Name: Lutilisation de puces microfluidiques pour limagerie en direct et létude des réponses blessures en Drosophila Larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Apprenez à immobiliser des larves de Drosophila sans anesthésique toxique pour l'imagerie en direct des neurones et la régénération nerveuse. Cette méthode microfluidique permet l'observation sur 72 heures.

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, (numéro de subvention IOS-0842701 CAC), et l&#39;Institut national de la santé (R00MH080599 à BY, R21 NS062313 à NC, et NS069844 CAC). Nous tenons à remercier James Schutt, Emily Han, et Leni Truong pour le support technique et le centre de Stock Bloomington pour lignes de vol. Tous les jetons ont été fabriqués à l&#39;installation Lurie nanofabrication de l&#39;Université du Michigan.

Une. Faire la puce PDMS Pour faire une puce de PDMS du moule SU-8, suivez les étapes 1.1 à 1.7. Si une puce est à portée de main, mais doit assemblé pour l&#39;utilisation, passez à l&#39;étape 1.8. <ol><li> Mélanger 45 g de base PDMS et 4,5 g d&#39;agent (ratio 10:1) durcissement d&#39;un kit PDMS dans un petit récipient en plastique jetable et les mélanger soigneusement à l&#39;aide d&#39;un bâtonnet en plastique. </li><li> Placer le récipient dans un récipient sous vide (par exemple un dessiccateur) pendant 10 min pour éliminer les bulles. </li><li> Placer le moule SU-8 sur le fond d&#39;un plat de 150 mm de diamètre en plastique et verser lentement le mélange sur le moule PDMS. Prenez soin de ne pas générer des bulles tout en versant les PDMS. </li><li> Guérir les PDMS dans un four (ou incubateur) à 650 ° C pendant 4 heures. </li><li> Retirer le moule PDMS/SU-8 guéri du four et le laisser refroidir pendant quelques minutes. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, couper les PDMS durci le long du bord du moule SU-8 et le détacher de SU-8 moule. </li><li> Divisez la dalle de PDMSen PDMS puces individuelles en utilisant une lame de rasoir. </li><li> En utilisant une aiguille 21 G de distribution, percer un trou dans le port de vide (représenté sur la figure 1A) de la puce PDMS. </li><li> Prenez une aiguille 23 G de distribution et tordre l&#39;aiguille de sa base à quelques reprises pour casser l&#39;aiguille pointe hors du moyeu de verrouillage. </li><li> Insérer la pointe d&#39;aiguille de 23 G dans un petit morceau de tube de polyethylene de sorte que le tube recouvre au moins un millimètre de l&#39;aiguille. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper l&#39;excès de tube loin de l&#39;aiguille. Cela crée un anneau en plastique autour d&#39;une extrémité de l&#39;aiguille, ce qui va créer un joint d&#39;étanchéité lorsqu&#39;il est inséré dans l&#39;orifice d&#39;admission de vide. </li><li> Pour une utilisation avec un microscope inversé (figures 1B et 2A-B): insérer la pointe d&#39;aiguille 23 G dans le trou de l&#39;orifice d&#39;aspiration. Pour une utilisation avec un microscope droit (figures 1C et 2C-D): percer un deuxième trou sur le côté de la puce PDMS 21 G DispeNsing aiguille; ce trou donnera accès au premier trou sur le côté. Ensuite, insérez la pointe de l&#39;aiguille 23 G avec une bague de tuyau dans le trou latéral. Placez un morceau de ruban adhésif double face sur le dessus de la puce PDMS pour sceller le trou du haut (figure 1C). </li><li> Prenez un morceau de tube en polyéthylène qui est d&#39;environ 20 cm de longueur. Connecter un côté du tube à l&#39;extrémité de l&#39;aiguille qui est insérée dans l&#39;orifice de vide. </li><li> Branchez l&#39;autre extrémité du tube à l&#39;un des ports d&#39;une vanne 3 voies (voir &#39;3-way robinet »dans la liste des matières) </li><li> Attacher une seringue de 20 ml dans l&#39;un des deux ports restants. Le dernier orifice est ouvert à l&#39;environnement. </li></ol> 2. Utiliser le chip Larve pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Nettoyez la puce PDMS avec du ruban adhésif transparent. Fixez un morceau de ruban adhésif à la partie inférieure de la puce. Assurez-vous que la bande est en contact avec toute la surface de PDMS, puis décoller le ruban. </li><li> Répétez l&#39;étape ci-dessus 2-3x pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;yn&#39;y a pas de particules ou de l&#39;huile (retenues à partir d&#39;expériences antérieures) sur la surface de la puce PDMS. Depuis la puce PDMS est réutilisable, il est très important pour éliminer les résidus d&#39;huile car il peut affecter l&#39;adhérence de PDMS à verre et entraîner l&#39;insuffisance étanchéité. </li><li> Transfert tôt (c&#39;est à dire la recherche de nourriture) 3 e stade larvaire à une boîte de Pétri contenant de l&#39;eau. (Les larves de stade larvaire butinage 3 e sont dans l&#39;aliment, plutôt que du côté de la fiole de culture). Baigner les larves dans l&#39;eau pour éliminer le milieu de culture. </li><li> Prenez une lamelle de verre propre et placer une petite goutte d&#39;huile sur les halocarbures 700 en son centre. </li><li> En utilisant des pinces, prendre doucement un chiffon propre, en début de scène 3 e stade larvaire de l&#39;eau (la larve doit être ~ 3,5-4 mm de longueur). Placez l&#39;animal brièvement sur une lingette ou une serviette en papier léger pour enlever l&#39;excès d&#39;eau, puis placez-le sur la goutte d&#39;huile. La chute doit être assez petit de sorte que la trachée du larves sont pas revêtue. Laissez la station de larvey sur la goutte d&#39;huile pendant 10 sec. </li><li> Retirer la larve de la goutte d&#39;huile, puis placez-le sur une lamelle de verre propre. </li><li> Transférer la larve à l&#39;autre lamelle de verre propre. Cette étape élimine l&#39;excès de sébum. </li><li> Faites attention à l&#39;orientation de la larve. Pour imager la moelle épinière et les nerfs segmentaires de neurones, la face ventrale de la larve doit s&#39;asseoir sur la lamelle. Sa face dorsale, caractérisé par deux tubes trachéaux longitudinales, devrait faire face vers le haut. Note: ceci est l&#39;orientation la larve préfère naturellement. </li><li> Placez délicatement la puce PDMS sur le dessus de la larve. La chenille doit être aligné sur le centre du milieu de la microchambre, avec sa orientée vers l&#39;orifice de vide queue. Veillez à ce que la larve ne touche pas les bords de la chambre. Ceci est particulièrement important pour les terminaux antérieure et postérieure de la trachée. Remarque: cette étape est le mieux fait sous une loupe binoculaire. </li><li> Poussez la puce PDMS contre la lamelle de verre pour obtenir une bonne étanchéité. Assurez-vous que la larve est entièrementclos par la microchambre lorsque la puce PDMS est en contact avec la lamelle de verre. </li><li> Commuter la vanne à 3 voies de telle sorte que la seringue peut aspirer de l&#39;air à partir de la microchambre PDMS (à travers le tube) pour créer un vide. </li><li> Avec une main, maintenez la lamelle puce PDMS / verre fermement. Utilisez l&#39;autre main pour tirer le piston de la seringue. Retirer 2-2,5 ml d&#39;air, jusqu&#39;à sentir une résistance dans la poignée de seringue, pour créer le vide. Le vide produit un joint étanche entre la puce PDMS, de l&#39;huile, et des interfaces de la lamelle et limite la mobilité de la larve. </li><li> Commuter la vanne hors tension de telle sorte que la puce PDMS est isolé de la seringue et de l&#39;environnement. En conséquence, un niveau de vide relativement stable est maintenue dans la microchambre sans qu&#39;il soit nécessaire pour maintenir le piston de la seringue. </li><li> Vérifiez la larve sous le stéréoscope pour s&#39;assurer que le corps de l&#39;animal entier est placé à l&#39;intérieur de la microchambre, et que l&#39;animal est immobile. La trachée doit être visible. Le reste de l&#39;Puce PDMS doit être en contact avec la lamelle. Note: Voir les figures 2E et 2F pour des exemples d&#39;animaux correctement immobilisés dans la puce. Certaines orientations incorrectes sont présentés dans les figures 2G et 2H. </li><li> Placez la puce de larve (puce PDMS + lamelle de verre) sur le microscope. La puce de larve, la tuyauterie et la seringue doivent être manipulés avec soin pour éviter le détachement de la puce PDMS de la lamelle. Pour un microscope droit, fixer le côté «haut» de la puce à l&#39;étape de microscope avec du ruban adhésif double-face (figure 1C). </li><li> Utilisez un objectif à fort grossissement (immersion d&#39;huile, 40-63X est recommandé) pour localiser la structure (s) de l&#39;animal d&#39;intérêt et effectuer l&#39;imagerie. Dans certains cas, un grossissement plus faible peut être nécessaire pour identifier la région souhaitée de formation d&#39;image avant de passer à un plus fort grossissement. </li><li> Lorsque l&#39;imagerie est terminée, libérer le vide par la vanne de commutation à la positionqui est ouvert à l&#39;environnement. </li><li> Détachez la puce PDMS de la lamelle. La larve doit être immédiatement mobiles. </li><li> Utilisez une pince pour enlever la larve de la microchambre et placez doucement la larve sur une plaque de gélose jus de raisin pour la récupération. </li></ol> 3. Induisant une blessure par écrasement du nerf de nerfs larves segmentaires <ol><li> Suivez l&#39;étape 2.3 ci-dessus pour isoler début étapes 3 e stade larvaire du génotype désiré. Comme décrit dans l&#39;étape 2.3 baignent les larves dans l&#39;eau pour enlever la nourriture. </li><li> Utilisez une station de l&#39;anesthésie norme mouche CO 2, de CO 2 pad maintenu sous une loupe binoculaire de dissection, pour maîtriser les larves. Les larves devrait devenir immobiles après le placement sur ​​le CO 2 pad pendant 1-2 min. </li><li> Maintenant, placez une seule larve anesthésié sur une plaque de gélose jus de raisin sous la loupe binoculaire. Tournez la face ventrale de l&#39;animal à visualiser la corde nerveuse ventrale et segmentaire des nerfs à travers la cuticule ( <strong&gt; Figure 3). Assurez-vous que la larve est complètement immobiles. </li><li> Utilisation Dumostar numéro 5 pince, pincer les nerfs segmentaires bien à travers la cuticule pour 5-10 sec. Lorsque cela est fait correctement, la cuticule reste intacte et la paroi du corps n&#39;est pas percé. Note: La blessure peut être effectuée à différentes positions le long de l&#39;axe du corps antérieur-postérieur, aussi longtemps que le cordon ventrale du nerf, les glandes salivaires, l&#39;intestin et ne sont pas endommagés. L&#39;endroit le plus efficace de la blessure est vers l&#39;extrémité du segment abdominal de 3 e, comme représenté sur la figure 3D. Blessures dans ce lieu endommage les nerfs et la plupart le plus facile à reproduire sans tuer l&#39;animal. </li><li> Après la blessure, tourner l&#39;animal de telle sorte que sa face ventrale vers le bas sur la plaque de raisin. Il devrait être en mesure de déplacer sa tête et manger. Si la blessure a été un succès, alors la moitié postérieure de la larve sera paralysé. </li><li> Gardez les animaux blessés sur la plaque de gélose de jus de raisin à 25 ans &amp;# 176; C pendant le temps voulu en fonction de l&#39;objectif expérimental. Pour motoneurones, le moignon proximal commence à germer dans les 8-10 heures de blessure 14, et le moignon distal commence à dégénérer dans 6-8 h 15. Pour la classe IV da neurones sensoriels, le moignon proximal commence à germer dans les 4-6 heures, et le début de moignon distal à dégénérer dans 3-4 heures après la blessure. Remarque: avec les pilotes Gal4 appropriées et rapporteurs fluorescents, la germination et la dégénérescence peuvent être observés dans la puce de la larve (par exemple, voir la figure 6). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Faire ou l&#39;obtention de la puce de larve: La puce de la larve se compose d&#39;un bloc de PDMS (appelée la «puce PDMS &#39;) fixée à une lamelle de verre. Le protocole décrit à l&#39;étape 1 de la procédure de fabrication et d&#39;utilisation des copeaux de larve, en supposant un moule SU-8 est disponible. Le moule SU-8 est microfabriqué en motif par photolithographie par une épaisse couche de résine photosensible SU-8 de 140 um sur une plaquette de silicium (pour les détails voir Ghannad-Rezaie et al. 12). Comme la microfabrication de la moule SU-8 nécessite un accès à de l&#39;équipement spécialisé, nous vous conseillons de commander à partir d&#39;une installation de microfabrication (p. ex. L&#39;installation LNF à l&#39;Université du Michigan 14), ou d&#39;une fonderie en leur envoyant la conception de la puce qui est fourni comme un dossier complémentaire. Si l&#39;on veut changer la conception de la puce PDMS (par exemple pour une utilisation avec des larves de différentes tailles), un logiciel de CAO qui gère les fichiers DXF (Autocad par exemple) peuvent être utilisés. Un SU-8 moule peut également être faite en interne suivant les instructions de Mondal et al. 27 Beaucoup de lecteurs peuvent trouver pratique d&#39;obtenir simplement une puce de PDMS de l&#39;échantillon à tester la technique avant de fabriquer leurs propres puces. Ce sera mis à disposition gratuitement sur demande. L&#39;utilisation de la «puce larve&quot; microfluidique pour l&#39;imagerie en direct: Procédé d&#39;immobilisation dans la puce de larve évite l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques, et comporte à la place la pression, via l&#39;application d&#39;un vide, pour restreindre le mouvement de l&#39;animal. Alors que les animaux peuvent survivre immobilisation dans la puce pour plusieurs heures 12, une période d&#39;immobilisation plus courte (5-15 min) est recommandé. C&#39;est assez de temps pour l&#39;imagerie de nombreux événements cellulaires d&#39;intérêt, y compris les modifications du calcium intracellulaire, ou le transport axonal rapide. C&#39;est aussi un temps suffisant pour les manipulations souhaitées dans les animaux vivants, comme le laser à base de microchirurgie, photoblanchiment, et photoconversion. Pour étudier les événements longitudinalement sur une période de temps plus longue chez un seul animal, les animaux peuvent être placés dans la puce et imagés plusieurs fois, séparées par des périodes de repos. plaques d&#39;agar jus de raisin sont idéales pour se reposer entre les séances d&#39;imagerie, car ils fournissent une source de nourriture facile et de l&#39;humidité. Plusieurs sessions d&#39;imagerie affectent la survie des larves à un degré, puisque chaque session comporte un certain risque pour endommager l&#39;animal (voir partie 2 en dépannage, ci-dessous). Les animaux peuvent être imagés en routine&gt; 5 fois au cours de deux jours, avec un taux de survie supérieur à 50%. Comme les animaux ne sont pas anesthésiés, ils sont en bonne santé et mobiles, immédiatement après la libération de la dépression dans la puce. Il n&#39;y a donc pas besoin de temps de récupération entre les séances d&#39;imagerie, de sorte que l&#39;intervalle de temps entre des sessions est flexible et peut être adapté aux objectifs de l&#39;expérience. Dépannage: C&#39;est la technique la plus courantepoursuit avec le morceau de larve et solutions recommandées sont les suivantes: (1) L&#39;animal se déplace trop. Trop de mobilité peut interférer avec les objectifs d&#39;imagerie. Les raisons les plus communes pour ce dans la puce de la larve sont a) l&#39;animal est trop petit pour la puce, ou b) la dépression appliquée lors de l&#39;étape d&#39;immobilisation est compromise. La puce de larve décrite dans ce protocole est conçu pour le début de mise en scène 3 e stade larvaire. La taille optimale de l&#39;animal est de 3,5 à 4 mm de longueur (selon l&#39;axe antéro-postérieur). Afin de s&#39;assurer que la pression de vide est suffisante, retirer la seringue de 2 à 2,5 ml, ou jusqu&#39;à sentir une résistance dans la poignée. Une indication que le vide fonctionne est que les petites bulles dans le canal périmétrique peuvent être vus se déplaçant lentement vers la source de vide. Une autre indication est que la lamelle doit toujours voyager avec la puce lorsque la puce est levé par le haut (et c&#39;est la méthode recommandée pour le transport de la chambreune fois que les larves est positionné et le vide est présent). Le vide peut être compromise si il existe des fissures dans le tube, ou si il est de l&#39;huile dans le tube. Ceci peut être facilement traitée par le remplacement de la 23 G distribution pointe de l&#39;aiguille et de polyéthylène-50 tubes (de 01.06 à 01.14 étapes). (2) L&#39;animal meurt après l&#39;imagerie dans la puce. La procédure est destinée à provoquer un minimum de stress sur l&#39;animal, et les animaux de génotype sauvage ont un taux de survie&gt; 90%, même après une heure d&#39;immobilisation sur la puce 12. Depuis certains génotypes peuvent être moins résistants au stress de la puce, vérifiez d&#39;abord que les animaux de type sauvage (par exemple, Canton S) survivent à la technique d&#39;immobilisation. a) La cause la plus fréquente de létalité est un mauvais positionnement de la larve (voir les figures 2G-H). Si des parties de la cuticule, la tête ou de la trachée ne sont pas entièrement à l&#39;intérieur de la chambre, alors ils peuvent être endommagés lors de l&#39;immobilisation, et unelarve qui est trop grand pour la puce (&gt; 4 mm) est moins de chances de survivre. b) A cause moins fréquente de la létalité est l&#39;utilisation d&#39;une trop forte pression ou sous vide lors du chargement de la puce. Lorsqu&#39;il est correctement positionné dans la puce, la pression générée par le vide est bien toléré. Cependant pression excessive, soit à partir du vide ou dans la phase initiale de mise en place de l&#39;animal peut être un problème. Il est préférable d&#39;apprendre le degré de pression nécessaire empiriquement par des essais de type sauvage larves de la bonne taille. c) Si trop d&#39;huile sur les halocarbures couvre la trachée de l&#39;animal l&#39;animal peut potentiellement avoir des problèmes avec la survie à long terme. L&#39;huile joue plusieurs rôles importants dans la puce: il est important pour la création du vide, au cours de l&#39;optique d&#39;imagerie, et elle s&#39;oppose à la dessiccation dans la puce. Cependant huile excessive doit être évitée. (Ceci peut également conduire à l&#39;huile dans le tube et d&#39;une seringue, ce qui compromet le vide). Les couches de protocole proposées juste le côté ventral de la larve à l&#39;huile, puis reDéplace le curseur excès d&#39;huile par le placement de la larve sur une lamelle propre avant de le transférer à la lamelle finale pour l&#39;imagerie. d) la phototoxicité peut être vécue de la session d&#39;imagerie. Comme avec n&#39;importe quelle application de l&#39;imagerie en direct, il est idéal à utiliser de courtes durées d&#39;exposition avec une faible lumière laser d&#39;intensité, ce qui est le mieux réalisé en utilisant une caméra très sensible ou détecteur. Essayez de réduire l&#39;éclairage à la lumière UV, y compris la lumière à large spectre créée par les sources de lumière de mercure. D&#39;autres questions et orientations futures: Comme cette méthode n&#39;utilise pas les anesthésiques, le cœur de l&#39;animal continue à battre. Cela crée une certaine mobilité inévitable, ce qui affecte l&#39;imagerie dans certains endroits plus que d&#39;autres. Les exemples ici montrent que le cordon ventral de nerf, nerfs segmentaires, et la paroi du corps peuvent être facilement visualisés sans ingérence de la pulsation. Dans les cas où le rythme cardiaque affecte l&#39;imagerie, les mouvements réguliers peuvent parfois être corrigées pour tenir avecdans le logiciel d&#39;analyse (par exemple, le stabilisateur d&#39;image plugin ImageJ). Cela fonctionne bien lorsque des objets individuels se déplacent sur une échelle de temps rapide (par exemple ~ 1 um / s pour le transport axonal rapide) ou sur une échelle de temps très lent (minutes à quelques heures). Toutefois, lorsque l&#39;objet (s) d&#39;intérêt se déplacent avec une gamme de vitesses et les directions, il peut être plus difficile à corriger le rythme cardiaque induite par les mouvements. Un autre problème est légère variabilité dans l&#39;optique de l&#39;animal à animal, ou entre plusieurs sessions d&#39;imagerie du même animal dans la puce. Le plus profond de l&#39;objet d&#39;intérêt est dans l&#39;animal, plus cette variation sera. Nerfs segmentaires et la corde nerveuse ventrale sont normalement trop profondément dans l&#39;animal, puis à être imprimé sur un microscope ordinaire. Cependant la pression légère connu dans la puce de larve pousse ces structures très proche de la cuticule et lamelle. La distance exacte de ces structures de la lamelle aura de petites variations de trIAL à un procès. La variation pour des objets près de la cuticule, tels que les corps cellulaires des neurones sensoriels, est inférieure. Il est donc important, en particulier pour effectuer des mesures d&#39;intensité, d&#39;utiliser un grand nombre d&#39;animaux et des essais indépendants pour tenir compte de la variabilité dans l&#39;optique. Bien que les exemples présentés ici ont porté sur les processus dans les neurones, l&#39;approche doit être possible d&#39;imager toute structure dans l&#39;animal qui peut être mis dans la profondeur de focalisation de l&#39;objectif du microscope. Cela comprend la cuticule, les muscles de la paroi du corps, et leurs NMJs. Trachée sur la face ventrale de l&#39;animal et éventuellement des parties du tube digestif peuvent également être imagés. L&#39;animal peut également être positionné avec sa face dorsale vers la lamelle couvre-objet pour une imagerie à court terme de structures proches de la surface dorsale. La capacité de structures d&#39;image de profondeur à l&#39;intérieur de l&#39;animal est limitée par la distance de travail de l&#39;objectif de microscope utilisé. Des structures telles que imdisques aginal sont inaccessibles à fort grossissement (par exemple 40X) objectifs. Les puces de larve décrites dans ce protocole sont conçus pour les larves au début 3 ème étape larvaire (allant de la taille de 3,5 à 4 mm). Cependant de nombreuses questions intéressantes nécessitent imagerie à différents stades larvaires. Des puces plus petites pour accueillir 2 larves de deuxième stade, ou plus grandes, pour accueillir fin 3 e stades peuvent être facilement conçus selon le même principe. (Figure supplémentaire 1 contient un fichier DXF facilement modifiables pour la fabrication de moules en silicone avec des tailles de chambre altérées). Le principe simple de la joint réversible pourrait même être appliquée à d&#39;autres organismes tels que C. elegans ou le poisson-zèbre, avec la variante principale étant la taille de la chambre. Une orientation future utile est de concevoir une puce qui peut immobiliser de nombreux animaux à la fois, d&#39;utiliser à des fins de dépistage. Toutefois, pour cela, la conception devrait être significativement différentde l&#39;appareil actuel, où les questions de positionnement de l&#39;animal dans la puce doit être traitée pour chaque animal de façon indépendante. L&#39;essai d&#39;écrasement du nerf pour étudier les réponses des blessures dans les nerfs périphériques larvaires: Le test par écrasement du nerf décrit ici pour les nerfs segmentaires larvaires est une méthode simple pour introduire une blessure à axones périphériques chez la drosophile. Avantages de cette méthode: a) il est simple à réaliser avec des outils standards trouvés dans un laboratoire de Drosophila (CO 2 de source et pince stéréoscopique), b) il peut être effectué rapidement pour de nombreux animaux, ce qui rend l&#39;analyse biochimique des cordons nerveux après une blessure réalisable 14, c) les réponses cellulaires et moléculaires à cette blessure sont hautement reproductibles 14,15,28 et peuvent être utilisés pour découvrir des procédés qui sont également importantes dans les neurones de vertébrés 29,30. D&#39;autres méthodes de blesser neurones est de focusa laser de forte puissance, par exemple un pulsé UV ou laser femtoseconde, de rompre un axone par microchirurgie au laser 17,31-33. La puce de larve est une méthode idéale pour positionner l&#39;animal à cette microchirurgie. Toutefois, en raison des différences mineures dans l&#39;optique entre les essais, décrits ci-dessus, la méthode basée sur le laser peut être plus difficile à reproduire dans les larves, en particulier dans les nerfs segmentaires larvaires. En outre, le laser à base de lésion axonale nécessite plus de temps pour positionner chaque animal, est par conséquent plus difficile à mener sur une grande échelle (avec un grand nombre d&#39;animaux). Dépannage: Le problème technique le plus couramment rencontré de la écrasement du nerf est mort de dommages aux organes internes. Lorsque la conduite de l&#39;écrasement, il est important de ne pas pincer le cordon ventral nerveux, les glandes salivaires, ou les intestins. Il est également important de ne pas percer la cuticule. Ces questions sont à éviter en mettant la pince à un angle de 45 ° par rapport à la surfac cuticulee (voir la figure 3). La qualité de la pince a un grand impact sur l&#39;efficacité de l&#39;écrasement et la survie après. Nous vous recommandons nombre Dumostar 5 forceps. Pour conserver leur netteté, les pinces doivent être manipulés avec soin, pas utilisées à d&#39;autres fins, et remplacés une fois qu&#39;ils deviennent émoussée ou tordue. La taille de l&#39;animal peut également influer sur l&#39;efficacité de l&#39;écrasement. Les petits animaux (moins de 3 mm de longueur) sont beaucoup moins susceptibles de survivre à la blessure. Avec de grands animaux, (errant 3 e stades), il est plus difficile de repérer les nerfs et éviter d&#39;endommager les grandes glandes salivaires et les intestins, et il ya moins de temps pour étudier les réponses des blessures avant la nymphose. L&#39;écrasement du nerf est le plus efficacement réalisée au début du stade larvaire 3 rd (qui sont ~ 3 à 4,5 mm de longueur le long de l&#39;axe antéro-postérieur). La source de nourriture que l&#39;animal est relevée sur pourrait influer sur l&#39;force de la cuticule et la survie après la cohue. Il est recommandé d&#39;élever des animaux dans les aliments fabriqués à partir d&#39;une recette standard levure-glucose. La meilleure méthode pour apprendre à faire la cohue est effectivement de pratiquer de nombreux animaux, d&#39;abord avec l&#39;objectif principal de la réalisation de survie (et pas la nymphose) 24 heures après l&#39;écrasement. Les débutants ont normalement un faible taux de survie (par exemple 10%), mais une fois la technique apprise, les taux de survie peut atteindre ~ 90%. D&#39;autres questions et orientations futures: L&#39;essai d&#39;écrasement fournit une méthode puissante pour étudier la germination de l&#39;axone proximal au site de la lésion et la dégénérescence des axones et des synapses distales au site de la lésion. Bien que les taux de dégénérescence varie entre les différents types de neurones différents, ils sont hautement reproductibles pour un type de neurone donné, en fournissant témoigne de la reproductibilité de l&#39;analyse de dommage. En revanche, la &quot;régénération&quot; bourgeonnementréponse observée dans les axones proximaux est plus difficile à étudier. Tous les axones dans le nerf segmentaire lancer une vaste germination à proximité du site de lésion (par exemple, voir la figure 6 et figure 3). Toutefois, la mesure de la germination peut varier entre les neurones, et est difficile à quantifier. Un degré similaire et de la variabilité dans la germination peuvent être observées après des lésions focales plus de motoneurones simples dans les nerfs segmentaires introduites en utilisant un UV laser à colorant pulsé. Nous interprétons que la directionnalité nondiscriminate de la germination est due à l&#39;absence de signaux de guidage dans les nerfs segmentaires. En revanche, les axones des neurones sensoriels blessés par laser à proximité de leurs corps cellulaires sont soumis à une nouvelle croissance axonale dans la même direction que l&#39;axone perdu 34. Axones dans cette région de l&#39;animal sont probablement exposés à des informations de position plus précise l&#39;orientation des axones. L&#39;environnement dans les nerfs segmentaires est peu probable d&#39;avoir beaucoup resemblanCE pour l&#39;environnement que les axones origine navigué au cours de leur orientation dans l&#39;embryon, donc on ne s&#39;attend pas à avoir des informations pour guider axones. Une autre limite de l&#39;étude de la régénération en utilisant l&#39;analyse par écrasement du nerf segmentaire est que les axones sensoriels et motoneurones blessés ont encore une grande distance à couvrir (0,25-1 mm) pour atteindre leur cible, et un laps de temps limité (&lt;3 jours) avant les subit animales nymphose. Une étude récente a identifié une manipulation génétique du récepteur de l&#39;hormone prothoraciotropic qui triple la durée de la 3 e stade larvaire 35. Cette manipulation permettra de prolonger la période de temps pour étudier la récupération et la dégénérescence des neurones après un traumatisme important, à 9 au lieu de 3 jours. Cela peut être assez longue pour observer de nouveaux événements, tels que la reconnexion d&#39;un axone blessé avec sa cible post-synaptique, en particulier si la lésion est induite près de la fin synaptique.

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été utilisé comme un organisme modèle pour plus de 100 ans, et a prouvé contribué à définir la signalisation fondamentale et voies de développement qui sont conservées des invertébrés à l&#39;homme. Imagerie en temps réel est une approche importante pour l&#39;étude des mécanismes cellulaires, et le plan de corps simple et cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un système attrayant pour l&#39;imagerie en temps réel, d&#39;autant plus qu&#39;il existe de nombreux outils génétiques disponibles pour l&#39;expression de protéines par fluorescence marqués dans des types cellulaires spécifiques. Un défi important pour les techniques d&#39;imagerie en direct est d&#39;immobiliser de façon non invasive et positionner un animal pour la microscopie. Méthodes d&#39;immobilisation classiques comprennent 1,2 dissection ou l&#39;utilisation de chloroforme, qui tous deux tuer l&#39;animal. Les anesthésiques de l&#39;éther 4 isofluorane et 5-8 ont également été utilisés. Alors que les anesthésiques offrent de nombreux avantages, Ils inhibent également l&#39;activité neuronale et la physiologie importante (y compris les battements du cœur) 9-11, peuvent donc affecter le processus étudié et créer un stress sur l&#39;animal. Il ya aussi des problèmes de sécurité des personnes pour travailler avec de l&#39;éther et isofluorane. Nous avons développé une méthode sans drogue pour immobiliser larves de drosophile dans un dispositif microfluidique couche de PDMS unique, que nous appelons la «puce de larve» 12. Ce protocole décrit comment obtenir ou de faire la puce de larve, et comment l&#39;utiliser pour l&#39;imagerie en direct en début de scène stade larvaire 3 ème. La puce est composée d&#39;une microchambre de formes complémentaires, qui, lors de l&#39;application d&#39;un vide par l&#39;intermédiaire d&#39;une seringue, immobilise l&#39;animal par l&#39;intermédiaire d&#39;une force mécanique douce. La méthode d&#39;immobilisation apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et muscles de la paroi du corps, à proximité de la lamelle de verre. Cela permet d&#39;imagerie à haute résolution de ces structures avec aper numérique hauteture (fort grossissement) objectifs. Les avantages de la puce de larve par rapport aux autres techniques classiques comprennent les suivantes: (i) l&#39;utilisation de la puce de larve remplace l&#39;utilisation de produits chimiques, ce qui permet pour l&#39;imagerie in vivo d&#39;animaux non anesthésiés. (Ii) Les larves de récupérer immédiatement après la sortie de la puce (par opposition à une période de récupération de 2 heures pour isofluorane 8,13). Cela permet pour l&#39;imagerie sur des échelles de temps larges, allant de millisecondes à quelques minutes, des heures et des jours. (Iii) L&#39;utilisation de PDMS, qui est un matériau perméable aux gaz, permet de diffusion en continu d&#39;oxygène / air provenant de l&#39;environnement dans le corps de chenille. (Iv) La puce est sûr et facile à utiliser, et (v) il est réutilisable et peut être fabriqué à un coût minime. En plus des instructions pour l&#39;utilisation de la puce de larve, ce protocole fournira plusieurs exemples de son utilisation pour étudier les événements neuronaux dans 3 ème stade larvaire. Il s&#39;agit notamment de l&#39;imagerie en direct de Axonal le transport, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps. Une autre application de la puce est d&#39;étudier les réponses neuronales à des lésions axonales. Pour cette une procédure supplémentaire est décrit (en partie 3) pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire. Ce test simple peut être réalisée à la fois rapidement et de façon reproductible sous un stéréomicroscope à dissection standard, ce qui permet un grand nombre d&#39;animaux devant être traités en même temps. Réponses cellulaires à la blessure peuvent être étudiés par imagerie en temps réel dans la puce de la larve.

<table><tbody><tr><td>Tube en polyéthylène de 0,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Tube en polyéthylène, D.E. = 0,023 po de diamètre extérieur = 0,038 po</td></tr><tr><td>Tube en polyuréthane de 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>Tube en polyuréthane, D.E. = 0,063 po de diamètre extérieur = 0,125 po</td></tr><tr><td>Connecteur de barbelé à cannelé</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>Connecteur de 0,8 mm de barbelé à cannelé</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>Valve à visser pour seringue</td></tr><tr><td>Seringue (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Seringue à visser de 20 ml pour le vide générateur</td></tr><tr><td>Aiguilles de distribution, 23 G (0,4 mm de diamètre intérieur, 0,6 mm de diamètre extérieur)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Aiguille pour raccord de sortie</td></tr><tr><td>Aiguilles de distribution, 21 G, (0,6 mm de diamètre intérieur, 0,8 mm de diamètre extérieur)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Aiguille pour raccordement de sortie</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbure</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Huile d’halocarbure 700</td></tr><tr><td>Dumostar Numéro 5 Pince</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>Pour l’écrasement des nerfs</td></tr><tr><td>Kit PDMS (Base et agent de durcissement)</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit</td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td> transparent <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (épaisseur selon la recommandation pour votre objectif de microscope)</td></tr><tr><td>Gobelet en plastique jetable (9 oz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Bâtonnet <td></td><td></td><td></td><td>d’agitateur à café en plastique</td></tr><tr><td>Lame de</td><td></td><td></td><td></td>rasoir</tr><tr><td>Plaques</td><td></td><td></td> <td>d’agar au jus de raisinVoir <a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a> pour la recette</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; drosophila</em&gt; larves

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Imagerie en temps réel est une technique importante pour l&#39;étude des processus biologiques cellulaires, mais cela peut être difficile d&#39;animaux vivants. La cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un organisme modèle attrayant pour les études d&#39;imagerie en direct. Cependant, un défi important pour les techniques d&#39;imagerie en direct est d&#39;immobiliser de façon non invasive et positionner un animal sur le microscope. Ce protocole présente une méthode simple et facile à utiliser pour immobiliser et imagerie larves de drosophile sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) de dispositif microfluidique, que nous appelons la «puce de larve. La puce de larve est constitué d&#39;un PDMS microchambre de bien ajusté qui est fixée à une lamelle de verre mince, qui, lors de l&#39;application d&#39;un vide par l&#39;intermédiaire d&#39;une seringue, immobilise l&#39;animal et apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et le corps muscles de la paroi, à proximité de la lamelle. Cela permet d&#39;imagerie à haute résolution, et, surtout, évite l&#39;utilisation d&#39;anesthetics et des produits chimiques, ce qui facilite l&#39;étude d&#39;un grand nombre de processus physiologiques. Etant donné que les larves de récupérer facilement l&#39;immobilisation, ils peuvent être facilement soumises à de multiples sessions d&#39;imagerie. Cela permet des études longitudinales plus de cours à temps allant de quelques heures à quelques jours. Ce protocole décrit étape par étape comment préparer la puce et la façon d&#39;utiliser la puce pour l&#39;imagerie en direct d&#39;événements neuronaux dans 3 ème stade larvaire. Ces événements comprennent le transport rapide des organites dans les axones, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps. Une autre application de la puce est d&#39;étudier et de régénération des réponses dégénératives à des lésions axonales, de sorte que la seconde partie de ce protocole décrit une procédure nouvelle et simple pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire.

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l&#39;imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d&#39;utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l&#39;imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'immobiliser de manière non invasive des larves de drosophile pour l'imagerie en direct à l'aide d'une chambre microfluidique modifiée. Une larve de troisième stade prépupal est positionnée dans la puce avec un peu d'huile afin d'aider à sceller la larve. Ensuite, la puce est placée au-dessus de la larve de sorte que son corps s'insère dans la chambre.La puce est reliée à une seringue afin qu'un vide puisse être appliqué. La mobilité des larves est alors restreinte, et les structures situées dans la partie ventrale de l'animal sont rapprochées du lamelle. À l'aide d'un microscope confocal, les structures sont facilement observées, comme les détails des terminaisons axonales des neurones sensoriels, ainsi que la régénération des nerfs segmentaires après un dommage nerveux induit.Autres méthodes permettant d'immobiliser des larves pour l'imagerie en direct, utilisation de grandes quantités de chloroforme, d'éther ou d'anesthésiques ISO. Le principal avantage de cette technique est qu'elle évite l'utilisation de ces toxines, qui interfèrent avec la physiologie de l'animal. Un bénéfice supplémentaire lié à l'absence de toxines est que la larve reste saine et sécuritaire à manipuler. L'immobilisation robuste permet l'imagerie d'événements rapides, tels que le transport axonal rapide et les variations du calcium intracellulaire.Une larve unique peut être immobilisée et imagée plusieurs fois dans la puce. Cela permet des suivis temporels. L'imagerie de processus qui se déroulent sur une période allant jusqu'à 72 heures commence par l'obtention d'un échantillon de puce en PDMS pour tester ce protocole.Les instructions pour fabriquer une puce A-P-D-M-S à partir d'un moule en SU-huit peuvent être consultées dans le protocole textuel en utilisant une aiguille de distribution de calibre 21. Percez un trou dans le port de vide de la puce en PDMS destinée à un microscope inversé. Retirez une aiguille de calibre 23 de sa base en tournant légèrement pour débloquer l'embase.Insérez ensuite la pointe de l'aiguille dans un petit morceau de tube en polyéthylène de manière à ce que le tube recouvre au moins un millimètre de l'aiguille. Utilisez une lame de rasoir pour couper l'excès de tube. Cela laisse un anneau en plastique qui peut former un joint étanche.Insérez la pointe de l'aiguille de 23 gauge dans le trou du port sous vide. Pour un microscope droit, percez un deuxième trou sur le côté de la puce en PDMS à l'aide d'une aiguille de distribution de 21 gauge. Ce trou permettra d'accéder au premier trou depuis le côté.Insérez ensuite la pointe de l'aiguille de calibre 23 et l'anneau de tubulure dans le trou latéral. Placez un morceau de ruban adhésif double face sur le dessus de la puce en PDMS afin de boucher le trou supérieur. Reliez un morceau de tubulure en polyéthylène d'une longueur de 20 centimètres entre la pointe de l'aiguille insérée dans le port sous vide de la puce et l'un des ports d'un robinet à trois voies.Ensuite, fixer une seringue de 20 millilitres à l'un des deux orifices restants du robinet, en laissant le dernier orifice ouvert. Nettoyer la puce en PDMS avec du ruban adhésif transparent. Fixer un morceau de ruban sur la face inférieure de la puce.Veillez à ce que le ruban adhésif touche toute la surface en PDMS, puis retirez le ruban. Répétez cette méthode de nettoyage trois fois. Étant donné que la puce en PDMS est réutilisable, il est très important d'éliminer tout résidu d'huile, car celui-ci peut affecter l'adhérence du PDMS au verre lors du transfert précoce de l'approvisionnement.Larves de troisième stade transférées du milieu de culture vers une boîte de Pétri contenant de l'eau. Elles doivent mesurer entre 3,5 et 4 millimètres de longueur pour s'ajuster correctement à la puce. Rincer les larves afin d'éliminer le milieu de culture.Ensuite, appliquez une petite goutte d’huile halo carbone 700 au centre d’un lamelle en verre. À l’aide de pinces, saisissez délicatement une larve lavée. Placez-la brièvement sur un essuie-tout léger pour l’assécher, puis transférez-la dans l’huile pendant 10 secondes. La goutte doit être suffisamment petite pour que les trachées de la larve ne soient pas recouvertes.Placez ensuite brièvement les larves sur une lame de verre propre, puis transférez-les sur une autre lame. Cette manipulation permet d'éliminer un peu plus d'huile. Veillez à l'orientation des larves afin d'observer la corde nerveuse et les nerfs segmentaires.Le côté ventral doit être orienté vers le bas. Les tubes trachéens facilement identifiables doivent être orientés vers le haut. Placez maintenant délicatement la puce en PDMS sur les larves.Alignez les larves au centre de la microchambre. Avec son extrémité postérieure orientée vers l'orifice du vide, la larve ne doit pas toucher les bords de la chambre. Une fois alignée, appuyez doucement sur la puce en PDMS contre la lame de verre pour obtenir un bon scellement.Ensuite, vérifiez attentivement que la larve est entièrement enfermée dans la microchambre. Puis, commutez le robinet à trois voies vers la seringue. Maintenez fermement l'assemblage en PDMS et tirez lentement le piston de la seringue pour extraire deux à 2,5 millimètres d'air, jusqu'à ce qu'une résistance soit ressentie.Ainsi, créez un vide. Ensuite, fermez le robinet. Pour maintenir le vide correctement, vérifiez attentivement les larves.Le corps doit être immobilisé à l'intérieur de la microchambre, et la trachée doit être visible. Le reste de la puce en PDMS doit être en contact avec la lame couvre-objet. Des orientations de ce type ne sont pas correctes. À présent, imagez les larves.Si l'on utilise un microscope droit, fixer le côté supérieur de la puce sur la platine à l'aide d'un ruban adhésif double face. Une fois l'acquisition d'images terminée, relâcher le vide. Puis détacher la puce en PDMS du coverslip.La larve doit être immédiatement motile lorsqu'elle est manipulée avec une pince. Replacer les larves sur une plaque d'agar au jus de raisin pour la récupération. Placer une seule larve anesthésiée sur une plaque d'agar au jus de raisin.Sous le microscope stéréo, placer l'animal avec la face ventrale vers le haut. Pour visualiser le cordon nerveux ventral et les nerfs segmentaires, s'assurer que la larve est complètement immobile. Localiser le cordon nerveux et les glandes salivaires.Il est important de ne pas endommager ces structures. Localisez l'extrémité du troisième segment abdominal. Une lésion à cet endroit endommage le plus de nerfs et est la plus facile à reproduire sans tuer l'animal.La lésion peut également être réalisée sur des segments plus postérieurs à l’aide d’une pince duo star numéro cinq. Pincer fermement les nerfs segmentaires à travers la cuticule pendant cinq à dix secondes. Lorsque l’opération est effectuée correctement, la cuticule reste intacte et la paroi corporelle n’est pas perforée.La maîtrise nécessitera de la pratique après la lésion, une fois l'animal placé en position ventrale vers le bas sur la grande plaque. Il devrait être capable de bouger la tête et de s'alimenter. Si la lésion a été réussie, la moitié postérieure des larves sera paralysée.La puce à larve a été utilisée pour imager le transport médié par la kinésine des vésicules synaptiques au sein d'axones périphériques individuels. Le mouvement antérograde de ces vésicules a été mesuré à environ 1,0 micromètre par seconde. Le mouvement rétrograde a été établi à 0,8 micromètre par seconde.La technique d'immobilisation a été utilisée pour la microchirurgie au laser à l'aide d'un laser à colorant UV pulsé. Les niveaux de calcium ont été observés dans des neurones spécifiques grâce à un indicateur génétiquement codé. G camp 3.0 permet de détecter un pic de calcium après un neurone sensoriel.La dendrite est sectionnée. Permettre à l'animal de se reposer entre les séances d'imagerie permet d'observer les événements cellulaires dans le temps. Après broyage des axones des motoneurones émergents, le moignon axonal proximal a subi une nouvelle ramification.Entre-temps, les axones distaux formaient des varicosités et se fragmentaient par le processus de dégénérescence wallérienne. L'utilisation de la puce pour larves permet également le suivi in vivo des protéines fluorescentes dont la photoconversion a été induite. Une protéine de fusion DRA deux alpha tubuline exprimée dans les neurones sensoriels de classe quatre a été photoconvertie au niveau des corps cellulaires.En deux jours, une quantité importante de protéine photoconvertie a été déplacée vers les terminaisons axonales des neurones sensoriels, à environ un millimètre de l'emplacement d'origine dans le corps cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la puce à larves pour l'imagerie en direct de larves de drosophile et comment réaliser une lésion par écrasement du nerf. Une fois ces techniques maîtrisées, les larves peuvent être positionnées sur le microscope en quelques minutes seulement.L'écrasement du nerf est tout aussi rapide. Par conséquent, ces procédures peuvent être utilisées pour des expériences à grande échelle, telles que les études génétiques. La puce peut être utilisée pour imager des structures situées sur le côté ventral des larves de drosophile.Ces structures incluent, entre autres, les muscles, les synapses des jonctions neuromusculaires, les neurones sensoriels, les nerfs périphériques et le cordon nerveux ventral. Cette procédure peut également être utilisée pour réaliser un imagerie en direct du cœur larvaire, des glandes salivaires et de la trachée. La puce à larve utilisée dans cette vidéo est dimensionnée pour des animaux mesurant entre 3,5 et quatre millimètres de longueur.Pour l'imagerie d'animaux plus petits ou plus grands, il est facile de fabriquer une puce avec une chambre plus petite ou plus grande. Consultez le fichier de conception supplémentaire et les instructions pour la fabrication de puces en PDMS. Les instructions pour la fabrication des puces en PDMS sont incluses dans le protocole écrit.Nous pouvons vous envoyer une puce d'échantillon si vous nous contactez.

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