L'isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cardiomyocytes viables à partir d’échantillons ventriculaires humains de la maladie et de caractériser leurs altérations fonctionnelles. Pour ce faire, il suffit d’abord de collecter et d’émincer rapidement des échantillons ventriculaires frais dans une solution cardioplégique glacée afin d’éviter une dégradation excessive des tissus et des dommages cellulaires. La deuxième étape consiste à effectuer une digestion par étapes des morceaux myocardiques à l’aide d’un appareil de digestion sur mesure et de solutions enzymatiques.

En six cycles, la cellule contenant le tampon est recueillie dans un tube à chaque cycle et diluée avec une solution de préservation des cellules. La dernière étape consiste à remettre en suspension les cellules contenues dans les six tubes dans un volume inférieur de solution physiologique standard avec des concentrations normales de calcium afin d’effectuer la caractérisation fonctionnelle. En fin de compte, l’enregistrement par patch clamp des potentiels d’action et l’évaluation simultanée du calcium intercellulaire à l’aide de colorants fluorescents sont utilisés pour montrer les altérations de l’action, la durée potentielle et le cycle intracellulaire du calcium dans les cardiomyocytes de patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique.

Le principal avantage de DYS unique par rapport à une méthode 16, comme la méthode standard de déjection de morceaux, est que dans une association avec une solution enzymatique, nous utilisons un dispositif de digestion sur mesure, qui permet une articulation d’association de cytes variables grâce à ses raclures de silicium. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cardiologie, telles que la façon dont le remodelage moléculaire et structurel bien connu associé aux maladies cardiaques se traduit par une altération de cardiomyocytes uniques qui peuvent être analysés par notre méthode et ciblés par des médicaments spécifiques. Ainsi, l’implication de cette technique s’étend au traitement des maladies cardiaques génétiques telles que la cardiomyopathie hypertrophique.

En fait, cette méthode peut être utilisée pour tester de nouvelles approches neuropathiques sur des cardiomyocytes ventriculaires de patients atteints de maladies cardiaques hypertrophiques ou ischémiques qui ont subi une chirurgie cardiaque. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en comparant l’analogie entre les échantillons d’artère humaine et les biopsies ventriculaires obtenues lors d’une chirurgie cardiaque. Commencez cette procédure en versant 40 millilitres de solution cardioplégique dans un tube de 50 millilitres et stockez-la dans de la glace pour le transport des échantillons de la salle d’opération au laboratoire d’isolement cellulaire, transférez rapidement l’échantillon dans la zone du laboratoire et commencez le traitement des échantillons dans les 10 minutes suivant l’excision de l’échantillon.

Prélèvement collectif du myocarde ventriculaire suivant dans la salle d’opération immédiatement après l’excision. Lavez-le avec une solution CP glacée et rangez-le dans le tube tout en conservant l’échantillon dans un tampon CP glacé. Retirez ensuite avec précaution la couche fibrotique endocardique à l’aide de ciseaux fins.

Coupez le tissu myocardique en petits morceaux de deux à trois millimètres de long, la quantité totale de myocarde ventriculaire étant comprise entre 100 milligrammes et un gramme pour chaque isolement. Une fois les morceaux transférés dans la chambre de raclage du dispositif de digestion, changez le tampon CP dans la chambre avec un tampon de dissociation sans calcium froid. Placez ensuite l’appareil de digestion dans un bain thermostatique.

Réglez le bain à 37,5 degrés Celsius et allumez-le. Ensuite, allumez le moteur de l’appareil de digestion et réglez la vitesse de rotation sur un tour par seconde. Effectuez trois cycles de lavage avec DB et changez la solution dans la chambre avec 37 degrés Celsius saturés d’oxygène DB toutes les huit minutes.

Après cela, préparez le tampon enzymatique un en ajoutant 250 unités par millilitre de collagénase de type cinq et quatre unités par millilitre de protéase. Tapez 24 dans la solution de base de données. Préparez ensuite le tampon enzymatique deux en ajoutant 250 unités par millilitre de collagénase.

Tapez cinq dans la solution DB, oxygénez EB un et réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Effectuez ensuite deux cycles de digestion de 12 minutes dans l’appareil de digestion rotatif avec trois millilitres d’EB oxygéné à 100 %, un à 37 degrés Celsius. Retirer la solution par aspiration à la pipette et la jeter après chaque cycle.

Ensuite, préparez six tubes de 15 millilitres pour la collecte des cellules et 80 millilitres de solution d’infusion artisanale à quatre degrés Celsius pour échapper aux tampons, oxygénez EB deux et faites-le travailler jusqu’à 37 degrés Celsius. Par la suite, effectuez un premier cycle de digestion de 15 minutes avec trois millilitres d’EB 100 % oxygéné deux à 37 degrés Celsius. Après le cycle de digestion, prélever la solution contenant les premiers myocytes associés dans un tube de 15 millilitres et diluer la suspension cellulaire avec 12 millilitres de solution KB froide.

Conservez le tube à plat à température ambiante, effectuez cinq autres cycles de digestion de 12 minutes avec trois millilitres d’EB deux à 37 degrés Celsius et collectez le tampon contenant les myocytes à chaque cycle dans un tube conique de 15 millilitres. N’oubliez pas de diluer également le tampon collecté de trois millilitres avec 12 millilitres de solution KB à chaque cycle. À la fin, conservez les six cellules contenant les tubes à température ambiante.

Dans cette étape, ajoutez un milligramme par millilitre d’albumine sérique bovine à 20 millilitres de tampon tyro sans calcium. Ensuite, filtrez la solution puis centrifugez les six myocytes contenant des tubes coniques à 100 fromages pendant cinq minutes. Pour forcer les myocytes à se stabiliser, retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans chaque tube avec une quantité variable de BSA contenant de la TB à température ambiante.

Augmentez progressivement la concentration de calcium dans la cellule contenant le tampon en ajoutant de petits OTT de 100 millimolaires par litre de solution de chlorure de calcium dans les première et deuxième étapes. La concentration de calcium est portée à 50 micromolaires par litre et 100 micromolaires par litre respectivement. Les étapes d’ajout de calcium suivantes sont effectuées toutes les cinq minutes, et la concentration est augmentée de 100 micromolaires par litre à chaque étape jusqu’à une concentration finale de 0,9 millimolaire par litre.

Pour évaluer le rendement de la procédure d’isolement, transférez 0,5 millilitre de solution contenant des myocytes dans la chambre inférieure en verre d’un microscope. Évaluez 15 champs de microscope à un grossissement objectif de 10 x et calculez le pourcentage de myocytes sains tels que les cellules en forme de bâtonnet avec des stries claires et sans inclusions significatives. Les rendements attendus devraient être d’environ 20 % pour démontrer l’évaluation fonctionnelle des cardiomyocytes humains, y compris l’enregistrement simultané des potentiels d’action et des flux de calcium intracellulaires.

Tout d’abord, préparez la solution de pipette pour les expériences de patch clamp dans une configuration de patch perforé. Ajoutez ensuite 1,8 millimolaire de chlorure de calcium à la tuberculose sans calcium. Utilisez la solution pour la superfusion de cardiomyocytes pendant les expériences de fluorescence par patch clamp.

Ensuite, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 10 micromolaires par litre de flu fort et 10 microlitres de charge électrique. Concentré incubé pendant 30 minutes à température ambiante en position horizontale. Ensuite, placez le tube en position verticale et laissez les cellules se déstabiliser pendant cinq minutes.

Ensuite, pipetez le surnageant et mettez en suspension la pastille cellulaire dans du calcium contenant la tuberculose. Point de transfert de 25 millilitres de suspension de cellule dans une petite chambre d’enregistrement montée sur microscope à température contrôlée. Super fusionné par gravité avec un système de micro fuer chauffé à un débit de 0,3 millilitre par minute à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’un extracteur de micro-pipettes, préparez des pipettes patch clamp avec un diamètre de pointe de trois à cinq micromètres et une résistance de trois à 4,5 méga ohms lorsqu’elles sont remplies de ps. Après cela, ajoutez de l’amphotéricine B à PS à 250 microgrammes par millilitre et utilisez-la pour remplir les électrodes, puis montez l’électrode sur le porte-pipette. Ensuite, sélectionnez la cellule en forme de Ron avec des stries claires et dépourvue d’inclusions.

Formez le giga joint et attendez cinq à 10 minutes jusqu’à ce que la résistance d’accès descende en dessous de 20 ohms. Par la suite, ils déclenchent des potentiels d’action en mode de pince de courant à l’aide d’impulsions courtes à différentes fréquences de stimulation. Pendant la phase d’enregistrement, allumez l’éclairage en champ clair à 492 nanomètres et détectez la fluorescence fort Fluor à 505 à 520 nanomètres.

Acquérez ensuite les signaux de fluorescence et de potentiel membranaire. Cette figure montre les altérations des potentiels d’action dans les cardiomyocytes ventriculaires à partir des échantillons de CMH. Voici les potentiels d’action superposés représentatifs induits à 0,2 hertz, 0,5 hertz et un hertz à partir d’un myocyte témoin et d’un myocyte HCM.

Les potentiels d’action superposés à 0,5 hertz à partir d’un myocyte témoin. En l’absence et la présence de 10 à sept molaires, l’isoprotérénol est mis en évidence, et voici la trace représentative du potentiel membranaire d’un cardiomyocyte d’un patient atteint de CMH, qui a présenté plusieurs dépolarisations spontanées au début des dépolarisations. La figure montre les altérations du calcium transitoire dans les cardiomyocytes ventriculaires à partir des échantillons de CMH.

Voici les transitoires calciques représentatifs superposés provoqués lors de la stimulation à 0,2 hertz via la pipette patch dans un myocyte témoin et une cellule HCM. La cinétique des transitoires calciques dans les cardiomyocytes HCM et les cardiomyocytes témoins à différents moments est montrée, et voici les longues traces représentatives montrant le calcium intracellulaire pendant la stimulation à trois fréquences différentes, ce qui met en évidence l’augmentation du calcium diastolique à des taux de stimulation élevés dans le myocyte HCM. Cette figure montre les applications expérimentales supplémentaires utilisant des myocytes ventriculaires humains.

Les traces superposées représentatives montrant le courant calcique de type L enregistré à différentes tensions membranaires sont montrées à gauche, et la densité moyenne de pic de courant calcique de type L à partir de 18 cellules isolées d’échantillons HCM à différentes tensions membranaires est montrée à droite et ici est la trace de calcium intracellulaire enregistrée à partir d’un myocyte ventriculaire lors d’une stimulation du champ électrique à un hertz. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer la procédure peu de temps après le prélèvement de l’échantillon dans la salle d’opération afin d’assurer le suivi de cette procédure pour isoler les cardiomyocytes ventriculaires humains. D’autres méthodes peuvent être mises en œuvre comme la microscopie confocale du mode de vie ou l’immunochimie, ce qui sera crucial pour répondre à des questions fondamentales telles que, par exemple, comment la localisation subcellulaire des structures membranaires et des unités de libération de calcium est altérée dans les maladies cardiaques après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à la cardiologie cellulaire pour étudier les anomalies fonctionnelles des cardiomyocytes ventriculaires et pour tester l’utilité potentielle de nouvelles options thérapeutiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des cardiomyocytes uniques viables à partir d’échantillons humains et de la façon de caractériser la fonction cellulaire dans différentes conditions.