Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris
17 novembre 2023
Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.
Notre nouveau protocole permet de distinguer et de quantifier trois statuts des anneaux tubulaires, tels que les microtubules stables, les microtubules labiles et les tubules libres dans les tissus animaux. Cette technique est composée d’étapes simples et permet d’évaluer la stabilité structurelle des tubes, qui ne peut pas être détectée par la quantification des tubes après modification translationnelle. Cette méthode est essentielle pour la recherche et le développement de moyens thérapeutiques pour les maladies où la stabilité des microtubules est critique, comme la maladie d’Alzheimer et les cancers.
Commencez la procédure en préparant le vêtement de laboratoire pour la dissection tissulaire. Remplissez une boîte de glace pilée et placez-y deux boîtes de Pétri. Remplissez un plat avec une solution tampon de phosphate glacée ou PBS pour le lavage transitoire et le stockage des tissus disséqués.
Posez du papier filtre imbibé de PBS sur le deuxième plat. Ensuite, pesez les microtubes de 1,5 millilitre remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués. Après avoir extrait les tissus d’une souris euthanasiée, transférez-les dans les tubes et pesez à nouveau chaque microtube.
Déplacez les tissus dans un homogénéisateur en verre avec un tampon stabilisateur de microtubules glacé ou un milieu MSB+, et homogénéisez immédiatement le tissu à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré. Transférez maintenant l’homogénat tissulaire dans un microtube de deux millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 g pendant trois minutes à deux degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre pour éliminer les débris.
Vortex le surnageant ou la fraction S1 dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre. Pipeter immédiatement 200 microlitres de la fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifuger à 100 000 G à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 minutes à deux degrés Celsius. Après la deuxième centrifugation, séparez le surnageant S2 du précipité P2.
Transférez immédiatement la totalité de la fraction S2 dans un microtube de centrifugation et utilisez un rotor TLA-120.2 pour la faire tourner à 500 000 G pendant 60 minutes à deux degrés Celsius. Après la troisième centrifugation, séparez le surnageant S3 du précipité P3. Dissoudre toute la fraction S3 dans 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium 2X ou tampon d’échantillon SDS.
Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon SDS 2X pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon d’échantillon SDS dans les tubes de fraction P2 et P3. Ensuite, sonifiez brièvement la solution pour dissoudre le précipité avant de transférer les échantillons dans de nouveaux microtubes de 1,5 millilitre et de les placer dans la glacière.
Faites bouillir tous les échantillons à 100 degrés Celsius pendant trois minutes. Les microtubules de la fraction P2 représentaient 34,86 % de l’alpha-tubuline totale dans le cerveau d’une souris, tandis que ceux des fractions P3 et S3 représentaient respectivement 56,13 % et 9,01 %. Le pourcentage de bêta-3 tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 n’était pas significativement différent de celui de l’alpha-tubuline.
La fraction S2 a montré un passage limité de la tubuline à travers une colonne de spin d’ultrafiltration de 300 kilodaltons, tandis que la fraction S3 a permis un passage complet des complexes de tubuline. La séparation chromatographique a donné lieu à une élution de 100 kilodaltons de tubuline S3. Des proportions égales d’alpha et de bêta-tubuline ont été récupérées dans chaque fraction.
Les fractions P2 étaient significativement enrichies en alpha-tubuline acétylée, tandis que l’alpha-tubuline tyrosinée était dominante dans la fraction P3. La congélation du cerveau avant l’homogénéisation a entraîné une diminution de la concentration d’alpha-tubuline dans les fractions P2. Cependant, l’alpha-tubuline a augmenté dans la fraction P3.
La congélation a également diminué les niveaux d’acétylation et augmenté les niveaux de tyrosination de l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Le traitement au nocodazole a diminué l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Contrairement à la congélation, le nocodazole n’a pas affecté les modifications post-traductionnelles de la tubuline P2.
Le tissu cérébral présentait une concentration significativement plus élevée de tubulines P2, tandis que les tubulines P3 étaient concentrées dans le tissu prolifératif. Le transfert Western a montré que la tubuline P2 spécifiquement présente dans le système nerveux provenait de microtubules stables, et que la tubuline P3 provenait de microtubules labiles. La stabilité des microtubules est très dynamique.
Il est important de compléter ce protocole rapidement, sans interruption, dans un environnement à température froide. Assurez-vous également que les tissus et les fractions n’ont pas été congelés avant d’être dissous dans le tampon d’échantillon SDS. La combinaison de la présentation immunitaire à l’aide de chaque fraction et de la protéomique devrait permettre d’identifier les facteurs impliqués dans la dynamique des microtubules.
À l’aide de cette méthode, nous avons révélé comment la protéine tau normale existe sur les microtubules. Il peut également être utilisé pour étudier comment il devient anormal dans les cerveaux âgés afin d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses de la démence.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude présente un nouveau protocole permettant de distinguer et de quantifier les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus animaux. La méthode évalue la stabilité structurale des microtubules, ce qui est essentiel pour comprendre des maladies telles que la maladie d'Alzheimer et les cancers.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Dynamique des microtubules
Contexte
- Les microtubules sont des composants essentiels du cytosquelette des cellules eucaryotes.
- Ils présentent une instabilité dynamique, ce qui affecte les fonctions cellulaires.
- Comprendre la stabilité des microtubules est crucial pour le développement de thérapies.
- Des maladies comme la maladie d'Alzheimer et certains cancers sont associées à un dysfonctionnement des microtubules.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de fractionnement des microtubules dans les tissus de souris.
- Évaluer la stabilité des différents états des microtubules.
- Approfondir la compréhension des maladies liées aux microtubules.
Méthodes utilisées
- Préparation de la tenue de laboratoire pour la dissection des tissus.
- Utilisation d'une solution tampon phosphate glacée pour la manipulation des tissus.
- Fractionnement des microtubules en tubuline stable, labile et libre.
- Quantification de la stabilité des microtubules au moyen du nouveau protocole.
Résultats principaux
- Le protocole distingue efficacement les microtubules stables des microtubules labiles.
- La quantification permet d'obtenir des informations sur la stabilité des microtubules dans différents tissus.
- La méthode est simple et reproductible pour une utilisation en laboratoire.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la dynamique des microtubules dans les contextes pathologiques.
Conclusions
- Ce nouveau protocole constitue un outil précieux pour les chercheurs qui étudient la stabilité des microtubules.
- Il présente des applications potentielles dans la compréhension et le traitement des maladies liées au dysfonctionnement des microtubules.
- Des recherches ultérieures pourront s'appuyer sur ces découvertes afin d'explorer des pistes thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'évaluation précise de la stabilité des microtubules est essentielle pour analyser les mécanismes thérapeutiques dans les maladies neurodégénératives et les cancers, où la dynamique du cytosquelette influence la réponse aux médicaments. Cette technique de fractionnement permet une quantification directe des pools de tubuline stables, labiles et libres dans des tissus natifs, fournissant une lecture biochimique qui complète les analyses d'imagerie et les dosages spécifiques aux modifications. En distinguant les états fonctionnels des microtubules, la méthode soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes précoces de découverte axés sur des agents modulant les microtubules.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier une hypothèse thérapeutique en quantifiant les modifications des populations de microtubules stables par rapport aux microtubules labiles en réponse à un traitement par un composé.
- Valeur opérationnelle : Fournit un test biochimique basé sur les tissus afin de valider l'interaction avec la cible des agents stabilisateurs ou déstabilisateurs des microtubules.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en corrélant la stabilisation biochimique des microtubules avec des résultats fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des données quantitatives de fractionnement de la tubuline adaptées à un criblage à haut débit de bibliothèques de composés ciblant la dynamique des microtubules.
- Reproductibilité : Utilise des étapes standardisées de centrifugation ultracentrifuge pour obtenir une séparation constante des fractions de microtubules entre les expériences.
- Extensibilité : Compatible avec le western blot et les analyses protéomiques complémentaires afin d'identifier les régulateurs de la stabilité des microtubules à partir de pools de tubuline fractionnés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Détecte les variations spécifiques aux tissus de la stabilité des microtubules corrélées à la capacité proliférative, permettant la stratification des modèles précliniques.
- Continuité translationnelle : Relie les états biochimiques des microtubules à des signatures de modifications post-traductionnelles (par exemple, acétylation dans les pools stables, tyrosination dans les pools labiles) afin d'aligner les biomarqueurs.
- Progression ajustée au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller en fournissant des métriques quantitatives de stabilité qui prédisent l'indice thérapeutique dans les programmes ciblant les microtubules.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'optimisation du composé précurseur, où la stabilité des microtubules sert de biomarqueur pharmacodynamique pour confirmer le mécanisme d'action.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses en mesurant les modifications induites par des composés sur les états de polymérisation des microtubules dans des lysats tissulaires natifs.
- Criblage : Facilite la standardisation des tests grâce à des seuils de sédimentation définis (100 000 × g pour les microtubules stables, 500 000 × g pour les microtubules labiles), assurant une fractionnement reproductible.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la tubuline par immunotransfert des fractions P2 (stable), P3 (labile) et S3 (tubuline libre) afin de comparer les effets des composés.
- Recherche translationnelle : Corrèle les données de fractionnement des microtubules avec les profils d'expression tissu-spécifiques et les motifs de modifications pour une validation préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme biochimique réutilisable pour évaluer des composés ciblant les microtubules dans diverses pathologies et types de tissus.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en mesurant directement les états de polymérisation des microtubules, plutôt que de s'appuyer uniquement sur les modifications post-traductionnelles.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des paramètres de centrifugation standardisés et à un traitement contrôlé en température afin de préserver l'intégrité des microtubules.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant une validation orthogonale du mécanisme ciblant les microtubules, allant au-delà des tests cellulaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une hiérarchisation des composés ajustée au risque, fondée sur leur efficacité quantitative en matière de stabilisation dans des tissus pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en homogénéisation des tissus et en ultracentrifugation afin de maintenir la stabilité des microtubules pendant le traitement.
- Dépend de l'accès à des rotors à grande vitesse (TLA-55 et TLA-120.2) capables d'atteindre 100 000 × g et 500 000 × g pour la séparation des fractions.
- Exige une standardisation interéquipes du moment et de la température de fractionnement afin d'assurer des résultats reproductibles entre laboratoires.
- Implique une adaptation de la composition du tampon et des paramètres de centrifugation lors de l'application de la méthode à des tissus non neuronaux présentant des densités de microtubules différentes.
- Est limitée par la nécessité d'un traitement immédiat afin d'éviter une dépolymérisation artificielle des microtubules pendant la manipulation des échantillons.
