L'utilisation de puces microfluidiques pour l'imagerie en direct et l'étude des réponses blessures en Drosophila Larves
7 février 2014
Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.
L’objectif général de l’expérience suivante est d’immobiliser de manière non invasive des larves de drosophile pour l’imagerie en direct à l’aide d’une chambre microfluidique modifiée. Un tiers des larves étoilées est positionné dans la puce avec un peu d’huile pour aider à sceller les larves. Ensuite, la puce est placée sur le dessus des larves de sorte que son corps s’insère dans la chambre.
La puce est reliée à une seringue afin qu’un vide puisse être appliqué. La motilité des larves devient restreinte et les structures de la partie ventrale de l’animal sont poussées près de la lamelle. À l’aide d’un microscope confocal, les structures sont facilement imagées, telles que les détails des terminaisons axonales des neurones sensoriels et la régénération des nerfs segmentaires après une lésion nerveuse induite.
D’autres méthodes pour immobiliser josepha pour l’imagerie en direct, l’énorme éther de chloroforme ou les anesthésiques ISO. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évite l’énormité de ces toxines, qui interfèrent avec la physiologie de l’animal. Et l’avantage supplémentaire de l’absence de toxines est que la larve GB est sûre et avec laquelle travailler. L’immobilisation robuste permet l’imagerie d’événements rapides tels qu’un transport axonal plus rapide et des changements dans le calcium intracellulaire.
Une seule larve peut être immobilisée et imagée dans la puce plusieurs fois. Cela permet des vies temporelles. Imagerie des processus qui se déroulent sur une période allant jusqu’à 72 heures Commencez par obtenir un échantillon de puce PDMS pour tester ce protocole.
Les instructions sur la façon de fabriquer une puce A-P-D-M-S à partir d’un moule SU huit peuvent être lues dans le protocole texte à l’aide d’une aiguille de distribution de calibre 21. Percez un trou dans l’orifice d’aspiration de la puce PDMS pour un microscope inversé. Retirez une aiguille de calibre 23 de sa base, le moyeu de la serrure en quelques tours.
Insérez ensuite la pointe de l’aiguille dans un petit morceau de tube en polyéthylène de sorte que le tube recouvre au moins un millimètre de l’aiguille. Utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès de tube. Cela laisse un anneau en plastique qui peut faire un joint.
Insérez la pointe de l’aiguille de calibre 23 dans le trou de l’orifice d’aspiration. Pour un microscope vertical, percez un deuxième trou sur le côté de la puce PDMS avec une aiguille de distribution de calibre 21. Ce trou permettra d’accéder au premier trou par le côté.
Insérez ensuite la pointe de l’aiguille de calibre 23 et l’anneau de tube dans le trou latéral. Placez un morceau de ruban adhésif double face sur le dessus de la puce PDMS pour sceller le trou supérieur. Fixez un tube en polyéthylène de 20 centimètres de long entre la pointe de l’aiguille insérée dans l’orifice de vide de la puce et l’un des orifices d’une vanne à trois voies.
Fixez ensuite une seringue de 20 millilitres dans l’un des deux orifices restants de la vanne, en laissant le dernier orifice ouvert. Nettoyez la puce PDMS avec du ruban adhésif transparent. Fixez un morceau de ruban adhésif au bas de la puce.
Assurez-vous que le ruban touche toute la surface du PDMS, puis décollez-le. Répétez cette méthode de nettoyage trois fois. Étant donné que la puce PDMS est réutilisable, il est très important d’éliminer les résidus d’huile car ils peuvent affecter l’adhérence du PDM au transfert de verre à la recherche précoce de fourrage.
Larves du troisième stade de la nourriture à une boîte de Pétri contenant de l’eau. Il doit mesurer entre 3,5 et quatre millimètres de long pour s’adapter correctement à la puce. Baignez les larves pour enlever le milieu de culture.
Ensuite, joue une petite goutte d’huile halo carbon 700 au centre d’une lamelle en verre à l’aide d’une pince, ramassez doucement une larve lavée. Placez-le brièvement sur une lingette légère pour l’essuyer, puis déplacez-le dans l’huile pendant 10 secondes. La goutte doit être suffisamment petite pour que la trachée des larves ne soit pas revêtue.
Ensuite, placez brièvement les larves sur une lamelle en verre propre et déplacez-la sur une autre lamelle. Enlevant ainsi un peu plus d’huile. Faites attention à l’orientation des larves pour imager le cordon neural et les nerfs segmentaires.
La face ventrale doit être vers le bas. Les tubes trachéaux facilement identifiables doivent être vers le haut. Placez maintenant délicatement la puce PDMS sur les larves.
Alignez les larves au centre de la micro-chambre. Avec son postérieur orienté vers l’orifice de vide, la larve ne doit pas toucher les bords de la chambre. Une fois aligné, poussez la puce PDMS contre la lamelle de recouvrement en verre pour obtenir une bonne étanchéité.
Vérifiez ensuite que les larves sont entièrement enfermées dans la micro-chambre. Basculez maintenant la valve à trois voies sur la seringue. Tenez fermement l’assemblage PDMS et tirez sur le piston de la seringue pour prélever deux à 2,5 millimètres d’air jusqu’à ce qu’une résistance se fasse sentir.
Créant ainsi un vide. Fermez ensuite la vanne. Pour maintenir le vide avec soin, vérifiez les larves.
Son corps doit être immobilisé à l’intérieur de la micro-chambre et la trachée doit être visible. Le reste de la puce PDMS doit être en contact avec la lamelle de recouvrement De telles orientations ne sont pas correctes. Imaginez maintenant les larves.
Si vous utilisez un microscope vertical, fixez la face supérieure de la puce à la platine avec du ruban adhésif double face. Une fois l’imagerie terminée, relâchez le vide. Détachez ensuite la puce PDMS de la lamelle.
La larve doit être immédiatement mobile à l’aide d’une pince. Retournez les larves dans une plaque de gélose au jus de raisin pour la récupération. Placez une seule larve anesthésiée sur une plaque de gélose au jus de raisin.
Sous le stéréomicroscope, tournez le côté ventral de l’animal vers le haut. Pour visualiser le cordon nerveux ventral et les nerfs segmentaires, assurez-vous que la larve est complètement immobile. Localisez le cordon nerveux et les glandes salivaires.
Il est important de ne pas endommager ces structures. Localisez l’extrémité du troisième segment abdominal. Les blessures ici endommagent le plus de nerfs et sont les plus faciles à reproduire sans tuer l’animal.
La blessure peut également être menée dans des segments plus postérieurs à l’aide d’un duo étoile numéro cinq, forceps. Pincez fermement les nerfs segmentaires à travers la cuticule pendant cinq à 10 secondes. Lorsqu’elle est effectuée correctement, la cuticule reste intacte et la paroi du corps n’est pas percée.
La maîtrise demandera de la pratique après que la blessure ait placé l’animal face ventrale vers le bas sur la grande plaque. Il doit être capable de bouger la tête et de manger. Si la blessure a réussi, la moitié postérieure des larves sera paralysée.
La puce larvaire a été utilisée pour imager le transport des vésicules synaptiques médié par la kinésine dans les axones périphériques individuels. Le mouvement entérologique de ces vésicules a été mesuré à environ 1,0 micron par seconde. Le mouvement rétrograde a été chronométré à 0,8 micron par seconde.
La technique d’immobilisation a été utilisée pour la microchirurgie au laser à l’aide d’un laser à colorant UV pulsé. Des niveaux de calcium ont été observés dans des neurones spécifiques grâce à un indicateur génétiquement codé. G camp 3.0 un pic de calcium est détecté après un neurone sensoriel.
La dendrite est transectée. Permettre à l’animal de se reposer entre les séances d’imagerie permet de visualiser les événements cellulaires au fil du temps. Après avoir écrasé les axones des motoneurones émériques, le moignon axonal proximal a subi une nouvelle germination.
Pendant ce temps, les axones distaux formaient des varicosités et se fragmentaient par le processus de dégénérescence wallérienne. En utilisant le suivi de la puce larvaire, il est également possible de convertir des protéines fluorescentes in vivo. Une protéine de fusion de la tubuline alpha DRA deux exprimée dans les neurones sensoriels de classe quatre a été photoconvertie dans les corps cellulaires.
En l’espace de deux jours, une quantité importante de protéine photoconvertie a été relocalisée vers les terminaisons axonales des neurones sensoriels à environ un millimètre de l’emplacement d’origine dans le corps cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la puce des larves pour l’imagerie en direct des larves de drosophile et comment effectuer une blessure par écrasement nerveux. Une fois ces techniques maîtrisées, les larves peuvent être positionnées sur le microscope en quelques minutes seulement.
L’écrasement des nerfs est tout aussi rapide. Par conséquent, ces procédures peuvent être utilisées pour des expériences à grande échelle, telles que les degrés génétiques. La puce peut être utilisée pour imager les structures de la face ventrale des larves de drosophile.
Ceux-ci incluent, mais sans s’y limiter, les muscles, les synapses de jonction neuromusculaire, les neurones sensoriels, les nerfs périphériques et la moelle nerveuse ventrale. Cette procédure peut également être utilisée pour effectuer une imagerie en direct du cœur larvaire, des glandes salivaires et de la trachée. La puce de larve utilisée dans cette vidéo est de 3,5 à quatre millimètres de long.
Pour l’imagerie plus ou moins grande, il est facile de fabriquer des puces pour animaux avec une chambre plus petite ou plus grande. Voir le fichier de conception supplémentaire et les instructions pour la fabrication de puces PDMS. Les instructions pour fabriquer les puces PDMS sont incluses dans le protocole écrit.
Nous pouvons vous envoyer un échantillon de puce si vous nous contactez.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode permettant d'immobiliser de manière non invasive des larves de Drosophila pour l'imagerie en direct, en utilisant une chambre microfluidique modifiée. Cette technique permet d'observer des processus cellulaires au sein des neurones, en particulier dans le contexte du transport axonal et de la régénération nerveuse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Techniques d'imagerie en temps réel
Contexte
- Les larves de Drosophila constituent un modèle précieux pour l'étude des processus neuronaux en raison de leur transparence et de leur facilité de manipulation génétique.
- L'imagerie en direct permet d'obtenir des informations sur les événements cellulaires dynamiques en temps réel.
- Les méthodes traditionnelles d'immobilisation impliquent souvent des anesthésiques nocifs pouvant affecter la physiologie.
- Ce protocole vise à offrir une alternative plus sûre pour l'imagerie, sans substances toxiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode non invasive pour immobiliser les larves de Drosophila en vue de l'imagerie.
- Faciliter l'observation des structures et des processus neuronaux.
- Permettre des acquisitions d'images répétées sur la même larve pendant de longues périodes.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un dispositif microfluidique en PDMS pour immobiliser les larves.
- Application d'un vide pour restreindre la motilité larvaire.
- Imagerie à l'aide d'un microscope confocal pour visualiser les structures neuronales.
- Préparation détaillée de la puce en PDMS et positionnement des larves pour une imagerie optimale.
Résultats principaux
- Immobilisation réussie des larves sans utilisation d'anesthésiques toxiques.
- Imagerie claire des terminaisons axonales des neurones sensoriels et de la régénération des nerfs segmentaires.
- Capacité à réaliser une imagerie en laps de temps sur 72 heures.
- Démonstration du transport médié par la kinésine des vésicules synaptiques.
Conclusions
- La chambre microfluidique modifiée fournit une méthode sûre et efficace pour l'imagerie en direct de larves de Drosophila.
- Cette approche permet l'étude d'événements neuronaux rapides et des processus de récupération.
- Le protocole peut être adapté à diverses applications d'imagerie en recherche en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La fixation non invasive des organismes modèles permet une imagerie longitudinale de processus cellulaires dynamiques sans interférence de facteurs pharmacologiques, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques lors de la validation des cibles. La puce à larve facilite des séances d'imagerie répétées sur une période de 72 heures, permettant l'évaluation du transport axonal, des réponses aux lésions et de la régénération dans un système physiologiquement pertinent. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en préservant la biologie native durant l'observation de la dynamique neuronale.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la visualisation directe du transport axonal et de la signalisation calcique dans les neurones.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en permettant des imageries répétées du même larve pour évaluer l'engagement de la cible et la modulation de la voie au fil du temps.
- Valeur prédictive : Fournit des lectures quantitatives du trafic des organites et des réponses induites par les lésions, renforçant la confiance dans les cibles identifiées lors de la découverte en neurosciences.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des analyses en aval en immobilisant les larves afin d'obtenir un imaging cohérent et haute résolution des structures ventrales.
- Reproductibilité : Permet une préparation et un scellement standardisés des larves dans des microchambres en PDMS, réduisant ainsi la variabilité des essais d'imagerie en direct.
- Extensibilité : Facilite des cycles rapides d'immobilisation et d'imagerie, permettant une évaluation à débit moyen de perturbations génétiques ou pharmacologiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise les processus de lésion axonale et de régénération liés aux mécanismes des maladies neurodégénératives.
- Continuité translationnelle : Associe l'imagerie de découverte à la validation préclinique en permettant des études en temps réel de la dégénérescence wallérienne et de l'élaboration de collatérales axonales.
- Progrès ajusté au risque : Permet de prendre des décisions d'orientation (go/no-go) en quantifiant les réponses régénératives par rapport aux réponses dégénératives suite à une lésion par écrasement du nerf.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La puce à larves s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en permettant l'imagerie en direct de processus neuronaux avant l'identification du composé candidat, soutenant ainsi la vérification d'hypothèses et la clarification des voies dans les modèles basés sur Drosophila.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses grâce à l'imagerie directe du transport vésiculaire médié par la kinésine et des flux calciques dans les neurones sensoriels.
- Essais de criblage : Assure la disponibilité des tests grâce à une immobilisation reproductible et une proximité constante du côté ventral avec la lame pour une imagerie fiable.
- Analytique : Permet la mesure quantitative des vitesses de transport axonal (1,0 µm/s en direction antérograde, 0,8 µm/s en direction rétrograde) et la détection des pics calciques à l’aide d’indicateurs génétiquement codés.
- Recherche translationnelle : S’inscrit dans les travaux précliniques en modélisant les réponses aux lésions axonales, notamment le bourgeonnement et la fragmentation, sur des périodes prolongées.
- Réutilisation en milieu professionnel : Présente la puce microfluidique en PDMS comme une plateforme réutilisable pour des études longitudinales menées lors de plusieurs séances expérimentales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en permettant l'observation d'événements neuronaux rapides sans perturbation physiologique induite par l'anesthésie.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une préparation normalisée des puces, à une immobilisation par vide et à des protocoles de nettoyage empêchant les interférences dues aux résidus d'huile.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant la réutilisation d'un même larve, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour des études longitudinales.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque grâce à une imagerie quantifiable des paramètres de dégénérescence et de régénération après une lésion.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de dispositifs microfluidiques, le fonctionnement des systèmes sous vide et la microscopie confocale pour une imagerie optimale.
- Dépend de l'accès à des outils de moulage en PDMS, des ports sous vide à base de seringues et des tubulures en polyéthylène pour l'étanchéité et les connexions fluidiques.
- Implique une standardisation interéquipes de la préparation des larves, de l'application d'huile et de l'alignement de la chambre afin d'assurer une immobilisation constante.
- Suppose des adaptations selon la taille des larves, nécessitant des ajustements des dimensions de la puce en fonction de la longueur corporelle (3,5 à 4 mm pour la puce standard).
- Comprend des limites pratiques telles que l'obligation d'éviter le recouvrement d'huile sur les trachées et de garantir une orientation correcte côté ventral pour visualiser la corde nerveuse.
