'identification des contraintes à longue distance. Les contraintes à longue distance sont des proximités intra- ou intermoléculaires entre atomes de carbone appartenant à des résidus éloignés, qui définissent à la fois le repliement tertiaire des sous-unités monomériques et l'agencement des sous-unités au sein de l'assemblage. Ici, les échantillons marqués sélectivement au C13 revêtent une importance particulière.Superposer un PDSD à temps de mélange intermédiaire avec un PDSD à long temps de mélange carbone-carbone, enregistré avec un temps de mélange compris entre 400 millisecondes et une seconde, sur un échantillon marqué sélectivement au C13. Si possible, les deux PDSD doivent avoir été enregistrés sur le même échantillon marqué sélectivement. Des pics supplémentaires proviennent de corrélations entre des atomes de C13 plus éloignés.Lors de l'attribution des résonances, tenez compte du schéma de marquage sélectif. Dans ce cas, le glycérol 1-3. Ici, nous avons mis en évidence un exemple de pic de contact à longue distance avec une attribution sans ambiguïté dans les deux dimensions.Thenium 33 C-bêta avec la protéine 45 C-alpha. Après avoir effectué l'identification des distances à longue portée, les contraintes sont classées comme étant non ambiguës ou ambiguës, ainsi que comme intramoléculaires ou intermoléculaires. Les listes de contraintes à préparer pour la modélisation structurale sont indiquées dans le protocole.Des tutoriels sur la modélisation structurale à l'aide de différents programmes sont disponibles en ligne. Les données de RMN en état solide, prises isolément ou en combinaison avec des données complémentaires, permettent la détermination de la structure à l'échelle atomique d'assemblages supramoléculaires. Les avantages de la RMN en état solide résident, d'une part, dans la capacité à fournir des informations sur la structure secondaire ainsi que des contraintes de distance atomique provenant des interfaces intramoléculaires, qui peuvent être intégrées au processus de modélisation.Pourtant, d'un autre côté, la caractéristique unique de la spectroscopie RMN à l'état solide réside dans sa capacité à recueillir des contraintes de distance atomique aux interfaces intermoléculaires d'un assemblage supramoléculaire intact. La détection et la distinction entre les attributions de contraintes intramoléculaires et intermoléculaires peuvent toutefois constituer un processus fastidieux, nécessitant généralement la préparation d'échantillons marqués sélectivement au C13. Toutefois, grâce à de récents progrès dans les stratégies de marquage sélectif, la conception du matériel du spectromètre et les méthodologies de RMN à l'état solide, cette technique réalise de plus en plus son potentiel théorique de fournir des informations moléculaires au niveau atomique, sans limitation liée à la taille de l'objet, à l'ordre à longue portée ou à la cristallinité.Cette méthode nous permet d'étudier la structure atomique des assemblages biomoléculaires. Il est très important de préparer soigneusement l'échantillon afin d'optimiser les conditions de RMN et d'obtenir des données haute résolution. Grâce à ce protocole, nous pouvons obtenir des résolutions atomiques, qui fournissent des informations sur les assemblages protéiques.Et cette technique peut être combinée à d'autres techniques en biologie structurale afin d'obtenir des modèles tridimensionnels.

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