Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir le plus grand nombre d’identifications de protéines à partir de l’épithélium sensoriel cochléaire en utilisant diverses techniques protéomiques. Ceci est réalisé en isolant la cochlée, l’épithélium sensoriel de souris adultes et le sonicate dans le tampon de lyse pour obtenir la protéine dans un deuxième temps. Différentes stratégies de digestion sont appliquées au lysat entier ou au lysat de protéines fractionné afin d’améliorer la couverture des séquences peptidiques et protéiques.

Ensuite, différentes techniques de séparation sont utilisées, notamment un fort échange de cations et la chromatographie en phase inverse pour réduire la complexité de l’échantillon avant l’analyse des spécifications de masse. Les résultats montrent l’identification d’un grand nombre de protéines membranaires et solubles pour l’épithélium sensoriel de la cochlée de souris en utilisant plusieurs approches protéomiques et un spectromètre de masse à haute résolution. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les microréseaux d’anticorps et l’électrophorèse sur gel bidimensionnel est qu’un grand nombre de protéines solubles et membranaires sont identifiées, augmentant ainsi les données du protéome cochléaire.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des biomarqueurs liés aux troubles de l’audition et des déchirures, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’identification de biomarqueurs liés à l’âge et au cancer du sein ou du poumon. Cette méthode peut également être appliquée à l’étude d’autres échantillons biologiques tels que le sang. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons observé l’ensemble limité de données protéomiques disponibles à partir de l’oreille interne des mammifères, et en particulier, le nombre limité de protéines membranaires qui ont été identifiées avant de commencer cette procédure.

Isolez l’épithélium sensoriel cochléaire chez des souris du 30e jour postnatal. Après avoir lavé le tissu avec un tampon x phosphate, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse au tissu et sonicez le mélange pendant 30 secondes sur de la glace à l’aide d’un démembrement sonique. Refroidissez le lysat sur de la glace pendant une minute entre chaque sonication, puis sonisez l’échantillon trois fois au total.

Centra a fait fondre la suspension à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois terminé, conservez le surnageant pour la digestion. Ensuite, ajoutez une aliquote de 30 microlitres d’extrait de protéine cochléaire directement dans un filtre à spin de 30 K et mélangez avec 200 microlitres d’urée à huit molaires dans la centrifugeuse Riss HCL.

Le mélange à 14 000 fois G pendant 15 minutes. Une fois terminé, diluez le concentré avec 200 microlitres de solution d’urée à huit molaires et répétez la centrifugation dans les mêmes conditions que précédemment. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de 10 XI oto acétamide et 90 microlitres de solution d’urée à huit molaires au concentré dans le filtre et vortex pendant une minute.

Après avoir placé le filtre de spin dans un rack de micro-centrifugeuse, incuber pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité après centrifugation à 14 000 fois G pendant 10 minutes à 0,1 microgramme par microlitre d’endoprotéase C dans un rapport enzyme/protéine de un à 50, et incuber le mélange pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Une fois terminé, ajoutez 40 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires dans l’unité de filtration et centrifugez le mélange à 14 000 fois G pendant 10 minutes Après avoir répété l’étape précédente, lavez l’unité de filtration avec 40 microlitres d’urée de huit molaires. Ensuite, lavez l’unité de filtration deux fois avec 40 microlitres d’eau milli Q.

Une fois que l’unité de filtration a été lavée trois fois avec 100 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, ajoutez 0,4 microgramme par microlitre de trypsine dans un rapport enzyme/protéine de un à 100, et incubez le mélange pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, éluer les peptides triptiques en ajoutant 40 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires dans l’unité de filtration et centrifuger le mélange à 14 000 fois G pendant 10 minutes. Répétez ensuite cette étape une fois de plus.

À ce stade, injectez 50 à 100 microgrammes d’échantillon de protéines digérées dans une colonne d’échange cationique de 200 x 2,1 millimètres et de cinq micromètres pour séparer les peptides, surveillez les fractions peptidiques à 280 nanomètres et collectez les fractions à intervalles de deux minutes. À l’aide d’un collecteur de fractions, puis séchez les fractions dans un concentrateur sous vide. Une fois terminé, conservez les fractions séchées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées pour la chromatographie liquide.

Analyse par spectrométrie de masse en tandem. Dans une autre approche, le fractionnement sans gel a été utilisé pour séparer le mélange de protéines. Une fois que le surnageant de la protéine cochléaire a été dessalé par précipitation d’acétone, ajoutez 30 microlitres de tampon de cinq x échantillon à la protéine dessalée précédemment suspendue dans 112 microlitres d’eau Milli Q.

Ensuite, ajoutez huit microlitres d’une molaire de DTT et chauffez le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour réduire les liaisons disulfure de protéines. Après avoir chauffé, laissez refroidir le mélange. Ajoutez huit millilitres de tampon de fonctionnement dans le réservoir d’anode, 150 microlitres de tampon de fonctionnement dans la chambre de collecte d’échantillons et six millilitres de tampon de courant dans le réservoir de cathode.

Après cette charge, 150 microlitres du mélange de protéines cochléaires dans la chambre de chargement de l’échantillon, à l’aide d’une cartouche d’acétate tris à 8 % d’une masse de 3,5 à 150 kilodaltons. Après avoir commencé le cycle, prélevez l’échantillon dans la chambre de collecte d’échantillons à chaque intervalle de pause sur l’instrument à l’aide d’une pipette et ajoutez-le dans un microtube fraîchement étiqueté. Ensuite, lavez la chambre de collecte deux fois avec 150 microlitres de tampon de coulée et jetez-la.

Suite à l’électrophorèse sur gel 1D des fractions sans gel. Ajoutez chaque fraction individuelle directement dans une unité de filtration de 30 K. Ensuite, mélangez chaque fraction avec 200 microlitres d’urée à huit molaires dans du tris HCL après centrifugation à 14 000 fois G pendant 25 minutes, ajoutez 10 microlitres de 10 XI oto acétamide dans une solution d’urée au concentré dans chaque unité de filtration et vortex pendant une minute.

Après avoir placé les filtres de spin dans un rack de micro-centrifugeuse, incubez les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez 0,1 microgramme par microlitre de LY C pour un rapport enzyme/protéine de un à 50 aux unités de filtration après une nuit d’incubation à 30 degrés Celsius, ajoutez 40 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires aux filtres de spin et centrifugez les échantillons à 14 000 fois G pendant 10 minutes après avoir répété une fois l’étape précédente, Lavez les filtres d’essorage trois fois avec 100 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, ajoutez 0,4 microgramme par microlitre de trypsine dans un rapport enzyme/protéine de un à 100 après le lavage final. Une fois que les échantillons ont été incubés pendant la nuit à 37 degrés Celsius, éluez les peptides triptyques de chaque unité de filtration en ajoutant 40 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires et centrifugez les échantillons à 14 000 fois G pendant 10 minutes.

Après avoir répété cette opération, une première étape, analysez les échantillons par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem. Deux procédures de double digestion ont été utilisées. La première était une digestion triptyque, suivie d’une seconde digestion avec de la trypsine, qui ont été regroupées fractionnées sur une colonne d’échange de cations forte en 18 fractions, et analysées par nanochromatographie liquide en tandem spectrométrie de masse.

Au total, 1 485 protéines ont été identifiées avec un FDR de 1 % lors de la réalisation d’une spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide en une seule fois. En utilisant cette approche expérimentale. Parmi les protéines identifiées, 324 et 258 protéines ont été classées respectivement dans la mitochondrie et la membrane plasmique.

La deuxième procédure de double digestion consistait en une digestion au lys C, suivie d’une digestion à la trypsine. Chaque digestion a été chargée individuellement et séparée sur la colonne d’échange de cations forts en 18 fractions, puis analysée par chromatographie nano-liquide par spectrométrie de masse en tandem. Les résultats des digestions du LY-C et de la trypsine ont produit un total de 3 503 protéines avec un FDR de 1 %.

De plus, les protéines 605 et 617 ont été classées respectivement dans la mitochondrie et la membrane plasmique. Cette approche a fourni le plus grand nombre d’identifications de protéines associées à la membrane. Analyse en double du LY C et de la trypsine.

Les fractions ont montré que plus de 65 des protéines identifiées étaient partagées entre les expériences. Cependant, de nouvelles protéines ont également été identifiées dans l’analyse des réplications. Les peptides et protéines supplémentaires ont été identifiés en raison de petits changements dans la chromatographie, conduisant ainsi à différents peptides pour la fragmentation.

Un gel colorant à l’argent a été préparé pour visualiser les résultats du fractionnement sans gel, comme illustré. Ici, le gel a montré la séparation des protéines en augmentant le poids moléculaire pour chaque fraction consécutive. Par conséquent, les 12 fractions liquides sans gel ont été digérées à l’aide de deux approches de digestion multifacettes différentes et analysées par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem.

La première approche de digestion a été réalisée à l’aide d’une double digestion à la trypsine, ce qui a permis d’identifier 2 165 protéines avec un FDR de 1 % lors de la réalisation d’une chromatographie en phase liquide en une seule fois, spectrométrie de masse en tandem. Dans cette expérience, 516 et 399 protéines ont été classées respectivement dans la mitochondrie et la membrane plasmique. La deuxième approche de digestion a été réalisée à l’aide de l’endoprotéinase C suivie d’une digestion à la trypsine, chromatographie liquide en une seule fois.

L’analyse par spectrométrie de masse en tandem a permis d’identifier 2 211 protéines avec un FDR de 1 %. Cette approche a montré un nombre similaire de protéines associées à la membrane, car lors de l’utilisation de l’approche trypsine-trypsine, les données protéomiques de spectrométrie de masse ont été déposées au Proteome Exchange Consortium avec l’identifiant de l’ensemble de données PXD 0 0 0 2 3 1. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la contamination à chaque étape et de garder les tissus sur la glace lors de l’extraction des protéines pour éviter la dégradation des protéines.