Name: Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez la génération de chimères ganglion/coussinet gras pour étudier l'origine des cellules stromales lymphatiques chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer la contribution du tissu adipeux au développement du stroma ganglionnaire.

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Nous sommes reconnaissants envers le personnel de l’unité des services biomédicaux de l’Université de Birmingham pour avoir pris soin de nos colonies animales. Ce travail a été soutenu par le projet intégré INFLACARE to JC du 7e PC de l’UE.

Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions SPF dans l’unité de services biomédicaux de l’Université de Birmingham conformément aux réglementations du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et du comité d’éthique local. Toutes les procédures décrites dans ce protocole sont couvertes par une licence de projet approuvée à la fois par le comité d’éthique local et le ministère de l’Intérieur.
1. Isolement des LN nouveau-nés
<ol>
	<li>Sacrifiez les souris nouveau-nées par luxation cervicale.</li>
	<li>Sectionnez la tête et ouvrez le corps avec des ciseaux du haut de la région thoracique vers le bas de la région abdominale et retirez soigneusement tous les viscères (cœur, poumons, foie, intestin, rein, vessie) de la cavité abdominale.</li>
	<li>Transvaser le corps dans une boîte de Pétri de 90 mm contenant du milieu RF10 (RPMI1640 milieu complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine). À partir de cette étape, les tissus seront conservés dans des conditions stériles et manipulés dans une hotte de culture de tissus.</li>
	<li>Transférez le corps dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 mm contenant du RF10.</li>
	<li>Sous le microscope à dissection, détachez soigneusement le péritoine de la peau dans la région inguinale. Le LN inguinal est situé à l’intersection de trois vaisseaux sanguins dans le coussinet adipeux.</li>
	<li>Retirez délicatement le LN. Assurez-vous que tout le tissu adipeux est enlevé. Transférez le LN dans une boîte de Pétri de 50 mm contenant un support RF10. Gardez les mouchoirs sur de la glace tout en poursuivant la procédure.</li>
</ol>
2. Isolation des coussinets adipeux E18.5
<ol>
	<li>Pour générer des embryons de souris au jour 18,5 de la gestation (E18.5), établissez des grossesses programmées en plaçant une souris femelle et une souris mâle par cage pendant la nuit. Séparez les souris le matin et vérifiez s’il n’y a pas de bouchons vaginaux (jour de gestation E0.5).
	<ol>
		<li>Euthanasier les femelles bouchées au 18,5e jour de la grossesse par luxation cervicale.</li>
		<li>Retirez les embryons et placez-les dans une boîte de Pétri de 90 mm contenant du RF10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>À partir de cette étape, les tissus doivent être manipulés à l’aide d’une technique stérile dans le capot de culture tissulaire. Sous le microscope de dissection, sectionnez la tête, ouvrez les embryons avec des ciseaux de la région thoracique jusqu’au bas de la région abdominale et retirez soigneusement tous les viscères (cœur, poumons, foie, intestin, rein, vessie) de la cavité corporelle.</li>
	<li>Nettoyez le corps de tous les tissus viscéraux restants et lavez-le au PBS pour éliminer toute trace de sang qui pourrait rendre la dissection plus difficile.</li>
	<li>Transférez les corps propres dans une boîte de Pétri fraîche de 90 mm contenant du RF10.</li>
	<li>Détachez soigneusement le péritoine de la peau dans la région inguinale. Le LN inguinal est situé à l’intersection de trois vaisseaux sanguins dans le coussinet adipeux.</li>
	<li>Retirez délicatement le LN et jetez-le. Il est très important d’enlever complètement le LN pour s’assurer que le coussinet adipeux utilisé pour les chimères n’est pas contaminé par des cellules stromales lymphoïdes.</li>
	<li>Retirez le coussinet adipeux inguinal et transférez-le dans une boîte de Pétri de 50 mm contenant un média RF10. Gardez les mouchoirs sur de la glace tout en poursuivant la procédure.</li>
</ol>
3. Génération de la chimère LN-fat Pad
<ol>
	<li>Préparer le système de culture d’organes in vitro 15.
	<ol>
		<li>Préparation des éponges et des filtres : Cela peut être fait à l’avance et les éponges et les filtres peuvent être conservés stériles dans une boîte de Pétri dans la hotte de culture.
		<ol>
			<li>Coupez le Vulkan Underwrap en 1-1,5 cm2 morceaux</li>
			<li>Faites bouillir les éponges pendant 2 heures dans de l’eau distillée.</li>
			<li>Laissez sécher les éponges pendant quelques heures dans la hotte de culture cellulaire.</li>
			<li>Faites bouillir les filtres pendant 20 min.</li>
			<li>Laissez sécher les filtres pendant quelques heures dans la hotte de culture cellulaire.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Préparez un milieu DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 10 mM de HEPES, 1 solution d’acides aminés non essentiels MEM, 50 mM de 2-Mercaptoéthanol, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2 mM de L-Glutamine.</li>
		<li>Ajouter 2 ml de média dans une boîte de Pétri de 50 mm.</li>
		<li>Disposez une éponge au fond de la boîte de Pétri. Mouillez les deux côtés de l’éponge en les immergeant dans le support.</li>
		<li>Placez un filtre sur l’éponge. Le filtre est positionné à l’interface liquide-air.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sous le microscope de dissection, réassociez soigneusement un LN nouveau-né à un coussinet adipeux embryonnaire.</li>
	<li>Placez la chimère du tampon LN-fat sur le filtre.</li>
	<li>Transférez la boîte de Pétri dans une boîte en plastique rectangulaire avec quelques trous sur le couvercle et contenant de l’eau au fond pour assurer l’humidité.</li>
	<li>Fermez le couvercle de la boîte avec du ruban adhésif. Laissez les deux trous du couvercle ouverts.</li>
	<li>Transférez la boîte dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2. Laissez la boîte s’équilibrer pendant 2 heures, avant de sceller les trous du couvercle avec du ruban adhésif.</li>
	<li>Incuber les tissus pendant au moins 2 jours pour permettre au LN de se fixer au coussinet adipeux et d’être transférable sous la capsule rénale.</li>
</ol>
4. Transfert de la chimère du tampon de graisse LN sous la capsule rénale de souris hôtes
<ol>
	<li>Récupérez les chimères du tampon LN-fat du filtre et transférez-les sous la capsule rénale de souris hôtes. La méthode de transfert par capsule rénale a déjà été décrite 16.</li>
</ol>
5. Isolation des LN transférées
<ol>
	<li>Après 3-4 semaines sous la capsule rénale, les chimères des coussinets de graisse LN sont prêtes à être récoltées. Euthanasier les souris hôtes en suivant les directives approuvées.</li>
	<li>Retirez le rein des souris hôtes.</li>
	<li>Sous le microscope de dissection, isolez la chimère du tampon LN-graisse et disséquez le LN.</li>
</ol>
6. Digestion enzymatique des LN transférés pour l’analyse par cytométrie en flux
<ol>
	<li>Faites une incision dans le LN avec de petits ciseaux pour permettre aux enzymes de pénétrer dans l’organe et faciliter la digestion.</li>
	<li>Placer un LN dans 1,5 ml d’Eppendorf contenant 600 μl de tampon de digestion (RPMI 1 % FCS, 2,5 mg/ml de collagénase D, 100 μg/ml de DNase I).</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à 37 °C sur un bloc thermique agitant. Pipette de haut en bas pour aider à la dissociation des tissus toutes les 10 min.</li>
	<li>Ajoutez 6 μl d’EDTA 0,5 M dans le tube et pipetez de haut en bas pour terminer la dissociation des tissus.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 5 min à 490 x g.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution de coloration (PBS, 0,1 % BSA, 5 % de sérum de rat et 5 % de sérum de souris) contenant la combinaison d’anticorps primaires.</li>
	<li>Incuber 30 min sur glace.</li>
	<li>Laver deux fois en PBS</li>
	<li>Incuber avec des anticorps secondaires pendant 20 minutes si nécessaire.</li>
	<li>Laver 2x dans du PBS.</li>
	<li>Analyser sur cytomètre en flux.</li>
</ol>
7. Analyse des LN transférés par immunofluorescence
<ol>
	<li>Fixation pour la conservation de l’EYFP pendant le processus de congélation et de cryosections : Placez le LN dans une solution de PBS, 4 % de PFA et 10 % de saccharose et laissez agir 3-4 heures.</li>
	<li>Mettez une seule petite goutte de composé O.C.T. froid sur un petit morceau de papier d’aluminium. Évitez les bulles d’air. Placez soigneusement le LN sans aucun liquide au milieu de la goutte.</li>
	<li>Congelez l’organe en plaçant la feuille d’aluminium sur de la glace sèche.</li>
	<li>Découpez des sections de 8 à 10 μm sur des lames de verre adhésives supplémentaires à l’aide d’un cryostat. Laissez sécher les lames pendant 2 heures avant de les stocker à -20 °C.</li>
	<li>Les procédures de coloration peuvent varier en fonction des anticorps primaires utilisés et peuvent être optimisées à partir du protocole suivant. Colorer les sections avec une solution de coloration (PBS, 1 % BSA) contenant la combinaison d’anticorps primaires.</li>
	<li>Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Laver deux fois dans du PBS pendant 5 min</li>
	<li>Incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 heure.</li>
	<li>Laver deux fois au PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Montez les diapositives dans un support de montage contenant du DAPI.</li>
	<li>Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+stromal+organizer+cells+during+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development.</a> J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).</li>
<li>Cupedo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presumptive+lymph+node+organizers+are+differentially+represented+in+developing+mesenteric+and+peripheral+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes.</a> J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).</li>
<li>Avan de Pavert, S., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of lymphoid tissues.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 664-674 (2010).</li>
<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, nous avons présenté une méthode pour doser et quantifier la contribution des cellules progénitrices du tissu adipeux aux LN en développement et deux techniques qui permettent l’analyse de leur descendance. La dissection des coussinets adipeux embryonnaires et des LN nouveau-nés est délicate et nécessite des compétences manuelles acquises par beaucoup de pratique avant la génération de la chimère réelle des coussinets graisseux LN. Pour contrôler la qualité des dissections, une analyse cytométrique en fl...

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes clés du système immunitaire situés à des endroits stratégiques du corps, le long du réseau vasculaire lymphatique. Ils permettent la filtration des antigènes et des agents pathogènes et fournissent un site pour la présentation de l’antigène aux lymphocytes et l’induction de réponses immunitaires adaptatives. Le stroma, qui forme la structure de base du LN et orchestre le mouvement des différents participants hématopoïétiques de la réponse immunitaire adaptative, est central au fonctionnement de ces organes. Différentes populations de cellules stromales fournissent des indices essentiels et spécifiques pour les mouvements, la localisation, la survie, la prolifération et la maturation de la composante hématopoïétique du système immunitaire1-3. Les cellules stromales LN adultes se divisent en trois catégories : les cellules endothéliales sanguines, les cellules endothéliales lymphatiques et les fibroblastes. Ces trois catégories englobent des populations hétérogènes. Les populations fibroblastiques contiennent des cellules réticulaires fibroblastiques (FRC), des cellules dendritiques folliculaires (FDC), des cellules réticulaires marginales (MRC), tandis que les fibroblastes formant la capsule, la moelle épinière et d’autres cellules qui ne sont pas encore identifiées1-5. Les origines et les mécanismes régissant la maturation des différentes populations de cellules stromales LN sont incertains, et l’absence de marqueurs spécifiques permettant la cartographie du devenir de populations spécifiques de cellules stromales LN rend leur étude particulièrement difficile. Cependant, une compréhension complète de l’ontogenèse des cellules stromales LN est nécessaire à la compréhension des réponses immunitaires adaptatives, des mécanismes contribuant à la tolérance et est à la base du développement des LN artificiels.
Jusqu’à présent, l’étude de l’origine et du développement des cellules stromales LN s’est principalement limitée à l’évaluation directe du développement de LN chez les embryons et les nouveau-nés chez les souris de type sauvage et différentes souchesde souris knock-out 6-9. Ces approches sont limitées par la létalité embryonnaire et périnatale de certaines souches de souris porteuses de délétions dans des gènes importants pour le développement de LN. De plus, certains des gènes essentiels au développement du tissu lymphoïde sont également impliqués dans un large éventail de processus biologiques, comme c’est le cas pour RANK10-11 ou NF-κB212. Pour résoudre ces problèmes, l’isolement et la transplantation de LN embryonnaires sous la capsule rénale d’une souris hôte ont été effectués12-13. Cette technique permet, par exemple, le transfert de LN embryonnaires génétiquement modifiés dans un environnement de type sauvage pour évaluer le développement des organes et le recrutement et l’organisation des cellules hôtes. Cependant, la croissance du LN embryonnaire greffé sous la capsule rénale d’un hôte adulte est altérée, limitant ainsi l’utilisation de cette technique.
LNs et les dépôts de graisse sont anatomiquement étroitement associés et se développent simultanément au cours de l’embryogenèse. Nous avons récemment démontré que l’association LN/tissu adipeux joue un rôle crucial dans la fourniture de progéniteurs de cellules stromales pour les LN. En particulier, la signalisation par le LTβR contrôle le destin des cellules précurseurs des adipocytes en bloquant l’adipogenèse et en favorisant plutôt la maturation vers un phénotype14 des cellules stromales LN. Nous décrivons ici une méthode basée sur la génération de chimères de coussinets de graisse LN permettant le traçage des cellules dérivées du tissu adipeux dans le LN en développement. Cette méthode sera utile pour déterminer la contribution des tissus adipeux à différentes populations de cellules stromales LN et, combinée à l’utilisation de tissus issus de souches de souris génétiquement modifiées, permettra de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la différenciation des différents sous-ensembles de cellules stromales LN.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Boîte de Pétri Sterilin</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Sterilin 90 mm</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Lames adhésives</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgM Rhodamine Rouge</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Podoplanin PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Podoplanin purifié</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Pince extra fine pour dissections embryonnaires et néonatales</td></tr><tr><td>Solution EDTA 0.5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris fins trempés droits 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Petits ciseaux pour la dissection</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à membrane isopore 0.8 &mu ; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en plastique avec couvercle</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E6052</td><td>Boîte à sandwich pour la culture d’organes in vitro. Percez deux trous dans le couvercle pour permettre l’échange gazeux dans l’incubateur CO2.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Éponges Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Microscope de dissection avec zoom</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Medium avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Le stroma est un composant clé de la structure et de la fonction des ganglions lymphatiques. Cependant, on sait peu de choses sur son origine, sa composition cellulaire exacte et les mécanismes qui régissent sa formation. Les ganglions lymphatiques sont toujours encapsulés dans le tissu adipeux et nous avons récemment démontré l’importance de cette relation pour la formation du stroma des ganglions lymphatiques. Les cellules précurseurs des adipocytes migrent dans le ganglion lymphatique au cours de son développement et, lors de l’engagement du récepteur de la lymphotoxine b, interrompent l’adipogenèse et se différencient en cellules stromales lymphoïdes (Bénézech et al.14). Sur la base du potentiel de stroma lymphoïde du tissu adipeux, nous présentons une méthode utilisant une chimère de ganglion lymphatique/coussinet adipeux qui permet le traçage de la lignée des précurseurs des cellules stromales des ganglions lymphatiques. Nous montrons comment isoler les ganglions lymphatiques du nouveau-né et le tissu adipeux embryonnaire EYFP+ et fabriquer une chimère de coussinet adipeux LN/ EYFP+. Après transfert sous la capsule rénale d’une souris hôte, le ganglion lymphatique incorpore des cellules précurseurs locales du tissu adipeux et termine sa formation. L’analyse de la descendance des cellules du coussinet adipeux EYFP+ dans les ganglions lymphatiques résultants peut être effectuée par analyse cytométrique en flux des ganglions lymphatiques digérés par voie enzymatique ou par analyse par immunofluorescence des cryosections de ganglions lymphatiques. En utilisant des coussinets adipeux provenant de différents modèles de souris knock-out, cette méthode fournira un moyen efficace d’analyser l’origine des différentes populations de cellules stromales des ganglions lymphatiques.

Trois semaines après la transplantation, le chimère ganglion lymphatique/gaine adipeuse est récupéré au niveau du rein. Le chimère est désormais très similaire à un ganglion lymphatique normal dans sa propre gaine adipeuse, et le ganglion lymphatique est visible au centre du tissu adipeux (Figure 1). Si le ganglion lymphatique ne peut pas être identifié, il est possible qu’il ait été perdu lors de la transplantation sur le rein. Lors de l’évaluation du rôle de gènes potentiellement importants dans le dév...

La génération de chimères de ganglion lymphatique/coussinet adipeux pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques est décrite. La méthode implique l’isolement des ganglions lymphatiques de souris nouveau-nées et de coussinets adipeux embryonnaires, la génération de coussinets adipeux chimériques et leur transfert sous la capsule rénale d’une souris hôte.

Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

L'objectif général de cette procédure est de générer un chimère composé d'une couche adipeuse et d'un ganglion lymphatique afin d'évaluer la contribution du tissu adipeux à la formation du stroma des ganglions lymphatiques. Cette opération s'effectue tout d'abord en isolant des ganglions lymphatiques de souriceaux nouveau-nés et des bourrelets graisseux d'embryons de souris au jour 18,5. Le ganglion lymphatique est ensuite retiré de la couche adipeuse embryonnaire et remplacé par le ganglion lymphatique de souriceau nouveau-né.Le chimère du bourrelet adipeux ganglionnaire est assemblé en reconstituant puis en cultivant in vitro un ganglion lymphatique de nouveau-né avec un bourrelet adipeux embryonnaire. Le chimère est ensuite greffé sous la capsule rénale d'une souris hôte. Trois semaines après la transplantation, le rein est prélevé et le chimère est récupéré.En fin de compte, la contribution des cellules issues du tissu adipeux à la stroma des ganglions lymphatiques peut être évaluée par analyse cytométrique en flux et par microscopie en immunofluorescence. Nous avons ainsi eu l'idée de cette méthode lorsque nous cherchions un moyen d'évaluer si les cellules du tissu adipeux participaient à la formation des ganglions lymphatiques. Pour isoler les ganglions lymphatiques inguinaux de nouveau-nés, après avoir sectionné la tête, utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir le corps de l'animal depuis le haut de la région thoracique jusqu'au bas de l'abdomen.Après avoir soigneusement retiré toutes les viscères de la cavité abdominale, placez le corps dans une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant le milieu RF 10. Placez la boîte dans une hotte de culture stérile, puis transférez le corps dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 90 millimètres contenant du milieu RF 10 frais. Ensuite, détachez délicatement le péritoine de la peau au niveau de la région inguinale et localisez les ganglions lymphatiques inguinaux situés à l'intersection de trois vaisseaux sanguins dans la couche adipeuse.Retirez soigneusement les ganglions lymphatiques en veillant à éliminer tout le tissu adipeux. Ensuite, placez les ganglions lymphatiques dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant du milieu RF 10 placée sur de la glace afin d'isoler les bourrelets graisseux inguinaux d'embryons de jour 18,5. Après avoir retiré les viscères comme vient de l'être démontré, lavez les corps dans du PBS stérile pour éliminer toute trace de sang.Transférez les corps nettoyés dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres, puis détachez le péritoine, localisez le ganglion lymphatique inguinal et retirez-le comme vient de l'être démontré. Jetez le tissu isolé. Veillez à retirer entièrement le ganglion lymphatique afin d'éviter toute contamination du chimère du bourrelet adipeux.Ensuite, retirez le bourrelet adipeux inguinal et placez-le dans une boîte de Pétri de 50 millimètres contenant du milieu RF 10 sur de la glace. Pour mettre en place le système de culture d'organes in vitro, découpez d'abord du Vulcan sous emballage en morceaux de un à 1,5 centimètre carré. Faites ensuite bouillir les éponges pendant deux heures et les filtres pendant 20 minutes dans de l'eau distillée, puis laissez-les sécher plusieurs heures dans une hotte de culture cellulaire.Une fois les matériaux secs, placer une éponge dans chaque boîte de Pétri de 50 millimètres contenant deux millilitres de milieu. Immerger chaque éponge dans le milieu afin d'humidifier les deux faces, puis placer un filtre par système de culture d'organe in vitro à l'interface liquide-air. Ensuite, reconstituer soigneusement un bourgeon graisseux embryonnaire avec un ganglion lymphatique de nouveau-né directement sur le dessus de chaque filtre.Transférez les boîtes de Pétri dans une boîte plastique rectangulaire contenant de l'eau au fond et des trous sur le couvercle. Fixez le couvercle à la boîte à l'aide de ruban adhésif en laissant les trous ouverts. Placez ensuite la boîte dans une étuve à culture cellulaire régulée à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.Laisser l'enceinte s'équilibrer pendant deux heures, puis boucher les trous du couvercle avec du ruban adhésif. Incuber les tissus pendant au moins deux jours afin de permettre aux ganglions lymphatiques de s'attacher aux bourrelets graisseux avant le transfert sous la capsule rénale, trois à quatre semaines après la transplantation. Isoler chaque chimère composée du bourrelet graisseux et du ganglion lymphatique dans chaque rein et disséquer les ganglions lymphatiques.Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, utilisez une petite paire de ciseaux pour pratiquer une incision unique dans le tissu afin de faciliter la digestion enzymatique. Placez ensuite un ganglion lymphatique dans chaque tube einor individuel de 1,5 millilitre contenant 600 microlitres de tampon de digestion. Incubez les tubes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique agité, en pipetant le mélange vers le haut et vers le bas toutes les 10 minutes pour aider à la dissociation du tissu.Ensuite, ajoutez six microlitres d'EDTA dans les tubes et pipetez plusieurs fois la suspension cellulaire pour terminer la dissociation. Les cellules peuvent alors être marquées avec les anticorps d'intérêt souhaités et analysées par cytométrie en flux afin de préserver l'expression de la protéine fluorescente jaune améliorée ou EYFP. Fixez les ganglions lymphatiques pendant trois à quatre heures.Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, déposer une seule goutte de composé OCT froide sur un petit morceau de papier d’aluminium. Placer soigneusement, en évitant les bulles d’air, un ganglion lymphatique au centre de chaque goutte, puis poser le papier d’aluminium sur de la glace sèche afin de congeler les tissus. Les ganglions lymphatiques peuvent ensuite être sectionnés, colorés et analysés par microscopie fluorescente.L'isolement minutieux du ganglion lymphatique permet une analyse plus poussée de la descendance des cellules dérivées du tissu adipeux positives pour EYFP. Des sections cryogéniques et une analyse par immunofluorescence du ganglion lymphatique révèlent que les cellules dérivées du tissu adipeux positives pour EYFP migrent vers le ganglion lymphatique, où elles contribuent au réseau des cellules stromales du ganglion lymphatique positives pour GP38 et ERTR7. Une analyse cytométrique confirme qu'une fraction importante des cellules stromales du ganglion lymphatique provient de précurseurs locaux du tissu adipeux positifs pour EYFP, contribuant à 30 % de la fraction fibroblastique CD45 négatif, GP38 positif, CD31 négatif, et à 10 % de la fraction des cellules endothéliales sanguines CD45 négatif, GP38 négatif, CD31 positif. Jusqu'à 80 % de la fraction fibroblastique CD45 négatif, GP38 positif, CD31 négatif peut provenir de cellules précurseurs du tissu adipeux, démontrant ainsi le rôle crucial joué par le tissu adipeux dans le maintien de la croissance du stroma ganglionnaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée par un chercheur dans le domaine de l'organogenèse lymphoïde afin d'explorer le rôle de différentes molécules impliquées dans les traumatismes lymphoïdes.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Production de chimères entre ganglions lymphatiques et tissus adipeux pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

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Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques (Vidéo) | JoVE Journal

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