Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

L’objectif global de cette procédure est de générer une chimère de coussinet adipeux des ganglions lymphatiques afin d’évaluer la contribution du tissu adipeux à la formation du stroma des ganglions lymphatiques. Ceci est accompli d’abord en isolant les ganglions lymphatiques des souris nouveau-nées et les coussinets adipeux des embryons de souris du 18,5e jour. Le ganglion lymphatique est retiré du coussinet adipeux embryonnaire et remplacé par le ganglion lymphatique du nouveau-né.

La chimère du coussinet adipeux des ganglions lymphatiques est assemblée en réassociant puis en cultivant un ganglion lymphatique nouveau-né avec un coussinet adipeux embryonnaire in vitro. La chimère est ensuite greffée sous la capsule rénale d’une souris hôte. Trois semaines après la greffe, le rein est prélevé et la chimère est récupérée.

En fin de compte, la contribution des cellules dérivées du coussinet adipeux au stroma des ganglions lymphatiques peut être évaluée par cytométrie en flux et analyse microscopique d’immunofluorescence. Nous avons donc eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous cherchions un moyen d’évaluer si les cellules du coussinet adipeux contribuent à la formation des ganglions lymphatiques pour isoler les ganglions lymphatiques inguinaux nouveau-nés. Après avoir sectionné la tête, utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir le corps de l’animal du haut de la région thoracique vers le bas de l’abdomen.

Après avoir soigneusement retiré tous les viscères de la cavité abdominale, placez le corps dans une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant un média RF 10. Placez la boîte dans une hotte de culture de tissus stériles, puis transférez le corps dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 90 millimètres contenant du RF 10 frais. Ensuite, détachez soigneusement le péritoine de la peau dans la région inguinale et localisez les ganglions lymphatiques inguinaux situés à l’intersection de trois vaisseaux sanguins dans le coussinet adipeux.

Retirez soigneusement les ganglions lymphatiques, en vous assurant que tout le tissu adipeux est enlevé. Ensuite, placez les ganglions lymphatiques dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant un média RF 10 sur de la glace pour isoler les coussinets adipeux inguinaux des embryons du 18,5e jour. Après avoir retiré les viscères comme nous venons de le démontrer, lavez les corps dans du PBS stérile pour éliminer toute trace de sang.

Transférez les corps nettoyés dans une boîte de Pétri fraîche de 90 millimètres, puis détachez le péritoine, localisez le ganglion lymphatique inguinal et retirez-le comme cela vient d’être démontré. Jetez le tissu isolé. Prenez soin d’enlever tout le ganglion lymphatique pour éviter la contamination de la chimère du coussinet adipeux.

Retirez ensuite le coussinet adipeux inguinal et placez-le dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant un média RF 10 sur de la glace. Pour mettre en place le système de culture d’organes in vitro, coupez d’abord un peu de Vulcan Underwrap en un à 1,5 centimètre carré. Ensuite, faites bouillir les éponges pendant deux heures et les filtres pendant 20 minutes dans de l’eau distillée et laissez-les sécher pendant plusieurs heures dans une hotte de culture cellulaire.

Une fois que les matériaux sont secs, placez une éponge chacun dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant deux millilitres de support. Immergez chaque éponge dans le milieu pour mouiller les deux côtés, puis placez un filtre par système de culture d’organes in vitro à l’interface air-liquide. Ensuite, réassociez soigneusement un coussinet adipeux embryonnaire avec un ganglion lymphatique nouveau-né directement sur le dessus de chaque filtre.

Transférez les boîtes de Pétri dans une boîte en plastique rectangulaire avec de l’eau au fond et des trous dans le couvercle. Collez le couvercle sur la boîte en laissant les trous ouverts. Placez ensuite la boîte dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius 5 % de CO2.

Laissez la boîte s’équilibrer pendant deux heures, puis scellez les trous du couvercle avec du ruban adhésif. Incuber les tissus pendant au moins deux jours pour permettre aux ganglions lymphatiques de se fixer aux coussinets adipeux avant de les transférer sous la capsule rénale, trois à quatre semaines après la transplantation. Isolez chaque chimère de coussinet adipeux ganglionnaire dans chaque rein et disséquez les ganglions lymphatiques.

Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, utilisez une petite paire de ciseaux pour faire une seule incision dans le tissu afin de faciliter la digestion enzymatique. Ensuite, placez un ganglion lymphatique chacun dans des tubes einor individuels de 1,5 millilitre contenant 600 microlitres de tampon de digestion. Incuber les tubes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique agitateur, en pipetant de haut en bas toutes les 10 minutes pour aider à dissocier les tissus.

Ajoutez ensuite six microlitres d’EDTA dans les tubes et tritratez la suspension cellulaire plusieurs fois pour terminer la dissociation. Les cellules peuvent ensuite être colorées avec les anticorps d’intérêt souhaités et analysées par cytométrie en flux pour préserver l’expression améliorée de la protéine fluorescente jaune ou EYFP. Fixez les ganglions lymphatiques pendant trois à quatre heures.

Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, placez une seule goutte de composé OCT froid sur un petit morceau de papier d’aluminium. En évitant les bulles d’air, placez soigneusement un ganglion lymphatique au milieu de chaque goutte, puis placez le papier d’aluminium sur de la glace sèche pour congeler les tissus. Les ganglions lymphatiques peuvent ensuite être sectionnés, colorés et analysés par microscopie fluorescente.

L’isolement soigneux du ganglion lymphatique permet une analyse plus approfondie de la descendance des cellules dérivées du tissu adipeux positif à l’EYFP. Des coupes cryogéniques et une analyse immunofluorescente du ganglion lymphatique révèlent que les cellules dérivées du tissu adipeux positif à l’EYFP migrent dans le ganglion lymphatique où elles contribuent au flux du réseau cellulaire stromal des ganglions lymphatiques positifs à E RTR positif GP 38 L’analyse cytométrique confirme qu’une fraction importante des cellules stromales des ganglions lymphatiques dérive des cellules progénitrices du tissu adipeux positif à l’EYFP local, contribuant à 30 % des cellules FIBROBLASTIC négatives G 38 positives CD. et 10 % du CD 45 négatif GP 38 négatif CD 31 positif Fraction de cellules endothéliales sanguines jusqu’à 80 % du CD 45, négatif G 38 positif CD 31 négatif fibroblastique peuvent être dérivés de cellules précurseurs du tissu adipeux, démontrant le rôle crucial joué par le tissu adipeux dans le maintien de la croissance du stroma ganglionnaire. C’est ainsi qu’une fois maîtrisé cette technique avec un chercheur dans le domaine de l’organogenèse lymphoïde pour explorer le rôle des différentes molécules impliquées dans le traumatisme lymphoïde.