Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (MBC-P) et les cellules de biofilm (MBC-B)

Cette procédure compare directement la résistance du planctonique et du biofilm d’une souche bactérienne pouvant former un biofilm. Tout d’abord, établissez un biofilm, réapprovisionnez le milieu et appliquez une dilution en série de l’agent antimicrobien de votre choix. Laissez ensuite les cellules se rétablir dans un milieu frais.

Maintenant, testez la viabilité des cellules par placage sur la vis sans fin LB. En fin de compte, la détermination de la concentration bactéricide minimale des cellules planctoniques et du biofilm est utilisée pour montrer l’augmentation de la résistance qui résulte de la croissance dans un biofilm. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal parce qu’elles contaminent les puits adjacents ou qu’elles ne laissent pas les broches de l’appareil à plusieurs broches refroidir suffisamment pour ne pas tuer les bactéries.

La culture, le type sauvage et la souche mutante de la bactérie pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 degrés Celsius, dilue les cultures nocturnes saturées dans un milieu frais comme le M 63, milieu minimal, complété par du magnésium, du sulfate et de l’arginine. Puis Eloqua. 100 microlitres par puits.

En allouant 24 puits pour chaque souche, incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez 10 solutions mères d’une série de dilutions d’antibiotiques pour sept puits et stockez-les sur de la glace. À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever le surnageant usagé qui contient des cellules planctoniques.

Ajoutez ensuite 90 microlitres de M 63 dans tous les puits et ajoutez 10 microlitres de la solution mère d’antibiotiques appropriée au contrôle sans antibiotique. Eh bien, pour chaque répétition et souche, ajoutez 10 microlitres d’eau. Incuber la plaque de microtitration pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever le surnageant usagé qui contient des cellules planctoniques. Ajoutez 115 microlitres de M 63 à tous les puits et continuez à cultiver les cultures pendant 24 heures. À 37 degrés Celsius.

Étiquetez une plaque de tarière d’un lb par demi 96. Bien plaque de microtitration pour stériliser le dispositif à plusieurs broches, trempez-le dans de l’éthanol à 100 % et passez les broches sur la flamme nue d’un bec Bunsen. Laissez les griffes refroidir légèrement.

À l’aide des pointes des griffes. Transférez la culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitration à la surface d’une plaque de tarière LB. Placez les plaques de vis sans fin LB à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

Ensuite, déterminez visuellement la limite de croissance bactérienne comme la concentration bactéricide minimale de la culture d’antibiotiques, le type sauvage et la souche mutante de bactéries pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 degrés Celsius, diluez les cultures de nuit saturées de un à 100 dans un milieu frais pour des tests de résistance aux antibiotiques dans chaque puits d’une boîte de microtitration de 96 puits. Ajouter 90 microlitres de dilution bactérienne. Il s’agit maintenant d’exposer les cellules planctoniques à un gradient de concentration d’antibiotique.

Commencez avec 10 solutions mères d’une série de dilutions d’antibiotiques comme la tobramycine mycine. Ajoutez 10 microlitres de tiges d’antibiotiques selon le plan expérimental. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’eau dans les puits de contrôle sans antibiotiques pour chaque répétition et souche.

Incuber la plaque de microtitration pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour rechercher des cellules vivantes. Commencez par étiqueter une plaque de tarière LB pour chaque moitié d’une plaque de microtitration de 96 puits. Stérilisez l’appareil à plusieurs broches en le flambant avec de l’éthanol à 100 %.

Répétez l’opération une fois. Ensuite, à l’aide de l’appareil à plusieurs griffes, transférez environ trois microlitres de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitration à la surface d’une plaque de tarière LB. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

Déterminez ensuite la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant à l’œil nu la limite pour la croissance bactérienne. Dans cette expérience, les deux différents tests de concentration minimale bactéricide ont été utilisés pour comparer la sensibilité du type sauvage PA 14 avec une souche mutante qui n’a pas de résistance aux antibiotiques. Gène NDVB.

Ici, les concentrations bactéricides minimales de l’antibiotique tobramycine ont été mesurées pour le biofilm. Le MBCB pour le PA 14 est de 100 microgrammes par millilitre contre 12,5 microgrammes par millilitre pour le mutant. En revanche, les concentrations bactéricides minimales de tobramycine pour les cellules planctoniques étaient de huit microgrammes par millilitre pour le type sauvage PA 14 et le mutant.

Une fois maîtrisé, le NBCB peut être fait en une heure environ, réparti sur cinq jours.