Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

L'objectif général de cette procédure est de générer un chimère composé d'une couche adipeuse et d'un ganglion lymphatique afin d'évaluer la contribution du tissu adipeux à la formation du stroma des ganglions lymphatiques. Cette opération s'effectue tout d'abord en isolant des ganglions lymphatiques de souriceaux nouveau-nés et des bourrelets graisseux d'embryons de souris au jour 18,5. Le ganglion lymphatique est ensuite retiré de la couche adipeuse embryonnaire et remplacé par le ganglion lymphatique de souriceau nouveau-né.

Le chimère du bourrelet adipeux ganglionnaire est assemblé en reconstituant puis en cultivant in vitro un ganglion lymphatique de nouveau-né avec un bourrelet adipeux embryonnaire. Le chimère est ensuite greffé sous la capsule rénale d'une souris hôte. Trois semaines après la transplantation, le rein est prélevé et le chimère est récupéré.

En fin de compte, la contribution des cellules issues du tissu adipeux à la stroma des ganglions lymphatiques peut être évaluée par analyse cytométrique en flux et par microscopie en immunofluorescence. Nous avons ainsi eu l'idée de cette méthode lorsque nous cherchions un moyen d'évaluer si les cellules du tissu adipeux participaient à la formation des ganglions lymphatiques. Pour isoler les ganglions lymphatiques inguinaux de nouveau-nés, après avoir sectionné la tête, utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir le corps de l'animal depuis le haut de la région thoracique jusqu'au bas de l'abdomen.

Après avoir soigneusement retiré toutes les viscères de la cavité abdominale, placez le corps dans une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant le milieu RF 10. Placez la boîte dans une hotte de culture stérile, puis transférez le corps dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 90 millimètres contenant du milieu RF 10 frais. Ensuite, détachez délicatement le péritoine de la peau au niveau de la région inguinale et localisez les ganglions lymphatiques inguinaux situés à l'intersection de trois vaisseaux sanguins dans la couche adipeuse.

Retirez soigneusement les ganglions lymphatiques en veillant à éliminer tout le tissu adipeux. Ensuite, placez les ganglions lymphatiques dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant du milieu RF 10 placée sur de la glace afin d'isoler les bourrelets graisseux inguinaux d'embryons de jour 18,5. Après avoir retiré les viscères comme vient de l'être démontré, lavez les corps dans du PBS stérile pour éliminer toute trace de sang.

Transférez les corps nettoyés dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres, puis détachez le péritoine, localisez le ganglion lymphatique inguinal et retirez-le comme vient de l'être démontré. Jetez le tissu isolé. Veillez à retirer entièrement le ganglion lymphatique afin d'éviter toute contamination du chimère du bourrelet adipeux.

Ensuite, retirez le bourrelet adipeux inguinal et placez-le dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant du milieu RF 10 sur de la glace. Pour mettre en place le système de culture d'organes in vitro, découpez d'abord du Vulcan sous emballage en morceaux de un à 1,5 centimètre carré. Faites ensuite bouillir les éponges pendant deux heures et les filtres pendant 20 minutes dans de l'eau distillée, puis laissez-les sécher plusieurs heures dans une hotte de culture cellulaire.

Une fois les matériaux secs, placer une éponge dans chaque boîte de Pétri de 50 millimètres contenant deux millilitres de milieu. Immerger chaque éponge dans le milieu afin d'humidifier les deux faces, puis placer un filtre par système de culture d'organe in vitro à l'interface liquide-air. Ensuite, reconstituer soigneusement un bourgeon graisseux embryonnaire avec un ganglion lymphatique de nouveau-né directement sur le dessus de chaque filtre.

Transférez les boîtes de Pétri dans une boîte plastique rectangulaire contenant de l'eau au fond et des trous sur le couvercle. Fixez le couvercle à la boîte à l'aide de ruban adhésif en laissant les trous ouverts. Placez ensuite la boîte dans une étuve à culture cellulaire régulée à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Laisser l'enceinte s'équilibrer pendant deux heures, puis boucher les trous du couvercle avec du ruban adhésif. Incuber les tissus pendant au moins deux jours afin de permettre aux ganglions lymphatiques de s'attacher aux bourrelets graisseux avant le transfert sous la capsule rénale, trois à quatre semaines après la transplantation. Isoler chaque chimère composée du bourrelet graisseux et du ganglion lymphatique dans chaque rein et disséquer les ganglions lymphatiques.

Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, utilisez une petite paire de ciseaux pour pratiquer une incision unique dans le tissu afin de faciliter la digestion enzymatique. Placez ensuite un ganglion lymphatique dans chaque tube einor individuel de 1,5 millilitre contenant 600 microlitres de tampon de digestion. Incubez les tubes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique agité, en pipetant le mélange vers le haut et vers le bas toutes les 10 minutes pour aider à la dissociation du tissu.

Ensuite, ajoutez six microlitres d'EDTA dans les tubes et pipetez plusieurs fois la suspension cellulaire pour terminer la dissociation. Les cellules peuvent alors être marquées avec les anticorps d'intérêt souhaités et analysées par cytométrie en flux afin de préserver l'expression de la protéine fluorescente jaune améliorée ou EYFP. Fixez les ganglions lymphatiques pendant trois à quatre heures.

Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, déposer une seule goutte de composé OCT froide sur un petit morceau de papier d’aluminium. Placer soigneusement, en évitant les bulles d’air, un ganglion lymphatique au centre de chaque goutte, puis poser le papier d’aluminium sur de la glace sèche afin de congeler les tissus. Les ganglions lymphatiques peuvent ensuite être sectionnés, colorés et analysés par microscopie fluorescente.

L'isolement minutieux du ganglion lymphatique permet une analyse plus poussée de la descendance des cellules dérivées du tissu adipeux positives pour EYFP. Des sections cryogéniques et une analyse par immunofluorescence du ganglion lymphatique révèlent que les cellules dérivées du tissu adipeux positives pour EYFP migrent vers le ganglion lymphatique, où elles contribuent au réseau des cellules stromales du ganglion lymphatique positives pour GP38 et ERTR7. Une analyse cytométrique confirme qu'une fraction importante des cellules stromales du ganglion lymphatique provient de précurseurs locaux du tissu adipeux positifs pour EYFP, contribuant à 30 % de la fraction fibroblastique CD45 négatif, GP38 positif, CD31 négatif, et à 10 % de la fraction des cellules endothéliales sanguines CD45 négatif, GP38 négatif, CD31 positif. Jusqu'à 80 % de la fraction fibroblastique CD45 négatif, GP38 positif, CD31 négatif peut provenir de cellules précurseurs du tissu adipeux, démontrant ainsi le rôle crucial joué par le tissu adipeux dans le maintien de la croissance du stroma ganglionnaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée par un chercheur dans le domaine de l'organogenèse lymphoïde afin d'explorer le rôle de différentes molécules impliquées dans les traumatismes lymphoïdes.