Name: Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (MBC-P) et les cellules de biofilm (MBC-B) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Apprenez à déterminer la concentration bactéricide minimale pour comparer la résistance des bactéries planctoniques et en biofilm. Cette méthode utilise des plaques microtitre 96 puits et des dilutions sérielles d'antimicrobiens.

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L’auteur tient à remercier Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz et Clayton Hall pour leur aide éditoriale dans le cas de ce manuscrit. Ce test a été initialement développé dans le laboratoire de George O’Toole, Geisel School of Medicine à Dartmouth. La recherche dans le laboratoire du Dr Mah est financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et de Fibrose kystique Canada.

1. MBC-B
<ol><li>
Cultiver un biofilm (adapté de O’Toole9).
	<ol>
<li>Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.</li>
		<li>Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1). Ce milieu stimule la formation d’un biofilm plus robuste.</li>
		<li>Ajouter 100 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.</li>
		<li>Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exposition du biofilm préformé à un gradient de concentration d’antibiotique
	<ol>
<li>Préparez une série d’antibiotiques à dilution 10x pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 et 0,006 mg/ml 5-8 . À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer 10x dilutions de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 et 0,06 mg/ml. Laisser sur la glace.</li>
		<li>Retirer le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal (voir le tableau 1).</li>
		<li>Ajouter 90 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.</li>
		<li>Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.</li>
		<li>Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rafraîchir les médias et permettre le détachement des cellules vivantes.
	<ol>
<li>Retirez le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal.</li>
		<li>Ajouter 115 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.</li>
		<li>Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosage pour les cellules vivantes.
	<ol>
<li>Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.</li>
		<li>Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.</li>
		<li>Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.</li>
		<li>Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, le seuil de croissance bactérienne (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
Préparation de souches bactériennes
	<ol>
<li>Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.</li>
		<li>Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1).</li>
		<li>Ajouter 90 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exposition de cellules planctoniques à un gradient de concentration d’antibiotique
	<ol>
<li>Préparer une série d’antibiotiques 10x dilution pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 et 0,0005 mg/ml. À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer des dilutions de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 et 0,005 mg/ml. Laisser sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.</li>
		<li>Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosage pour les cellules vivantes.
	<ol>
<li>Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.</li>
		<li>Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.</li>
		<li>Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.</li>
		<li>Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, la coupure pour la croissance bactérienne (Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

L’auteur déclare qu’elle n’a pas d’intérêts financiers concurrents.

La résistance aux antibiotiques dans les cellules planctoniques est définie comme une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique due à un changement permanent dans les cellules(par exemple, une mutation). Les mécanismes de résistance ou de tolérance spécifiques au biofilm qui ont été identifiés à ce jour sont le résultat de l’expression de gènes de type sauvage dans les biofilms. Ainsi, la définition classique de la résistance ne s’applique pas aux biofilms. Cependant, un autre...

Des tests de résistance aux antibiotiques ont été initialement développés pour tester la résistance des cultures planctoniques (nageant librement) de bactéries. Étant donné que de nombreuses infections bactériennes impliquent des biofilms (cellules attachées en surface), nous étions intéressés à développer une méthode pour analyser la résistance aux antibiotiques spécifique au biofilm. Cependant, la plupart des tests de résistance aux antibiotiques sont mal adaptés pour mesurer la résistance des biofilms. Par exemple, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la norme de référence pour déterminer la résistance aux antibiotiques des cultures bactériennes planctoniques 1. Ce dosage consiste à mélanger une culture planctonique diluée avec une série de dilutions d’antibiotiques.  La concentration d’antibiotique qui inhibe la croissance visible des cellules planctoniques est le MIC. Étant donné que ce test repose sur l’inhibition de la croissance, par définition, il ne peut pas fonctionner avec des cultures de biofilm, ce qui nécessite d’examiner la sensibilité aux antibiotiques des cellules d’un biofilm précroissé. Au lieu de mesurer l’inhibition de la croissance, le test MBC-B décrit ici détermine la concentration d’antibiotique qui tue les cellules déjà existantes dans un biofilm. Ainsi, ce test vise à imiter les traitements antibiotiques des infections à biofilm établies, et à fournir une vue plus pertinente de la résistance bactérienne aux antibiotiques in vivo.
Étant donné que les biofilms sont généralement plus résistants aux antibiotiques que les cultures planctoniques 2-4, il a été nécessaire de concevoir une méthode qui relie directement la résistance aux antibiotiques d’un biofilm à celle d’une culture planctonique. Ainsi, un autre objectif de cette méthode est de pouvoir comparer directement le niveau de résistance aux antibiotiques entre les cellules planctoniques et biofilm. Les essais MBC-P et MBC-B décrits ici rendent cela possible parce que les cellules sont cultivées dans des conditions similaires. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier plusieurs gènes qui sont importants pour la résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm 5-8 .

<table><tbody><tr><td> 1x ; M63 </td><td></td><td></td><td> Préparer en tant que 5x&nbsp ; Stock M63 en dissolvant 15 g de KH2PO4, 35 g de K2HPO<>4 et 10 g (NH4)2SO4 dans 1 L d’eau. Ce stock n’a pas besoin d’être autoclavé et peut être stocké à température ambiante. Diluer 5x&nbsp ; stock 1:5, autoclave, refroidir, puis ajouter les composants souhaités. </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td> </tr><tr><td> > K2HPO4 </td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td> </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td> Ajouter à 1 mM de concentration finale.&nbsp ; Préparer sous forme de stock de 1 M dans l’eau et l’autoclave. </td></tr><tr><td> Tobramycine </td><td>Sigma</td><td></td><td> Préparer 50 mg/m&nbsp ; stock. Aliquote et stockage à -20&deg ;C. </td></tr><tr><td> Arginine </td><td>Sigma</td><td>A5131</td><td> Ajouter à 0,4 % de concentration finale.&nbsp ; Préparer à 20 % dans l’eau et filtrer la stérilisation. Cette source alternative de carbone/énergie peut remplacer le glucose et les acides casaminés </td></tr><tr><td> plaques de microtitration à 96 puits </td><td>Corning</td><td>3595</td><td> Stérile, à fond plat, à faible évaporation </td></tr><tr><td> Tranferpette (pipette multicanaux) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8 canaux, 20-200 &mu ; l </td></tr><tr><td> Dispositif multigriffes </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 broches s’insèrent dans &frac12 ; d’une plaque de microtitration de 96 puits </td></tr></tbody></table>

Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (mbc-p) et les cellules de biofilm (mbc-b)

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro. Les bactéries sont inoculées dans les puits d’une plaque de microtitre de 96 puits. Dans le cas du test planctonique, des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées aux suspensions bactériennes. Dans le test du biofilm, une fois inoculées, les bactéries sont laissées pour former un biofilm sur une période de temps définie. Les cellules non attachées sont retirées des puits, le milieu est reconstitué et des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées. Après l’exposition à l’agent antimicrobien, les cellules planctoniques sont analysées pour la croissance. Pour le dosage du biofilm, le milieu est rafraîchi avec des milieux frais dépourvus de l’agent antimicrobien et les cellules du biofilm sont laissées à récupérer. La viabilité des cellules du biofilm est analysée après la période de récupération. Le MBC-P pour l’agent antimicrobien est défini comme la plus faible concentration de médicament qui tue les cellules dans la culture planctonique.  En revanche, le MBC-B d’une souche est déterminé en exposant des biofilms préformés à des concentrations croissantes d’agent antimicrobien pendant 24 heures. Le MBC-B est défini comme la plus faible concentration d’agent antimicrobien qui tue les cellules du biofilm.

Des essais MBC-P et MBC-B ont été effectués, comparant la sensibilité du type sauvage PA14 avec PA14 ∆ndvB. La tobramycine a été utilisée comme antibiotique. Les résultats correspondant à l’étape 1.4.4(figure 1)et à l’étape 2.3.4(figure 2)sont présentés. PA14 et ∆ndvB ont été inoculés dans les essais MBC-P et MBC-B en triple exemplaire. Après avoir terminé les étapes 1.0-1.4 du protocole MBC-B et les étapes 2.0-2.3 du protocole MBC-P, les cellules viables ont été plaqué...

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro à l’aide d’une plaque de microtitre de 96 puits. Les bactéries planctoniques ou biofilms sont exposées à des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix. La viabilité est dosée par croissance sur des plaques de gélose.

Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (MBC-P) et les cellules de biofilm (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Cette procédure compare directement la résistance du planctonique et du biofilm d’une souche bactérienne pouvant former un biofilm. Tout d’abord, établissez un biofilm, réapprovisionnez le milieu et appliquez une dilution en série de l’agent antimicrobien de votre choix. Laissez ensuite les cellules se rétablir dans un milieu frais.Maintenant, testez la viabilité des cellules par placage sur la vis sans fin LB. En fin de compte, la détermination de la concentration bactéricide minimale des cellules planctoniques et du biofilm est utilisée pour montrer l’augmentation de la résistance qui résulte de la croissance dans un biofilm. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal parce qu’elles contaminent les puits adjacents ou qu’elles ne laissent pas les broches de l’appareil à plusieurs broches refroidir suffisamment pour ne pas tuer les bactéries.La culture, le type sauvage et la souche mutante de la bactérie pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 degrés Celsius, dilue les cultures nocturnes saturées dans un milieu frais comme le M 63, milieu minimal, complété par du magnésium, du sulfate et de l’arginine. Puis Eloqua. 100 microlitres par puits.En

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