Méthodologies pour l'étude B. subtilis biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

Cette étude présente le développement de méthodologies reproductibles pour étudier les inhibiteurs de biofilm et leurs effets sur la multicellularité de Bacillus subtilis.

Les biofilms bactériens sont importants pour la santé humaine, car ils protègent leurs résidents bactériens des agressions environnementales et des agents antimicrobiens. L’objectif de cette procédure était de développer un système modèle pour évaluer les effets des inhibiteurs de petites molécules sur la formation du biofilm. Ces méthodes peuvent aider à établir un ensemble d’outils essentiels pour le domaine du biofilm afin de sélectionner des inhibiteurs de petites molécules qui ciblent spécifiquement la formation de biofilms.

Le principal avantage de ces méthodologies est qu’elles partent d’un cadre expérimental cohérent et robuste et donnent des informations quantitatives et qualitatives sur le mécanisme d’action des inhibiteurs spécifiques du biofilm. Bien que ces méthodes puissent donner un aperçu des biofilms de Bacillus subtilis, elles peuvent également être appliquées à d’autres bactéries formant des biofilms, telles que Pseudomonas aeruginosa ou l’agent pathogène des plantes Xanthomonas citri. La microscopie électronique à balayage peut être essentielle pour analyser l’effet des petites molécules sur la formation du biofilm, car elle permet d’observer la matrice extracellulaire et donne une résolution unicellulaire.

Pour commencer, sélectionnez d’abord une colonie unique appropriée et transférez-la dans trois millilitres de bouillon LB. Placez cette culture de démarrage dans un incubateur agitateur pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, prélever 1,5 millilitre de la culture de démarrage et centrifuger pendant quatre minutes.

Retirez délicatement le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 1,5 millilitre de milieu MSgg. Pour faire pousser des pellicules, préparez une plaque de culture cellulaire à 12 puits en ajoutant trois millilitres de MSgg dans chaque puits. À certains de ces puits, ajoutez MSgg avec un inhibiteur de petites molécules dans une plage de concentration, en répartissant l’emplacement des différentes concentrations autour de la boîte, pour éviter les effets de bord.

Mesurer la densité optique à 600 nanomètres de la culture de démarrage remise en suspension. La culture doit être comprise entre 0,6 et un. Ceci est essentiel pour la robustesse du système.

Innoculez chaque puits de la plaque de culture avec 3 microlitres de la culture de démarrage remise en suspension. Ensuite, incubez la plaque à 23 degrés Celsius pendant trois jours dans des conditions statiques. Ensuite, retirez la plaque de l’incubateur et observez les pellicules.

Pour cultiver des biofilms, utilisez un gabarit et repérez symétriquement quatre gouttes distinctes de 1,5 microlitres de culture de levain non lavée sur une plaque de 8,5 centimètres séchée à 1,5 % d’Agar MSgg. Laissez les gouttes pénétrer dans le milieu avant de déplacer la plaque. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

À l’aide de jumelles avec une exposition homogène à l’éclairage, vérifiez que les colonies de biofilm se sont développées et ont formé une structure tridimensionnelle ridée. Tout d’abord, prenez une lame de rasoir propre et coupez les colonies de biofilm en deux parties égales à l’aide du gabarit. Soulevez délicatement la moitié de la colonie à l’aide d’une spatule propre et transférez-la dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 millilitre, contenant 500 microlitres de PBS.

Prenez la seconde moitié de la colonie et transférez-la dans un tube de micro-centrifugeuse contenant 500 microlitres d’éthanol à 50 %. Ceux-ci seront utilisés pour évaluer la résistance aux agents stérilisants. Ensuite, prenez de la même manière la première moitié de la colonie traitée à la D-lysine et placez-la dans du PBS.

Ensuite, prenez la seconde moitié de cette colonie et transférez-la dans de l’éthanol. Incuber tous les tubes contenant les moitiés de biofilm pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez-les pendant cinq minutes à 18 000 fois g.

À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant. Ajoutez 300 microlitres de PBS, puis sonicez les cellules à basse température, avec un sonicateur à micropointes. Ajoutez 700 microlitres supplémentaires de PBS pour un volume final d’un millilitre.

Ensuite, effectuez une dilution en série de 10 puissance moins sept dans PBS. Prenez 100 microlitres de l’une des dilutions et innoculez une plaque d’Agar LB à 1,5 %. Répétez cette étape pour deux autres dilutions par échantillon.

Étalez l’inoculum à l’aide de billes de verre, puis incubez les plaques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Examinez les plaques et comptez les unités formant colonie, ou UFC. Après avoir calculé la valeur de l’UFC par millilitre, calculez le pourcentage de survivants dans les traitements PBS par rapport à l’éthanol.

Pour commencer la fixation de l’échantillon, préparez d’abord suffisamment de solution de fixateur fraîche pour le nombre souhaité de colonies de biofilm. Ajoutez soigneusement cinq millilitres de fixateur dans chaque boîte de Pétri et évitez de pipeter directement sur les colonies. Les colonies commenceront à se détacher de l’Agar et à flotter.

Fermez soigneusement les plaques avec du parafilm et incubez sur un agitateur rotatif pendant deux heures à température ambiante. Transférez les assiettes à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Prélevez délicatement le liquide fixateur à l’aide d’une pipette Pasteur, reliée à un vide.

Ajoutez 10 millilitres de cacodylate de sodium nanomolaire, cinq millimolaires de chlorure de calcium tampon pour laver le biofilm et incubez pendant cinq minutes. Détachez soigneusement le centre de la colonie de biofilm de la plaque de gélose à l’aide d’une pipette Pasteur. Pour sécher les colonies à l’air, coupez le papier filtre en cellulose en quartiers, puis immergez-y une section dans de l’éthanol à 100 %.

Transférez soigneusement une colonie de biofilm flottante sur le papier. Placez le papier dans une boîte de Pétri recouverte de papier filtre sec. Ensuite, couvrez le plat et laissez-le sécher toute la nuit dans une hotte chimique.

Afin de préserver la morphologie de la colonie de biofilm, il est important de sous-couche entièrement le biofilm flottant avec du papier cellulosique. Une fois sur le papier, le biofilm ne peut pas être réajusté. Enduisez un talon de microscopie électronique avec du ruban de carbone, puis utilisez une pince à épiler pour transférer soigneusement les colonies de biofilm sur le talon.

Après avoir connecté chaque colonie au talon, en ajoutant un mince pont de ruban de carbone, stockez les talons dans un dessiccateur pendant 24 heures ou jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Cette étape nécessite une main stable et précise, car à ce stade, les biofilms sont très fragiles et se fracturent facilement. Le défi consiste à monter une partie substantielle du biofilm sans fissures.

Le jour de l’examen, placez les colonies dans une coucheuse par pulvérisation cathodique or-palladium. Enduisez les échantillons pendant deux minutes à un angle de 60 degrés. Répétez cette étape deux fois, en faisant pivoter les échantillons de 120 degrés entre les deux.

Enfin, enrobez les échantillons une fois pendant trois minutes à partir du haut. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’imagerie sur le MEB. Ces images montrent la formation pellicale de B. subtilis cultivé dans un milieu MSgg induisant un biofilm.

Avec l’ajout de la petite molécule inhibitrice D-lysine, le développement de la pellicule est réduit. Et à mesure que la concentration de l’inhibiteur augmente, la formation de pellicules montre une diminution corrélative. Ce graphique montre l’effet de l’exposition à l’éthanol sur la survie des cellules au sein des colonies de biofilm, traitées avec un inhibiteur de la D-lysine ou non traitées.

Les colonies traitées avec de la D-lysine et exposées à 50 % d’éthanol pendant 10 minutes ont montré une réduction spectaculaire de la survie par rapport à la fraction non traitée. Les images binoculaires de haut en bas montrent que les colonies cultivées en présence de D-lysine étaient globalement plus petites et formaient des rides moins prononcées que celles non traitées. Des images au microscope électronique à balayage de colonies de biofilm séché à points critiques révèlent encore plus le développement modifié du biofilm.

La matrice de substances polymères extracellulaires, ou EPS, ressemblait davantage à une toile d’araignée dans les échantillons non traités, les échantillons traités montrant moins d’organisation. Enfin, l’examen à la résolution de cellules bactériennes individuelles montre que les cellules traitées sont allongées en apparence, moins recouvertes d’EPS et moins étroitement liées à leurs voisines que les cellules non traitées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est essentiel de définir un cadre cohérent pour étudier les inhibiteurs de biofilm pour obtenir des résultats reproductibles.

Une fois maîtrisé, un criblage de petites molécules pour l’inhibition du biofilm peut être effectué en moins d’une semaine s’il est effectué correctement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’étude de l’expression génique dans des cellules de biofilm unique, peuvent être effectuées afin d’obtenir des informations supplémentaires sur la cible de l’inhibiteur de la petite molécule. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser l’effet global d’inhibiteurs de biofilm spécifiques sur le développement du biofilm et la résistance aux antibiotiques.