Analyse systématique des In Vitro Cellule de roulement en utilisant un système microfluidique plaque multi-puits

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer des études de laminage cellulaire avec un débit accru sous un flux de cisaillement étroitement contrôlé et physiologiquement pertinent. Ceci est réalisé à l’aide d’un système microfluidique multi-puits dans lequel les puits adjacents dans une plaque spécialisée sont connectés via un canal microfluidique. L’interface du système relie une pompe électropneumatique au sommet de la plaque multi-puits et applique une pression pneumatique qui entraîne le fluide de l’intérieur des puits à travers les canaux microfluidiques à un débit défini.

Une fois que le canal microfluidique est recouvert du substrat ou de la monocouche de cellule souhaité, les cellules d’intérêt sont introduites dans le canal microfluidique pour explorer leurs interactions de roulement spécifiques avec la surface revêtue, les propriétés de roulement des cellules lorsqu’elles interagissent avec le substrat ou la surface monocouche revêtue dans différentes conditions expérimentales peuvent ensuite être analysées avec le logiciel approprié. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la chambre d’écoulement à plaques parallèles, est qu’elle permet d’étudier les propriétés de laminage de l’argent avec un débit nettement plus élevé sous un écoulement de tube contrôlé avec précision et physiologiquement pertinent, tout en minimisant la consommation de réactifs et de cellules. Cette plateforme peut contribuer à faire progresser les thérapies à base de cellules exogènes en permettant l’analyse rapide et précise d’approches d’ingénierie conçues pour avoir un impact sur le roulement et le guidage cellulaires.

Pour enrober un canal microfluidique d’un substrat protéique, ajoutez d’abord 25 à 50 microlitres de la solution protéique fraîchement préparée dans l’entrée. Ensuite, appliquez une force de deux dînés par centimètre carré pendant cinq minutes pour faire pénétrer la solution dans le canal. Lorsqu’une perle de liquide devient visible dans la sortie, arrêtez bien l’écoulement, incubez la plaque pendant la durée appropriée avec la protéine d’intérêt, puis aspirez la solution de chacune. Puits.

Ensuite, ajoutez 200 à 500 microlitres de PBS dans le puits de sortie, puis appliquez un flux simple de deux dines par centimètre carré pendant cinq minutes pour laver le canal afin de créer une monocouche cellulaire à l’intérieur du canal microfluidique. Commencez par essayer doucement les cellules d’intérêt à partir de leur boîte de culture pendant trois minutes, arrêtez la réaction avec un double volume de milieu plein, puis centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 400 Gs et rt. Ensuite, lavez la pastille dans 10 millilitres de support plein.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu frais et comptez-les, ajustez la solution cellulaire à la concentration appropriée, puis placez 25 à 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque entrée. Maintenant, placez la plaque sur la platine du microscope et appliquez un débit de deux dines par centimètre carré pour faire couler les cellules dans le canal jusqu’à ce que l’on observe que les cellules remplissent tout le canal. Après avoir arrêté l’écoulement, remplissez les puits de sortie et intérieurs avec 200 microlitres du milieu cellulaire approprié, puis laissez les cellules se déposer et adhérer à 37 degrés Celsius à 5 % de CO2.

Après trois heures, lavez le canal avec un support complet pour retirer les cellules détachées. Les cellules devraient maintenant être complètement confluentes et prêtes à être utilisées pour induire l’activation inflammatoire des cellules endothéliales dans les canaux. Ajoutez 100 microlitres de solution de TNF alpha fraîchement préparée dans le puits d’entrée, puis introduisez la solution dans le canal en appliquant un débit de deux repas par centimètre carré pendant cinq minutes.

Pour le contrôle des canaux cellulaires endothéliales non activés, ajoutez 100 microlitres de milieu basal des cellules endothéliales à l’entrée. Eh bien, pour bloquer la sélectine P ou E à la surface de la cellule endothéliale, introduisez cinq microgrammes par millilitre de l’anticorps neutralisant approprié dans le canal et incubez la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez ensuite les canaux avec un média de base avant de commencer le dosage par roulage.

Examinez soigneusement les canaux au microscope pour confirmer qu’ils sont correctement revêtus. Ensuite, laver la suspension de cellules HL 60 avec un milieu basal deux fois après le deuxième lavage, puis remettre les cellules en suspension dans l’IMDM à cinq fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration. Après avoir ajouté 25 à 50 microlitres de suspension de cellule dans la sortie, placez bien la plaque dans le support de plaque à température contrôlée de 37 degrés Celsius et placez le support de plaque sur la platine du microscope.

Introduire les cellules dans le canal microfluidique. Ils doivent être observés dans les 10 à 15 secondes qui s’écoulent de la sortie à l’entrée. Ici, les cellules HL 60 marquées par fluorescence peuvent être observées, interagissant avec la surface encodée P select, affichant une réponse de roulement pour examiner la réponse de roulement en fonction de la contrainte de cisaillement, réduire le cisaillement à 0,25 dines par centimètre carré et acquérir 20 à 32e vidéos en utilisant la fonction d’acquisition de flux dans chaque cisaillement souhaité, et en augmentant progressivement le cisaillement de 0,25 à cinq dines par centimètre carré.

Enfin, utilisez une caméra CCD pour acquérir la vidéo du test avec l’acquisition de flux de 11 images par seconde. Par exemple, ici, une cellule HL 60 roulant sur une monocouche de cellules chope est représentée. Analysez les trajectoires et les vitesses de roulement avec le logiciel compatible approprié.

cellules HL 60 sont considérées comme des rouleaux de référence car elles expriment une variété de ligands homing, y compris les ligands roulants, la sélection P et le ligand glycoprotéique un et CI Lewis X.To tester les capacités du système microfluidique à plaques multipuits, de nombreux canaux microfluidiques ont été recouverts simultanément de différents substrats et des interactions de roulement des cellules HL 60. Avec ces substrats analysés, les cellules ont présenté un comportement de roulement robuste sur la surface codée P select, les cellules étant d’abord capturées dans l’écoulement, suivies d’un mouvement de roulement distinct. Comme illustré dans ce graphique et en accord avec la littérature, les cellules HL 60 présentent un comportement de roulement similaire sur les surfaces de sélection e et p, mais pas sur les substrats revêtus de FiberInc.

La vitesse des cellules, telle qu’analysée via un logiciel compatible, a été tracée en fonction du stress pur, montrant une réponse de roulement robuste des cellules sur la sélectine p et e avec une vitesse moyenne comprise entre un et 12 microns par seconde. Pour évaluer la faisabilité de ce système microfluidique dans le test efficace des interactions entre les cellules d’intérêt et une monocouche cellulaire recouvrant la surface, des cellules CHO P, qui ont été transfectées pour exprimer de manière stable P, mais pas e sélectine, ont été utilisées comme indiqué ici. Les cellules HL 60 présentent une réponse de roulement significative sur une monocouche de cellules CHO P pour tester si le mouvement de roulement de HL 60 est effectivement médié par la pectine.

La monocouche a été pré-incubée avec des anticorps bloquants pour la sélectine P ou E avant la profusion de cellules HL 60 dans le canal. Comme le montre ce graphique, le blocage de la monocouche CHO p avec un anticorps sélectif P a entraîné une diminution significative du nombre de cellules HL 60 roulant à la surface, démontrant que P select et en effet médie le roulement HL 60. Comme décrit précédemment, la plaque microfluidique multipuits se compose de nombreux canaux microfluidiques séparés, permettant des tests à haut débit dans plusieurs conditions différentes.

Cette conception avantageuse a été utilisée pour plaquer les cellules endothéliales à l’intérieur des canaux microfluidiques pour une analyse rapide des interactions entre les cellules HL 60 et les cellules endothéliales dans diverses conditions expérimentales pour simuler des conditions inflammatoires, les cellules endothéliales ont été prétraitées avec la cytokine pro-inflammatoire TNF alpha, ce qui a entraîné une régulation positive de E, mais pas de la sélectine P à la surface des cellules endothéliales. Fait intéressant, les cellules HL 60 n’ont pas interagi avec les cellules endothéliales inactivées, et on n’a pas observé que les cellules roulaient sur cette surface. Au contraire, les cellules HL 60 ont montré un comportement de roulement robuste sur les cellules endothéliales activées par TNF alpha avec une vitesse moyenne de cinq à 15 microns par seconde pour explorer l’implication de la sélectine p ou E dans les interactions de roulement entre les cellules HL 60 et les cellules endothéliales activées.

cellules endothéliales activées par le TNF alpha ont été pré-incubées avec la sélection P ou E dans les anticorps bloquants, et le roulement des cellules HL 60 a été analysé comme illustré dans le graphique Le blocage sélectionné sur les cellules endothéliales alpha du TNF a entraîné une diminution significative du nombre de cellules roulantes sur la monocouche endothéliale activée. En revanche, l’utilisation d’un contrôle isotopique ou d’un anticorps contre la pectine, qui n’est pas exprimée sur les cellules endothéliales activées, n’a pas eu d’effet significatif sur le roulement de HL 60 sur la couche endothéliale activée. Ces données démontrent l’implication directe de la sélectine S dans le roulement de HL 60 sur les cellules endothéliales activées par le TNF alpha, conformément aux rapports précédents.

Les logiciels d’analyse permettent de suivre les trajectoires des cellules individuelles lorsqu’elles interagissent avec la surface. Ainsi, les trajets des cellules individuelles lorsqu’elles interagissaient avec les cellules endothéliales activées par le TNF alpha avec ou sans e select et le blocage des anticorps ont été spécifiquement suivis. Comme l’illustre cette figure, le nombre de cellules roulantes sur les cellules endothéliales activées non bloquées était significativement plus élevé que sur les cellules endothéliales activées elect et bloquées. De plus, il est apparu que le mouvement de roulement des cellules HL 60 sur les cellules endothéliales non bloquées était continu et robuste tandis que les trajets de roulement des cellules sur les cellules endothéliales électives et bloquées étaient fragmentés.

Conformément à cette constatation, la vitesse de roulement des cellules HL 60 sur les cellules endothéliales activées par le TNF alpha non bloquées était significativement plus faible que la vitesse de roulement sur les cellules endothéliales sélectionnées et bloquées. Cette étude démontre l’utilisation d’un système microfluidique multiple pour réaliser efficacement des expériences de laminage de cellules avec un débit accru allant jusqu’à 10 gaz de laminage par heure sous un écoulement de tube étroitement contrôlé. Dans l’ensemble, ce système microfluidique apparaît comme une technique puissante pour étudier le roulement cellulaire, un aspect clé du binage cellulaire.

Par exemple, notre laboratoire utilise actuellement ce système pour dépister des conditions permettant d’améliorer le guidage des cellules souches mésenchymateuses comme stratégie pour améliorer leur impact thérapeutique.