Microinjection unique cellule pour l'analyse cellulaire de communication

Bonjour, je m’appelle Anaël. Je travaille à la Fondation Oswaldo Cruz au Laboratoire de Communication Cellulaire. Nous étudions ici les récepteurs P2 et l’injection de gap dans le contexte du système immunitaire et du foie.

Aujourd’hui, je vais vous présenter la micro-injection de cellule. Les injections d’espace jouent certains rôles physiologiques comme la transmission des synapses, les contractions cardiaques, etc. Pour cette technique, on peut étudier si les injections d’espace sont fonctionnelles ou non.

D’accord, voyons les composants de base de la configuration de micro-injection. Ici, nous avons le microscope à fluorescence inversée où nous verrons les cellules. Il s’agit d’une caméra CCD pour enregistrer les résultats.

Nous avons ici le générateur de courant dont nous allons introduire le colorant dans la cellule. Ensuite, nous avons le support où la microélectrode est connectée. Et le micro-manipulateur qui est connecté au support et permet le mouvement de la microélectrode dans les trois axes, Z, Y et X.Avant de commencer l’expérience, nous devons fabriquer la microélectrode.

Nous utilisons ce capillaire en verre borosilicate et cet équipement nommé polaire. Nous fixons ici le capillaire en borosilicate. Ce filament de tungstène sera chauffé pour en faire deux microélectrodes.

Maintenant, le filament de tungstène chauffe et l’onde ici, nous allons tirer vers le bas pour fabriquer les deux microélectrodes. Facile. Notre première étape consiste à remplir la microélectrode avec le colorant. Une astuce ici est que vous ne devez remplir que l’embout avec quelques microlitres pour faire l’expérience.

Il n’est pas nécessaire de tout remplir. Note avec plus de détails. Remplissez uniquement l’embout.

Commençons une expérience. Nous avons ici les cellules dans la boîte de Pétri, dans une solution de sodium. Le fil d’argent connecté au générateur de courant.

Il nous faut maintenant fixer les microélectrodes dans l’étage de tête. Ici, dans la tête d’étage, nous avons un autre fil d’argent également connecté au générateur de courant. Une fois la microélectrode fixée, on peut la mettre à l’intérieur du bain.

Notez que l’extrémité de la pipette touche délicatement le bain. Cette procédure est effectuée très soigneusement pour éviter l’écrasement de la pointe au fond de la boîte de Pétri. Une fois à l’intérieur du bain, on peut aller au microscope pour chercher l’ombre de la micropipette.

Nous vous recommandons de commencer à regarder dans l’objectif de grossissement. Lorsque nous trouvons l’ombre de la pipette, nous pouvons déplacer la microélectrode vers la cellule à l’aide du micromanipulateur. Une fois qu’elle est très proche de la cellule, nous pouvons faire un post test pour vérifier si la microélectrode n’est pas obstruée.

Comment nous verrons ensuite. Ici, nous voyons la micropipette et nous ajustons la micropipette très près de la cellule. Nous pouvons voir le mouvement cellulaire à droite et à gauche.

Ensuite, nous passons au filtre, filtre à fluorescence. Nous pouvons appliquer une impulsion hyperpolarisante pour tester si la pointe de la pipette n’est pas obstruée. Comme la micropipette se trouve à l’intérieur de la cellule, nous pouvons appliquer une impulsion hyperpolarisante pour charger la cellule avec le colorant.

Nous utilisons ici le colorant jaune libre en vrac. Après avoir chargé la cellule avec le colorant, si les cellules voisines sont reliées par des injections de lacunes, nous attendons quelques minutes et nous verrons les cellules voisines s’éclaircir par la diffusion du colorant par ces injections de lacunes. Dans notre expérience, nous pouvons voir cinq cellules, marquées d’étoiles, montrant une fluorescence.

Il y a ici un bon exemple d’une expérience de micro-injection dans des cellules épithéliales thymiques, en A et B.In les figures C et D, montre une micro-injection dans une cellule inerte thymique de jaune libre lâche et un autre colorant, non perméable à l’injection lacunaire montré dans l’insert. La lignée cellulaire épithéliale thymique des figures E et F micro-injectée de jaune libre libre libre et dans l’insert de jaune libre libre libre et d’un bloc d’injection intercalaire. Les résultats montrent que le jaune libre libre ne s’est pas propagé aux cellules voisines.

Ensuite, nous voyons une micro-injection dans les cellules épithéliales thymiques, en présence de dexaméthasone et la quantification dans la B.La dexaméthasone a augmenté le degré de couplage, comme le montre la figure B.Sur 100 injections, le nombre de trois ou quatre cellules connectées était plus fréquent en présence de ce médicament. J’espère que je pourrais aider les débutants à faire cette technique importante pour l’étude de la communication cellulaire. Merci et au revoir.