L'isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cardiomyocytes viables à partir de prélèvements ventriculaires humains pathologiques et de caractériser leurs altérations fonctionnelles. Cela est réalisé en collectant et en hachant rapidement des échantillons ventriculaires frais dans une solution cardioplégique glacée afin d'éviter une dégradation excessive du tissu et des lésions cellulaires. La deuxième étape consiste à effectuer une digestion progressive des fragments myocardiques à l'aide d'un dispositif de digestion sur mesure et de solutions enzymatiques.

Sur six cycles, la cellule contenant le tampon est prélevée dans un tube à chaque cycle et diluée avec une solution de préservation cellulaire. La dernière étape consiste à resuspendre les cellules contenues dans les six tubes dans un volume réduit de solution physiologique standard contenant des concentrations normales de calcium afin d'effectuer la caractérisation fonctionnelle. Enfin, l'enregistrement en mode « patch clamp » des potentiels d'action combiné à l'évaluation simultanée du calcium intracellulaire à l'aide de colorants fluorescents permet de mettre en évidence les modifications de l'action, de la durée du potentiel et du cycle du calcium intracellulaire dans les cardiomyocytes de patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique.

L'avantage principal de la méthode DYS unique par rapport à une méthode 16, comme la méthode standard de rejet par fragments, réside dans le fait que, en association avec une solution enzymatique, nous utilisons un dispositif de digestion sur mesure qui permet une dissociation conjointe des cytes variables grâce à ses grattoirs en silicium. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cardiologie, telles que la manière dont le remodelage moléculaire et structural bien connu associé aux maladies cardiaques se traduit par des altérations au niveau des cardiomyocytes individuels, altérations pouvant être analysées par notre méthode et ciblées par des médicaments spécifiques. Ainsi, les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des maladies cardiaques génétiques telles que la cardiomyopathie hypertrophique.

En effet, cette méthode peut être utilisée pour tester de nouvelles approches neuro-pathiques sur des cardiomyocytes ventriculaires provenant de patients atteints de maladies cardiaques hypertrophiques ou ischémiques ayant subi une chirurgie cardiaque. Nous avons eu l'idée de cette méthode en comparant l'analogie entre des prélèvements d'artère humaine et des biopsies ventriculaires obtenues pendant une chirurgie cardiaque. Commencez cette procédure en versant 40 millilitres de solution cardioplégique dans un tube de 50 millilitres et conservez-la sur de la glace pour le transport rapide du prélèvement de la salle d'opération jusqu'au laboratoire d'isolement cellulaire ; transférez rapidement le prélèvement vers le laboratoire et commencez le traitement du prélèvement dans les 10 minutes suivant son excision.

Prélèver ensuite un échantillon collectif de myocarde ventriculaire de la salle d'opération immédiatement après l'exérèse. Laver l'échantillon avec une solution CP glacée et le conserver dans un tube en maintenant l'échantillon dans un tampon CP glacé. Retirer soigneusement la couche fibrotique endocardique à l'aide de ciseaux fins par la suite.

Coupez le tissu myocardique en petits morceaux de deux à trois millimètres de longueur, avec une quantité totale de myocarde ventriculaire comprise entre 100 milligrammes et un gramme pour chaque isolement. Après avoir transféré les morceaux dans la chambre de raclage du dispositif de digestion, remplacez le tampon CP dans la chambre par un tampon de dissociation froid sans calcium. Ensuite, placez le dispositif de digestion dans un bain thermostaté.

Régler le bain à 37,5 degrés Celsius et l’allumer. Ensuite, allumer le moteur du dispositif de digestion et régler la vitesse de rotation à une révolution par seconde. Effectuer trois cycles de lavage avec le DB et remplacer la solution dans la chambre par du DB propre saturé en oxygène à 37 degrés Celsius toutes les huit minutes.

Ensuite, préparez le tampon enzymatique un en ajoutant 250 unités par millilitre de collagénase de type cinq et quatre unités par millilitre de protéase. Type 24 à la solution DB. Préparez ensuite le tampon enzymatique deux en ajoutant 250 unités par millilitre de collagénase.

Introduisez cinq dans la solution DB pour oxygéner EB un, puis réchauffez-la à 37 degrés Celsius. Effectuez ensuite deux cycles de 12 minutes de digestion dans l'appareil de digestion rotatif avec trois millilitres de EB un oxygéné à 100 % à 37 degrés Celsius. Retirez la solution par aspiration à la pipette et jetez-la après chaque cycle.

Ensuite, préparez six tubes de 15 millilitres pour la collecte des cellules et 80 millilitres de solution de bière fraîche à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les tampons oxygénés EB deux et portez-la à 37 degrés Celsius. Par la suite, effectuez un premier cycle de digestion de 15 minutes avec trois millilitres de EB deux entièrement oxygénée à 37 degrés Celsius. Après le cycle de digestion, récupérez la solution contenant les myocytes associés en premier dans un tube de 15 millilitres et diluez la suspension cellulaire avec 12 millilitres de solution KB froide.

Conserver le tube à plat à température ambiante, effectuer cinq autres cycles de digestion de 12 minutes avec trois millilitres de tampon EB deux à 37 degrés Celsius et recueillir le tampon contenant les myocytes à chaque cycle dans un tube conique de 15 millilitres. Penser également à diluer le tampon recueilli de trois millilitres avec 12 millilitres de solution KB à chaque cycle. À la fin, conserver les six tubes contenant les cellules à température ambiante.

Dans cette étape, ajouter un milligramme par millilitre d'albumine sérique bovine à 20 millilitres de tampon tyro dépourvu de calcium. Ensuite, filtrer la solution puis centrifuger les six tubes coniques contenant des myocytes à 100 ×g pendant cinq minutes. Pour forcer les myocytes à se déposer, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans chaque tube avec une quantité variable de TB contenant de l'albumine sérique bovine à température ambiante.

Augmentez progressivement la concentration en calcium dans la solution tampon contenue dans la cellule en ajoutant de petites quantités de solution de chlorure de calcium à 100 millimolaire par litre lors des première et deuxième étapes. La concentration en calcium est portée respectivement à 50 micromoles par litre et à 100 micromoles par litre. Les ajouts suivants de calcium sont effectués toutes les cinq minutes, et la concentration est augmentée de 100 micromolaire par litre à chaque étape, jusqu'à une concentration finale de 0,9 millimolaire par litre.

Pour évaluer le rendement de la procédure d'isolement, transférez 0,5 millilitre de solution contenant des myocytes dans la chambre à fond en verre d'un microscope. Examinez 15 champs microscopiques avec un objectif de 10 x et calculez le pourcentage de myocytes sains, tels que les cellules en forme de bâtonnet présentant des stries nettes et aucune inclusion significative. Les rendements attendus doivent être d'environ 20 % pour démontrer l'évaluation fonctionnelle des cardiomyocytes humains, incluant l'enregistrement simultané des potentiels d'action et des flux de calcium intracellulaire.

Préparez d'abord la solution pour pipette destinée aux expériences de patch clamp en configuration de patch perforé. Ajoutez ensuite 1,8 millimolaire de chlorure de calcium dans un tampon sans calcium. Utilisez cette solution pour la perfusion superficielle des cardiomyocytes durant les expériences de fluorescence en patch clamp.

Ensuite, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 10 micromolaire par litre de flu fort et 10 microlitres de power load. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante en position horizontale. Par la suite, placez le tube en position verticale et laissez les cellules se déposer pendant cinq minutes.

Ensuite, pipetez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un tampon contenant du calcium. Transférez 0,25 millilitre de suspension cellulaire dans une petite chambre d’enregistrement montée sur microscope et thermostatée. Superfusion par gravité à l’aide d’un système microfraise chauffé, avec un débit de 0,3 millilitre par minute à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’un tireur de micropipettes, préparez des pipettes pour enregistrement en configuration patch ayant un diamètre d’extrémité de trois à cinq micromètres et une résistance de trois à 4,5 mégohms lorsqu’elles sont remplies avec du PS. Ensuite, ajoutez de l’amphotéricine B au PS à raison de 250 microgrammes par millilitre et utilisez ce mélange pour remplir les électrodes, puis fixez l’électrode sur le support de pipette. Ensuite, sélectionnez une cellule de forme Ron présentant des stries nettes et dépourvue d’inclusions.

Former le scellement giga et attendre cinq à dix minutes jusqu'à ce que la résistance d'accès chute en dessous de 20 ohms. Ensuite, induire des potentiels d'action en mode courant bloqué à l'aide d'impulsions brèves à différentes fréquences de stimulation. Pendant la phase d'enregistrement, activer l'éclairage en champ clair à 492 nanomètres et détecter la fluorescence de Fluor fort entre 505 et 520 nanomètres.

Ensuite, enregistrez les signaux de fluorescence et de potentiel membranaire. Cette figure montre les modifications des potentiels d'action dans les cardiomyocytes ventriculaires provenant des échantillons de MCH. Voici les potentiels d'action superposés représentatifs obtenus à 0,2 hertz, 0,5 hertz et 1 hertz à partir d'un myocyte témoin et d'un myocyte MCH.

Les potentiels d'action superposés à 0,5 hertz provenant d'un myocyte témoin. En l'absence et en présence d'isoprénaline à 10⁻⁷ molaire, sont illustrés ici, ainsi que l'enregistrement représentatif du potentiel membranaire d'un cardiomyocyte provenant d'un patient atteint de MCH, qui présentait plusieurs dépolarisations spontanées, appelées dépolarisations post-dépolarisation. La figure montre les modifications du transitoire calcique dans les cardiomyocytes ventriculaires provenant des échantillons de MCH.

Voici les transitoires calciques superposés représentatifs induits par une stimulation à 0,2 hertz via la pipette de patch-clamp dans un myocyte témoin et une cellule HCM. Les cinétiques des transitoires calciques dans les cardiomyocytes HCM et témoins à différents moments sont présentées, ainsi que des tracés longs représentatifs montrant le calcium intracellulaire pendant une stimulation à trois fréquences différentes, mettant en évidence l'augmentation du calcium diastolique à des fréquences d'excitation élevées dans le myocyte HCM. Cette figure illustre des applications expérimentales supplémentaires utilisant des myocytes ventriculaires humains.

Les tracés superposés représentatifs montrant le courant calcique de type L enregistré à différents potentiels membranaires sont présentés à gauche, et la densité moyenne du courant calcique de type L, issue de 18 cellules isolées d'échantillons de cardiomyopathie hypertrophique (HCM) à différents potentiels membranaires, est affichée à droite ; on observe ici le tracé du calcium intracellulaire enregistré à partir d'un myocyte ventriculaire lors d'une stimulation électrique par champ à un hertz. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer rapidement après la collecte de l'échantillon en salle d'opération afin de garantir la réussite de l'isolement de cardiomyocytes ventriculaires humains. D'autres méthodes peuvent être mises en œuvre, telles que la microscopie confocale en mode vie ou l'immunochimie, ce qui sera essentiel pour répondre à des questions fondamentales, par exemple, sur la manière dont la localisation subcellulaire des structures membranaires et des unités de libération du calcium est altérée dans les maladies cardiaques après son développement.

Cette technique a ouvert la voie en cardiologie cellulaire à l'étude des anomalies fonctionnelles des cardiomyocytes ventriculaires et à l'évaluation de l'utilité potentielle de nouvelles options thérapeutiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement de cardiomyocytes uniques viables à partir d'échantillons humains ainsi que de la caractérisation de la fonction cellulaire dans différentes conditions.